Đang tải... (xem toàn văn)
MỤC LỤCiCHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ1CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU22.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC22.1.1. Mô tả thực vật32.1.2. Phân bố, sinh thái32.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC32.3. CÔNG DỤNG82.4. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÁC NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG82.6. CÁC CHẾ PHẨM CÓ CHỨA DIẾP CÁ TRÊN THỊ TRƯỜNG112.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH FLAVONOID112.7.1. Sắc ký lớp mỏng112.7.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong phân tích flavonoid13CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM143.1. QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO DIẾP CÁ143.2. QUY TRÌNH PHÂN LẬP FLAVONOID TRONG CAO DIẾP CÁ143.2.1. Phương pháp sắc ký cột143.2.1.1. Phân tách các phân đoạn bằng phân bố lỏnglỏng143.2.1.2. Phân lập flavonoid từ cao A2 bằng SKC chân không163.2.2. Phương pháp HPLC điều chế223.2.2.1. Lựa chọn pha tĩnh223.2.2.2. Lựa chọn phương pháp223.2.2.3. Sự lựa chọn dung môi233.2.2.4. Điều kiện HPLC điều chế quercetin24CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ NHẬN ĐỊNH254.1. KẾT LUẬN254.2. NHẬN ĐỊNH25TÀI LIỆU THAM KHẢO26
MỤC LỤC MỤC LỤC i CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 2.1.1 Mô tả thực vật 2.1.2 Phân bố, sinh thái 2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 2.3 CÔNG DỤNG 2.4 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÁC NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG 2.6 CÁC CHẾ PHẨM CÓ CHỨA DIẾP CÁ TRÊN THỊ TRƯỜNG 11 2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH FLAVONOID 11 2.7.1 Sắc ký lớp mỏng 11 2.7.2 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phân tích flavonoid .13 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM .14 3.1 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO DIẾP CÁ .14 3.2 QUY TRÌNH PHÂN LẬP FLAVONOID TRONG CAO DIẾP CÁ 14 3.2.1 Phương pháp sắc ký cột .14 3.2.1.1 Phân tách phân đoạn phân bố lỏng-lỏng 14 3.2.1.2 Phân lập flavonoid từ cao A2 SKC chân không 16 Kết quả: Hệ butyl acetat-nước(15:5) có khả tách tốt, Rf thích hợp nên được dùng để tiến hành triển khai sắc ký cột chân không Tuy nhiên không có mặt acid formic nên vết tách kéo đuôi, đó silica gel được tẩm 5% acid formic để vết tách gọn 16 3.2.2 Phương pháp HPLC điều chế .22 3.2.2.1 Lựa chọn pha tĩnh 22 3.2.2.2 Lựa chọn phương pháp 22 3.2.2.3 Sự lựa chọn dung môi 23 i 3.2.2.4 Điều kiện HPLC điều chế quercetin 23 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ NHẬN ĐỊNH .25 4.1 KẾT LUẬN 25 4.2 NHẬN ĐỊNH .25 TÀI LIỆU THAM KHẢO .26 ii Đặt vấn đề CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ Từ thời xa xưa ông cha ta biết sử dụng và bào chế phương thuốc y học cổ truyền từ dược liệu có nguồn gốc tự nhiên Ngày cùng với phát triển kỹ thuật đại và tiên tiến, nhiều loại thuốc được đời Nhờ phát triển hóa học và dược học, số hoạt chất có dược liệu thảo mộc được phân lập, tinh chế, xác định cấu trúc hóa học, tác dụng dược lý và sử dụng dạng tinh khiết Tuy nhiên, thuốc có nguồn gốc hóa dược, ngoài ưu