BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ GIANG Mã sinh viên: 1201133 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY NGŨ SẮC (AGERATUM CONYZOIDES L.) THU HÁI Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ GIANG Mã sinh viên: 1201133 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY NGŨ SẮC (AGERATUM CONYZOIDES L.) THU HÁI Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn DS.NCS Nguyễn Thanh Tùng Ths Đào Anh Hoàng Nơi thực hiện: Khoa Bào chế-Chế biến – Viện Dược Liệu Bộ môn Dược Liệu HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Trong q trình hồn thành khóa luận này, em nhận nhiều giúp đỡ đáng quý thầy cơ, gia đình bạn bè Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ths Đào Anh Hoàng – Khoa Bào chế-Chế biến – Viện Dược Liệu DS NCS Nguyễn Thanh Tùng – Bộ môn Dược liệu hai người thầy, người anh nhiệt tình bảo, hướng dẫn tạo điều kiện cho em q trình làm khóa luận tốt nghiệp Xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm người hết lòng giúp đỡ đóng góp ý kiến quý báu để em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn TS Trần Huy Hoàng - Khoa Vi khuẩn - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, anh chị kỹ thuật viên môn Dược liệu - Trường đại học Dược Hà Nội anh chị khoa Bào Chế – Chế biến – Viện Dược liệu nhiệt tình giúp đỡ em trình làm khóa luận Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè người ln động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập sống Mặc dù thân em có nhiều cố gắng nhiên thời gian thực có hạn nên khóa luận khơng thể tránh khỏi sai sót Em mong nhận đóng góp từ phía thầy bạn Sinh viên Lê Thị Giang MỤC LỤC Trang bìa Trang bìa phụ Lời cảm ơn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại đặc điểm thực vật chi Cỏ hôi (Ageratum L.) 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.2 Tổng quan loài ngũ sắc Ageratum conyzoides L 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.2.2 Một số loài tên dễ nhầm lẫn 1.2.3 Thành phần hóa học chung lồi Ageratum conyzoides L 1.2.4 Một số nhóm hoạt chất Ageratum conyzoides L 1.2.4.1 Alcaloid 1.2.4.2 Flavonoid 1.2.4.3 Triterpene Steroid 1.2.4.4 Tinh dầu 1.2.4.5 Các hợp chất khác 13 1.2.5 Tác dụng dược lý loài Ageratum conyzoides L 13 1.2.5.1 Tác dụng dịch chiết thô 13 1.2.5.2 Tác dụng dược lý tinh dầu 15 1.2.6 Cơng dụng lồi Ageratum conyzoides L 18 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên liệu phương tiện nghiên cứu 19 2.1.1 Nguyên liệu 19 2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.3.1 Định lượng tinh dầu 22 2.3.2 Phân tích thành phần so sánh mẫu tinh dầu 23 2.3.2.1 Phân tích thành phần tinh dầu GC/MS 23 2.3.2.2 So sánh mẫu tinh dầu sắc ký lớp mỏng 23 2.3.3 Thử tác dụng kháng khuẩn 23 2.3.3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán 23 2.3.3.2 Thử nghiệm chống nhiễm khuẩn bề mặt thạch 24 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Thực nghiệm kết 25 3.1.1 Định lượng tinh dầu 25 3.1.2 Phân tích thành phần so sánh mẫu tinh dầu 28 3.1.2.1 Phân tích thành phần tinh dầu GC/MS 28 3.1.2.2 So sánh mẫu tinh dầu SKLM 32 3.1.3 Thử tác dụng kháng khuẩn tinh dầu A conyzoides L S aureus E coli 36 3.1.3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán 36 3.1.3.2 Thử nghiệm chống nhiễm khuẩn bề mặt thạch 38 3.2 Bàn luận 40 3.2.1 Về định lượng tinh dầu 40 3.2.2 Về phân tích thành phần hóa học 