điểm bật hiệu điều trị cao, dễ sản xuất, dễ sử dụng và bảo quản, vấn đề hạn chế lớn cần phải quan tâm là tác dụng phụ và độc tính kèm theo, đặc biệt trường hợp điều trị lâu dài bệnh mãn tính Vì ngày người ta có xu hướng trở với tự nhiên Đất nước Việt Nam ta với nguồn tài nguyên dược liệu dồi dào, phong phú là thuận lợi việc nghiên cứu và điều chế loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên để phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe người Với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, nước ta được xem là mảnh đất màu mỡ cho phát triển chủng loại cỏ, đó có không loại được sử dụng làm thuốc hiệu Có loại dược liệu thảo mộc hết sức thông dụng dân gian, lại được nhà khoa học chứng minh là có tác dụng trị liệu không thua so với loại thuốc tân dược Điển hình là Diếp cá, được công nhận là có khả trị ho, mụn nhọt, áp xe phổi, giải độc gan, chống oxy hóa, đặc biệt là chữa bệnh trĩ hiệu [9] Chính vậy, bài báo cáo này đưa thông tin Diếp cá, kỹ thuật chiết xuất và phân lập flavonoid từ Diếp cá phạm vi mà chúng em tìm hiểu được, để làm sáng tỏ thông tin dược liệu này Đặt vấn đề CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC Cây Diếp cá có tên là Giấp cá, Lá giấp, Ngư tinh thảo Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb Saururaceae, để tôn vinh Marteen Houttuyn là thầy thuốc nhà thực vật học Hà Lan, chuyên Rêu và Quyết thực vật Tên tiếng Anh nó là heartleaf (lá hình tim) hay lizardtail (đuôi thằn lằn) [4], [9], [15] Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae) Bộ Hồ tiêu (Piperales) Họ Lá giấp (Saururaceae) Chi Diếp cá (Houttuynia Thunb.) Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) Sơ đồ 2.1 Phân loại khoa học Diếp cá Đặt vấn đề 2.1.1 Mô tả thực vật Diếp cá là loại thảo, sống lâu năm, có thân rễ mọc ngầm đất Phần thân mặt đất cao 15-50 cm, màu lục tím đỏ Lá mọc so le Cuống dài Phiến hình tim dài 4-6 cm, rộng 3-4 cm, có 5-7 gân gốc [2], [6], [11] Hoa nở vào tháng – Cụm hoa hình dài 2,5 cm bao bắc màu trắng, chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt Trông toàn bề ngoài cụm hoa và bắc giống hoa đơn độc Quả nang mở đỉnh; hạt hình trái xoan, nhẵn [4] Hình 2.1 Lá và hoa Diếp cá 2.1.2 Phân bố, sinh thái Phân bố từ Nhật Bản, Trung Quốc tới Nêpan, Ấn Độ, nước Đông Dương và Indonesia Ở nước ta, mọc phổ biến Thường gặp mọc hoang nơi ẩm ướt bãi ven suối, bờ sông Cũng thường được trồng làm rau ăn và làm thuốc [15] 2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC Thành phần hóa học Diếp cá gồm có: flavonoid, tinh dầu, alkaloid và số thành phần khác [1], [13] *Flavonoid Đặt vấn đề Diếp cá có chứa thành phần flavonoid hết sức phong phú Các flavonoid đáng ý Diếp cá có thể kể đến quercetin, quercitrin, isoquercitrin [1], [10], [12], [32] Ngoài ra, có số flavonoid khác không phần quan trọng: - quercetin-3-O-β-D-galactosid-7-O-β-D-glucosid - quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosid - kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranosid - phloretin-2’-O-β-D-glucopyranosid (phloridzin) - quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid (avicularin) - quercetin-3-O- β-D-galactopyranosid (hyperin) O O H H O H O O O H H O O H O H O O H H quercetin O H phloretin H O O H O O O O O H H O O O O H H O O H O O H H O O O O H O O H quercitrin H H O O H isoquercitrin Đặt vấn đề H O H O O H O O O H O O H H O O H O O O O O O H avicularin O H H O O O H H O O O O H O O H H O O O H O O O H H phloridzin O O H O O O H H H O O O O H O H H hyperin H H O O H O O H O O H O H O H H quercetin-3-O-β-D-galactosid-7-O-β-D-glucosid Hình 2.2 Thành phần flavonoid Diếp cá *Tinh dầu Thành phần chủ yếu tinh dầu Diếp cá là nhóm aldehyd và dẫn xuất ceton methyl n-nonyl ceton (đây là chất làm cho Diếp cá vò có mùi tanh), L-decanal, L-dodecanal Nhóm terpen bao gồm chất: α-pinen, camphen, myrcen, limonen, linalol, bornyl acetat, geraniol and caryophylen Ngoài ra, tinh dầu chứa acid caprinic, lauryl aldehyd, benzamid, acid hexadecanoic, acid decanoic, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic, aldehyd capric, acid clorogenic, lipid và vitamin K [10] Một số công bố gần cho thấy thành phần và hàm lượng tinh dầu Diếp cá khác tuỳ theo nguồn gốc và trình phơi sấy khô: Đặt vấn đề - Tinh dầu Diếp cá khô mọc miền Bắc Việt Nam có 31 hợp chất, đó có hợp chất chiếm thành phần chủ yếu gồm β-pinen (3,15%), 2-undecanon (15,15%), propen 1-methoxy-2 methyl (12,12%), 1R-α-pinen (11,03%) Tinh dầu Diếp cá tươi có 34 thành phần, và hàm lượng tinh dầu Diếp cá tươi gấp 4,3 lần hàm lượng tinh dầu Diếp cá khô [7] - Tinh dầu Diếp cá mọc miền Nam có 19 hợp chất đó thành phần chủ yếu là 2(10) – pinen, (1S, 5S)-(-) (82,84%); ocimen (6,15%); keton methyl nonyl (6,44%) [5] - Diếp cá tươi mọc Trung Quốc có 38 thành phần, đó thành phần tinh dầu Diếp cá khô có 22 hợp chất: β-mycen (3,47%), L-nonanol (6,21%), αterpineol (13,24%), methyl nonyl keton (35,2%), bornyl acetat (5,52%), n-decanoic acid (10,58%), caryophyllen (3,41%), docosanoic acid ethyl ester (5,34%) [13] *Alkaloid Một số alkaloid có hoạt tính sinh học được tìm thấy Diếp cá là: aristolactam A, aristolactam B, piperolactam A, norcepharadion B, cepharadion A, cepharadion B, splendidin [15] O O O N O H O N H O O aristolactam A aristolactam B Đặt vấn đề O O N O O H O H N O piperolactam A H norcepharadion B O H O O N O O H H O O O H N O cepharadion A H cepharadion B O H H O H N O O splendidin Hình 2.3 Thành phần alkaloid Diếp cá Đặt vấn đề *Các thành phần khác Trong Diếp cá có nhiều thành phần là: nước 91,5%, protid 2,9%, lipid 0,5%, cellulose 1,8%, dẫn xuất không protein 2,2%, khoáng chất toàn phần 1,1% (trong đó có calcium, kali, caroten và vitamin C) [7], [8] Người ta tìm thấy thành phần Diếp cá có chứa Fe, Mg, Mn, là khoáng chất cần thiết cho thể [13] 2.3 CÔNG DỤNG Rau Diếp cá là loại rau quen thuộc bữa ăn hàng ngày người Việt Nam Ngoài công dụng được xem vị rau ngon, Diếp cá có nhiều công dụng khác Theo Đông y, Diếp cá có vị đắng, tính ôn, tác dụng vào kinh mạch Đại tràng và Phế, có tác dụng: - Giải nhiệt và giải độc, làm giảm sưng viêm, trị ung nhọt trường hợp ung nơi phổi, hỏa vượng Phế với đờm dày đặc màu vàng xanh, trị ho máu - Giải độc ung nhọt ngoài da, chữa vết thương rắn cắn hay côn trùng cắn - Làm thông thoát khí ứ đọng, giúp tiêu hóa tốt và lợi tiểu - Đặc biệt tác dụng chữa