40 3.2.3 Về thử tác dụng kháng khuẩn 41 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 4.1 Kết luận 43 4.1.1 Về định lượng tinh dầu 43 4.1.2 Về phân tích thành phần hóa học tinh dầu 43 4.1.3 Thử tác dụng kháng khuẩn 44 4.2 Kiến nghị 44 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích A conyzoides Ageratum conyzoides A flavus Aspergillus flavus BG Bắc Giang  D Đường kính trung bình vịng vơ khuẩn E coli Escherichia coli GC/MS Sắc ký khí kết hợp khối phổ H Hoa HB Hịa Bình HY Hưng Yên IC50 Liều gây ức chế 50% số cá thể nghiên cứu L Lá LD50 Liều gây chết 50% số cá thể nghiên cứu s S aureus Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh Staphylococus aureus DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Bảng 1.1 Kết định tính thành phần hóa học lá, thân, rễ Trang hoa A conyzoides L Bảng 1.2 Các chất dinh dưỡng đa lượng có rễ, thân, hoa A conyzoides L Bảng 1.3 Các amino acid có rễ, thân, hoa A conyzoides L Bảng 1.4 So sánh thành phần tinh dầu A conyzoides L thu hái 12 số nơi Bảng 1.5 Tác dụng tinh dầu A conyzoides L S aureus E coli 16 Bảng 1.6 Tác dụng tinh dầu A conyzoides L A flavus 16 Bảng 1.7 IC50 số tinh dầu tế bào ung thư tuyến tiền liệt 17 Bảng 2.1 Các mẫu nghiên cứu kí hiệu 20 Bảng 2.2 Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn kiểm định 21 Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu Ageratum conyzoides L thu hái số 24, 25 địa phương Bảng 3.2 Thành phần hóa học phần nặng nhẹ mẫu HY-11-H 29 Bảng 3.3 Thành phần hóa học mẫu tinh dầu Ageratum 31 conyzoides L Bảng 3.4 Rf vết sắc ký đồ sau phun thuốc thử 35 Vanilin/H2SO4 mẫu tinh dầu A conyzoides L thu hái tháng khác Hưng Yên Bảng 3.5 Rf vết sắc ký đồ sau phun thuốc thử 35 Vanilin/H2SO4 mẫu tinh dầu A conyzoides L thu hái tháng 04/2017 Hưng n, Hịa Bình Bắc Giang Bảng 3.6 Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn phần nặng-nhẹ 37 tinh dầu HY-11-H phương pháp khuếch tán Bảng 3.7 Tác dụng tinh dầu hoa, ngũ sắc vi khuẩn kiểm định 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Hình 1.1 Một số dẫn chất monoterpen có oxy tinh dầu A conyzoides Trang L Hình 1.2 Một số dẫn chất monoterpen khơng có oxy tinh dầu A conyzoides L Hình 1.3 Một số dẫn chất sesquiterpen có oxy tinh dầu A 10 conyzoides L Hình 1.4 Một số dẫn chất sesquiterpen khơng có oxy tinh dầu A 10 conyzoides L Hình 1.5 Các dẫn chất chroman tinh dầu A conyzoides L 11 Hình 1.6 Các dẫn chất chromen tinh dầu A conyzoides L 11 Hình 1.7 Các phenylpropanoid dẫn chất có nhân thơm tinh dầu A 13 conyzoides L Hình 2.1 Các mẫu A conyzoides L thu hái tại: (a).Hưng Yên tháng 19 11/2016; (b).Hưng Yên tháng 02/2017; (c).Hưng Yên tháng 04/2017; (d).Hịa Bình tháng 04/2017 (e).Bắc Giang tháng 04/2017 Hình 3.1 Hàm lượng tinh dầu hoa A conyzoides L mẫu 27 thu hái Hưng Yên Hình 3.2 Hàm lượng tinh dầu mẫu A conyzoides L thu hái 28 tháng 4/2017 Hưng n, Hịa Bình, Bắc Giang Hình 3.3 Tỉ lệ precocen I/precocen II hoa mẫu A 30 conyzoides L thu hái Hưng Yên Hình 3.4 Hàm lượng precocen I, precocen II sesquiterpen 32 mẫu tinh dầu A conyzoides L nghiên cứu Hình 3.5 Sắc ký đồ tinh dầu A conyzoides L thu hái tháng Hưng Yên triển khai với hệ dung môi (I) quan sát ở: (a) UV 254nm, (b) 366 nm, (c) sau phun vanilin/H2SO4 quan sát ánh sáng thường 34 Hình 3.6 Sắc ký đồ tinh dầu A conyzoides L thu hái tháng 04/2017 34 tỉnh triển khai với hệ dung môi (I) quan sát ở: a UV 256nm, b 366 nm, c sau phun vanilin/H2SO4 quan sát ánh sáng thường Hình 3.7 Vịng vơ khuẩn ức chế E coli (1) tinh dầu nhẹ, (2) tinh dầu 37 nặng (3) Streptomycin Hình 3.8 Vịng vơ khuẩn ức chế S aureus (1) tinh dầu nhẹ, (2) tinh 37 dầu nặng (3) Benzathin penicillin Hình 3.9 Sự phát triển E coli đĩa thạch khác (a): 39 chứng; (b): đĩa chứa 200µg mẫu HY-3-H; (c): đĩa chứa 200µg mẫu HY-3L Hình 3.10 Sự phát triển S aureus đĩa thạch khác (a): chứng; (b): đĩa chứa 200µg mẫu HY-3-H; (c): đĩa chứa 200µg mẫu HY-3-L 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây ngũ sắc, hay gọi cỏ cứt lợn, tên khoa học Ageratum conyzoides L có nguồn gốc châu Mỹ, sau phát tán vùng nhiệt đới nhiệt đới Ở Việt Nam, ngũ sắc mọc hoang phổ biến khắp nơi với trữ lượng vô phong phú khai thác hàng ngàn năm [1] A conyzoides L thuốc biết đến từ thời cổ đại lồi có hiệu điều trị nhiều bệnh khác Ở vài nước châu Phi Nam Mỹ, ngũ sắc dùng để hạ sốt, giảm đau, chống co thắt cầm máu, băng bó vết bỏng, Tại Ấn Độ, ngũ sắc sử dụng điều trị bệnh phong sỏi thận Ở Việt Nam, cơng dụng kể trên, cịn dùng để trị ngứa, chữa bệnh rong kinh phụ nữ sau sinh, đặc biệt hoa vắt lấy nước để chữa viêm mũi xoang [9] Từ kinh nghiệm dân gian, dịch chiết ngũ sắc Viện Dược Liệu nghiên cứu bào chế chế phẩm điều trị viêm xoang có tác dụng tốt, giá thành rẻ mà lại tác dụng khơng mong muốn [1] Trên giới có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý ngũ sắc tác dụng hạ sốt, chống viêm, chống dị ứng… dịch chiết nhiều cơng bố nói tính chống viêm, chống oxy hóa, giảm đau, chống tăng sinh số dòng tế bào ung thư đặc biệt tác dụng kháng khuẩn kháng nấm tốt tinh dầu loài [23] Tại Việt Nam, nghiên cứu thành phần tinh dầu ngũ sắc tiến hành với mẫu thu hái Hà Nội Bắc Ninh [7], [10] Tuy nhiên ngũ sắc lại lồi có tính phân ly cao phân bố rộng, chưa có nghiên cứu so sánh vùng miền với tác dụng sinh học tinh dầu ngũ cịn bỏ ngỏ Vì lí trên, để góp phần nghiên cứu tồn diện ngũ sắc góp phần khai thác, sử dụng cách hợp lý tinh dầu loài này, tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học tinh dầu ngũ sắc (Ageratum conyzoides L.) thu hái số địa phương” với mục tiêu: Xác định hàm lượng tinh dầu ngũ sắc A conyzoides L thu hái số địa phương khác PHỤ LỤC Sắc ký đồ sắc ký khí kết hợp khối phổ mẫu Ageratum L Phụ lục SKĐ GC/MS mẫu HY-11-H Phụ lục SKĐ GC/MS mẫu HY-11-L Phụ lục SKĐ GC/MS mẫu HY-2-H Phụ lục SKĐ GC/MS mẫu HY-2-L Phụ lục SKĐ GC/MS mẫu HY-4-H Phụ lục SKĐ GC/MS mẫu HY-4-L Phụ lục SKĐ GC/MS mẫu HB-4-H Phụ lục SKĐ GC/MS mẫu HB-4-L Phụ lục SKĐ GC/MS mẫu BG-4-H Phụ lục 10 SKĐ GC/MS mẫu BG-4-L Phụ lục 11 SKĐ GC/MS mẫu HB-2-H Phụ lục 12 SKĐ GC/MS mẫu HB-2-L Phụ lục 13 SKĐ GC/MS mẫu SP-1-H Phụ lục 14 SKĐ GC/MS mẫu SP-1-L ... ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI L? ? THỊ GIANG Mã sinh viên: 1201133 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY NGŨ SẮC (AGERATUM CONYZOIDES L. ) THU HÁI Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG KHÓA LUẬN... (Ageratum conyzoides L. ) thu hái số địa phương? ?? với mục tiêu: Xác định hàm l? ?ợng tinh dầu ngũ sắc A conyzoides L thu hái số địa phương khác Xác định so sánh thành phần hóa học tinh dầu mẫu thu Sơ... góp phần nghiên cứu tồn diện ngũ sắc góp phần khai thác, sử dụng cách hợp l? ? tinh dầu l? ??i này, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học tinh dầu ngũ sắc (Ageratum