bệnh trĩ hiệu quả, có khả bảo vệ làm bền thành mao mạch [13] 2.4 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÁC NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG *Tác dụng kháng khuẩn Diếp cá có khả chống lại Herpes type I và II Trong đó khả chống lại Herpes type II mạnh so với type I Ngoài Diếp cá có tác dụng ngăn cản sinh sản vi khuẩn Streptococcus pneumonia (gây sưng phổi) và Staphylococcus aureus (gây mụn nhọt có mủ) Đặt vấn đề H2SO4 đặc Sắt (III) clorid MeOH Sắt (III) clorid + Fericyanua K (1:1) dung dịch nước AlCl3 2% MeOH soi UV 365 nm NaOH MeOH 1% phát hầu hết flavonoid 2.7.2 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phân tích flavonoid Các điều kiện thường dùng phân tích hợp chất flavonoid Flavonoid là hợp chất phân cực đó áp dung kỹ thuật HPLC phân tích flavonoid người ta thường dùng cột pha đảo C 18 và dung môi phân cực làm pha động, phát với detector DAD, UV-vis Các loại cột C18 thường dùng phân tích flavonoid: BDS 250 x 4,6 mm id, µm XDR 150 x 5,6 mm id, µm Waters Hypersil 100 150 x mm id, µm Nucleosil 100 150 x mm id, µm X-terra 150 x 3,9 mm id, µm Chromolith® 150 x 4,6 mm id Các pha động thường dùng phân tích flavonoid: Acid citric 0,6%/H2O-acetonitril-isopropanol (100:47:5) Isopropanol-THF (65:25) (A)-acetonitril (B)-H3PO4 0,5%/H2O (C) Acetonitril-H2O tỷ lệ thay đổi MeOH-acid acetic-H2O (30:1:70) MeOH-acetonitril-đệm phosphat pH = 3,0 (20:10:70) Với detector DAD thường phát flavonoid bước sóng từ 250-370 nm 13 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 3.1 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO DIẾP CÁ Bột Diếp cá (6 kg) được làm ẩm với cồn 96% giờ, nạp vào bình ngấm kiệt, thêm cồn vào bình chiết, ngâm 12 Rút dịch chiết tốc độ 10 – 12 giọt/phút cho đến dịch chiết nhạt màu, gộp toàn dịch chiết cồn, cô thu hồi dung môi áp suất giảm được dịch chiết đậm đặc (ký hiệu A) 3.2 QUY TRÌNH PHÂN LẬP FLAVONOID TRONG CAO DIẾP CÁ 3.2.1 Phương pháp sắc ký cột 3.2.1.1 Phân tách phân đoạn phân bố lỏng-lỏng Dịch A (mục 3.1.1.) được pha loãng với lít nước, lắc phân bố với CHCl đến dịch CHCl3 không cho màu xanh nhạt với TT FeCl 5%, dịch CHCl3 được rửa nước nhiều lần, gộp dịch CHCl3, cô thu hồi dung môi được cao A1 (12 g) Dịch A lại được lắc phân bố với ethyl acetat đến dịch ethyl acetat không cho màu xanh rêu đậm với TT FeCl 5%, rửa dịch ethyl acetat với 100 ml nước cất, gộp dịch ethyl acetat, cô thu hồi dung môi được cao lỏng A2 (54 g) A2 được dùng làm mẫu để phân lập flavonoid sắc ký cột nhanh (VLC) Dịch A lại tiếp tục được lắc phân bố với n-butanol đến dịch n-butanol không cho màu xanh đen với TT FeCl 5% Dịch n-butanol thu được, rửa nước nhiều lần, gộp dịch n-butanol, cô thu hồi dung môi được cao A3 (7 g) Dược liệu (6 kg) Ngấm kiệt cồn 96% Dịch chiết cồn Cô thu hồi dung môi Dịch A đậm đặc + CHCl3 Dịch CHCl3 Dịch A lại Cô thu hồi dung môi + EtOAc Cao A1 (12 g) Dịch A lại Dịch EtOAc Cô thu hồi dung môi + n-BuOH Cao A2 (54 g) Dịch A lại Dịch n-BuOH Cô thu hồi dung môi Cao A3 (7 g) Sơ đồ 3.1 Chiết xuất phân tách phân đoạn Định tính flavonoid cao A1, A2, A3 phản ứng cyanidin và sắc ký lớp mỏng Kết quả: phân đoạn - cao A2 giàu flavonoid so với phân đoạn và phân đoạn 3, đó A2 được dùng để phân lập flavonoid sắc ký cột 3.2.1.2 Phân lập flavonoid từ cao A2 SKC chân không a Thăm dò hệ dung môi sắc ký lớp mỏng Khảo sát số hệ dung môi, tiến hành thăm dò sắc ký lớp mỏng tráng sẵn (silica gel F254), phát TT FeCl3 5%, TT vanilin-sulfuric, soi UV 254 nm, UV 365 nm và thu được kết sau: STT Hệ dung môi Khả tách Butyl acetat-acid formic (15:1) ++ Ethyl acetat + Ethyl acetat-MeOH-nước (10:0,5:1) ++ n-BuOH-ethyl acetat-nước (6:2:0,5) + Ethyl acetat-aceton-nước (8:1,8:0,2) +++ Cloroform-ethyl acetat (2:8) + Butyl acetat-aceton (30:1) + Cloroform-aceton (8:2) ++ Butyl acetat-nước-acid formic (15:5:5) ++++ 10 Butyl acetat-nước (15:5) +++ Kết quả: Hệ butyl acetat-nước(15:5) có khả tách tốt, R f thích hợp nên được dùng để tiến hành triển khai sắc ký cột chân không Tuy nhiên không có mặt acid formic nên vết tách kéo đuôi, đó silica gel được tẩm 5% acid formic để vết tách gọn b Phân lập flavonoid sắc ký cột chân không (Cột 1) Điều kiện sắc ky Cột thủy tinh xốp x 30 cm, xử lí sulfocromic, rửa sạch, sấy khô Pha tĩnh: Silica gel 60, cỡ hạt 0,015-0,04 mm, khối lượng 150 g, được tẩm với ml acid formic, lắc đều, sấy 120oC/2 hộp kín Pha động: Butyl acetat – nước (15:5) Nhồi cột: Nhồi cột khô, sau đó cho 150 ml pha động chảy qua cột, hút chân không đến không dung môi Khối lượng mẫu: 25g cao A2 Nạp mẫu dạng dung dịch Mẫu được nạp lên bề mặt silica gel, hút chân không đến mẫu thấm hết xuống silica gel, sau đó tiến hành hứng phân đoạn Thể tích hứng phân đoạn là: 150 ml Kiểm tra phân đoạn bảng sắc ký lớp mỏng tráng sẵn với hệ dung môi butyl acetat – nước – acid formic (15:5:5), phát ánh sáng thường, UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử FeCl3 5% Kết quả: thu được phân đoạn được ghi nhận bảng sau: Phân đoạn V (ml) P (g) Thành phần B C D 450 1,1 1200 3,7 E F H 3300 4,2 F H I J 750 2,3 G H I J 2400 11,6 H I J Bảng 3.1 Kết phân lập flavonoid dung môi butyl acetat-nước (15:5) A B C D E F G H I J TP Sơ đồ 3.1 Phân bố phân đoạn của cột Nhận xét: Phân đoạn (1,1 g) được kết tinh methanol thu được tinh thể tinh khiết màu vàng chanh, đặt tên là DC1 (34 mg) Tinh thể được kiểm tra sắc ký lớp mỏng qua hệ dung môi khác ethyl acetat-nước-acid formic-acid acetic (100:10:5:5), EtOAc-aceton-H2O (4:5,5:0,5), CHCl3-HCOOH-CH3COOH (6:2:0,5), butyl acetat-nước-acid formic (15:5:5) (Hình 10, 11, 12, 13), phát TT vanilinsulfuric, TT FeCl3, soi UV 365 nm, UV 254 nm Phân đoạn (3,7 g) có vết phát quang màu tím đèn UV 365 nm và cho màu xanh đen với TT FeCl 3, đó có vết chiếm lượng lớn, tiến hành kết tinh phân đoạn này nhiều lần methanol cách hòa tan hoàn toàn phân đoạn này lượng vừa đủ methanol, lọc qua phễu thủy tinh xốp Dịch lọc được để vào tủ lạnh, cho bay dung môi từ từ, lọc và rửa tinh thể methanol lạnh Tinh thể được kiểm tra sắc ký lớp mỏng qua hệ dung môi khác EtOAcH2O-HCOOH-CH3COOH (100:10:5:5), EtOAc-aceton-H2O (4:5,5:0,5), CHCl3HCOOH-CH3COOH (6:2:0,5), BuOAc-H2O-HCOOH (15:5:5) (Hình 10, 11, 12, 13), phát TT vanilin-sulfuric, TT FeCl 3, soi UV 365 nm, UV 254 nm, tinh thể thu được màu vàng tươi đặt tên là DC2 (450 mg) Phân đoạn (2,3 g) và phân đoạn (11,6 g) giống nên gộp chung, tiến hành kết tinh phân đoạn này methanol không thu được tinh thể, cô thu hồi dung môi phân đoạn, kiểm tra sắc ký lớp mỏng nhận thấy vết G bị phân huỷ thành vết là G và G’ (có thể là có mặt acid formic) Do đó để phân lập được chất G cần phải khảo sát lại hệ dung môi khai triển mà không có mặt acid Các phân đoạn lại khối lượng và có nhiều vết nên không tiếp tục nghiên cứu Phân đoạn Chất tinh khiết Đặc điểm Khối lượng (mg) DC1 Vàng chanh 34 DC2 Vàng tươi 450 Bảng 3.2 Chất tinh khiết thu từ phân đoạn cột c Phân lập flavonoid sắc ký cột chân không (Cột 2) Mục đích: để tiếp tục phân lập chất G hay flavonoid lại cao A2, tiến hành khảo sát lại số hệ dung môi khai triển Kết hệ ethyl acetat-acetonnước (8:1,9:0,1) được chọn làm dung môi khai triển có khả tách tốt và R f thích hợp Điều kiện sắc ký Cột thủy tinh xốp x 30 cm, xử lí sulfocromic, rửa sạch, sấy khô Pha tĩnh: Silica gel 60, cỡ hạt 0,015-0,04 mm, khối lượng 150 g Pha động: Ethyl acetat – aceton – H2O (8:1,9:0,1) Khối lượng mẫu: 25 g cao A2 Nạp mẫu: Nạp mẫu khô Thể tích hứng phân đoạn là: 150 ml Kiểm tra phân đoạn bảng sắc ký lớp mỏng tráng sẵn với hệ dung môi butyl acetat – nước – acid formic (15:5:5), phát ánh sáng thường, UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử FeCl3 5% Kết quả: thu được phân đoạn được ghi nhận bảng sau Phân đoạn Dung môi V (ml) P (g) Thành phần (1-5) Ethyl acetat 100% 750 1,3 Tạp phân cực 300 2,2 E F Ethyl acetat-aceton-nước 600 4,7 E F (6-7) (8-11) (12-19) (8:1,9:0,1) (20-43) MeOH 100% G 1200 5,2 G 3600 4,3 G 500 6,2 H Tạp phân cực Bảng 3.3 Kết phân lập flavonoid A B C D E F G H I J TP Sơ đồ 3.3 Phân bố phân đoạn của cột Nhận xét: Phân đoạn (2,2 g) được kết tinh nhiều lần methanol thu được tinh thể tinh khiết màu vàng tươi là DC2 (220 mg) Tinh thể được kiểm tra sắc ký lớp mỏng qua hệ dung môi khác EtOAc-H2O-HCOOH-CH3COOH (100:10:5:5), EtOAc-aceton-H2O (4:5,5:0,5), CHCl3-HCOOH-CH3COOH (6:2:0,5), butyl acetatH2O-acid formic (15:5:5) (Hình 10, 11, 12, 13), phát TT vanilin-sulfuric, TT FeCl3, soi UV 365 nm, UV 254 nm Phân đoạn (5,2 g) có vết phát quang màu tím đèn UV 365 nm và cho màu xanh với TT FeCl3, tiến hành kết tinh phân đoạn này nhiều lần methanol cách hòa tan hoàn toàn phân đoạn này lượng vừa đủ methanol, lọc qua phễu thủy tinh xốp Dịch lọc để vào tủ lạnh, cho bay dung môi từ từ, lọc và rửa tinh thể methanol lạnh Tinh thể được kiểm tra sắc ký lớp mỏng qua hệ dung môi khác EtOAc-H2O-HCOOH-CH3COOH (100:10:5:5), EtOAc-aceton-H2O (4:5,5:0,5), CHCl3-HCOOH-CH3COOH (6:2:0,5), butyl acetatH2O-acid formic (15:5:5) (Hình 10, 11, 12, 13), phát TT vanilin-sulfuric, TT FeCl3, soi UV 365 nm, UV 254 nm, tinh thể thu được vô định hình màu vàng tươi đặt tên là DC3 (800 mg) Các phân đoạn lại có nhiều vết nên không tiếp tục nghiên cứu Phân đoạn Chất tinh khiết Đặc điểm Khối lượng (mg) DC2 Vàng tươi 220 DC3 Vàng tươi 800 Bảng 3.4 Chất tinh khiết thu từ phân đoạn cột Tóm tắt trình phân lập chất Từ 50 g cao A2 tiến hành phân lập flavonoid sắc ký cột chân không (cột và cột 2) thu được hợp chất tinh khiết là DC1, DC2, DC3 với khối lượng tương ứng 34 mg, 670 mg, 800 mg Tiến hành xác định cấu trúc cho kết DC1 là quercetin, DC2 là quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid với tên thường gọi là quercitrin, DC3 là quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid 3.2.2 Phương pháp HPLC điều chế 3.2.2.1 Lựa chọn pha tĩnh Thông thường, kỹ thuật sắc ký pha đảo với cột C8 hay C18 là lựa chọn cho phân tách chất có nguồn gốc tự nhiên và dùng để cô đặc hoạt chất Việc lựa chọn loại cột phù hợp với hợp chất quan tâm phụ thuộc nhiều vào điều kiện thí nghiệm Do đó, thật khó khăn nếu thiếu hiểu biết nhóm hợp chất cần quan tâm Và phòng thí nghiệm nào đủ sở vật chất để thay đổi điều kiện cột Tuy nhiên, việc chạy thử với hay điều kiện cột pha đảo khác mang lại nhiều lợi ích, cho ta kiện nhóm hợp chất quan tâm và có thể thăm dò được điều kiện phân tách thành công 3.2.2.2 Lựa chọn phương pháp Việc tìm hệ dung môi đáp ứng tốt cho việc phân tách được ví tìm được chiếc chìa khóa cho việc tinh khiết hóa hợp chất tự nhiên từ hỗn hợp dịch chiết Công việc quan trọng này được xây dựng theo phương pháp và đòi hỏi phải thực nghiệm theo nguyên tắc định để tìm điều kiện phân tách tối ưu và có thể áp dụng thành công quy mô lớn Cần lưu ý tất phân tách nào có thể đạt được sau lần sắc ký Hỗn hợp chất (ví dụ dịch chiết dược liệu) cần phải được loại tạp sơ cách thực với kỹ thuật sắc ký thích hợp sắc ký cột nhanh, sắc ký lọc gel… để thu phân đoạn có chứa hợp chất mà ta quan tâm với tạp hay thành phần đơn giản Lượng mẫu tiêm vào cột và lượng chất tinh khiết phụ thuộc nhiều vào yêu cầu định Khi không áp dụng kỹ thuật cột tải và tiến hành thăm dò điều kiện sắc ký cho cột điều chế cột phân tích lượng mẫu tiêm vào cột được giới hạn độ hòa tan mẫu dung môi và khả chịu tải cột Với yêu cầu cần lượng lớn chất tinh khiết, cần thực tiêm mẫu nhiều lần với lượng mẫu ban đầu phù hợp để thu đủ lượng chất tinh khiết cần.Với điều kiện lý tưởng là cột điều chế và cột phân tích có cùng chiều dài, được sản xuất với cùng kỹ thuật nhồi cột cùng hãng sản xuất, ta có thể phát triển sang phương pháp điều chế dễ dàng và có thể dự đoán trước được 3.2.2.3 Sự lựa chọn dung môi Đối với sắc ký pha đảo, nước được sử dụng dung môi yếu dung môi hữu MeOH, MeCN hay THF là dung môi mạnh Các dung môi này có độ truyền qua tốt cho đầu dò UV và làm thay đổi độ chọn lọc chất phân tách Nếu dung môi không thích hợp để đạt được tách chiết theo mong muốn, ta có thể thay thế dung môi khác Trong hầu hết trường hợp, hỗn hợp dung môi là thích hợp cho phân tách hỗn hợp, đó hỗn hợp hay dung môi là không cần thiết 3.2.2.4 Điều kiện HPLC điều chế quercetin Cột sắc ký: Chromegabond C8 Pha động: CH3CN-H2O (30:70) Thêm giọt H3PO4 1% 250 ml dung môi pha động Bước sóng phát hiện: 370 nm Tốc độ dòng: 2ml/phút Thể tích bơm: 20ml Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng Thu gom phân đoạn theo hình dạng peak Kết luận nhận định CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ NHẬN ĐỊNH 4.1 KẾT LUẬN Chiết xuất: từ kg dược liệu chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu được 54 g cao A2, cao A2 chứa hàm lượng lớn flavonoid Phân lập: Từ 50 g cao A2 tiến hành phân lập flavonoid sắc ký cột chân không (Cột và cột 2) thu được hợp chất tinh khiết là DC1, DC2, DC3 với khối lượng tương ứng 34 mg, 670 mg, 800 mg Cấu trúc chất được xác định lần lượt là: quercetin (DC1), quercitrin (DC2), quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid (DC3) 4.2 NHẬN ĐỊNH Có thể chiết xuất nhóm Flavonoid toàn phần từ Diếp cá phương pháp ngấm kiệt với cồn 96% và phương pháp siêu âm Có thể phân lập quercetin, quercitrin, quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid sắc ký cột chân không HPLC điều chế Các chất phân lập được có thể được xem chất đối chiếu cho mục đích nghiên cứu Diếp cá Phân lập HPLC có nhiều ưu điểm so với phương pháp sắc ký cột chân không, nhiên cần phải có máy móc đại, điều này sở sản xuất Dược phẩm nào đáp ứng được, nên khó áp dụng rộng rãi so với phương pháp sắc ký cột chân không TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ môn Dược liệu Đại học Y Dược TPHCM- Bộ môn Dược liệu Đại học Dược Hà Nội (1998), Bài giảng Dược liệu-tập 1, Bộ Y tế và Bộ Giáo dục đào tạo, tr.259-289 Bộ môn Thực vật Đại học Y Dược TPHCM (2005), Giáo trình Phân loại thực vật, tr.51 Bộ Y tế (2002), Dược Điển Việt Nam III, Nhà xuất Y Học, tr.350 Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y Học, tr.40-41 Hoàng Thanh Hương, Trần Quỳnh Hoa, Hà Việt Bảo, Nguyễn Danh Thục (2002), ‘‘Góp phần nghiên cứu thành phần flavonoid chiết xuất từ Diếp cá Houttuynia cordata Thunb Việt Nam’’, Tạp chí Dược học, Nhà xuất Bộ y tế, Hà Nội, 9, tr.13-15 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam-quyển 1, Nhà xuất Trẻ, tr.288 Phạm Xuân Sinh, Cao Văn Thu, Đinh Thị Thanh Thủy (1997), ‘‘Nghiên cứu thành phần hóa học Diếp cá’’, Tạp chí Dược học, Nhà xuất Bộ y tế, Hà Nội, 7, tr.7-9 Trần Việt Hưng (1998), Thuốc nam đất Mỹ-tập 1, Nhà xuất HK publishing Co Võ Văn Chi (2004), Tự điển thực vật thông dụng-tập 2, Nhà xuất Khoa học và kỹ thuật, tr 1386-1387 TIẾNG NƯỚC NGOÀI 10 Chiang L C., Chang J S., Chen C C., Liu L T., Wang K C., Lin C C (2001), “Antileukemic activity of Bidens pilosa L var minor (blume) Sherff and Houttuynia cordata Thunb.”, Am J Chin Med , 29 (2), pp.303-312 11 Kim I S., Kim J H., Yun C Y., Kim D H., Lee J S (2007), “The inhibitory effect of Houtuynia cordata extract on stem cell factor-induced HMC-1 cell migration”, J Ethnopharmacol, 112 (1), pp.90-95 12 Kim S K., Ryu S Y., No J., Choi S U., Kim Y S (2001), “Cytotoxic alkaloids from Houttuynia cordata”, Arch Pharm Res , 24 (6), pp.518-521 13 Zhang Y., Li S., Wu X (2008), ‘‘Pressurized liquid extraction of flavonoid from Houttuynia cordata Thunb.’’, Separation and Purification Technology, 58, pp.305-310 14 www.ykhoanet.com 15 www.wikipedia.org ... geraniol and caryophylen Ngoài ra, tinh dầu chứa acid caprinic, lauryl aldehyd, benzamid, acid hexadecanoic, acid decanoic, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic, aldehyd capric,... cá là nhóm aldehyd va dẫn xuất ceton methyl n-nonyl ceton (đây là chất làm cho Diếp cá vò có mùi tanh), L-decanal, L-dodecanal Nhóm terpen bao gồm chất: α-pinen, camphen, myrcen, limonen,... hóa học, tác dụng dược lý va sử dụng dạng tinh khiết Tuy nhiên, thuốc có nguồn gốc hóa dược, ngoài ưu điểm bật hiệu điều trị cao, dễ sản xuất, dễ sử dụng va bảo quản, vấn đề hạn chế