BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ TUYẾT NHUNG HÀ NỘI - 2017 1201439 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI GLYCIN, CYSTEIN VÀ AMONI GLYCYRRHIZAT BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC (HILIC) KHÔNG TẠO DẪN XUẤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ - 2017 HÀ NỘI BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ TUYẾT NHUNG 1201439 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI GLYCIN, CYSTEIN VÀ AMONI GLYCYRRHIZAT BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC (HILIC) KHÔNG TẠO DẪN XUẤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Vũ Ngân Bình ThS Nguyễn Hoàng Lê Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá phân tích Độc chất - 2017 HÀ NỘI LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài, em nhận nhiều giúp đỡ từ Ban giám hiệu nhà trường, tận tâm giảng dạy từ thầy, cô giáo suốt trình năm năm học tập trường vừa qua, đặc biệt từ thầy cô trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành khoá luận Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Vũ Ngân Bình, ThS Nguyễn Hoàng Lê, hai thầy cô trực tiếp hướng dẫn em, bảo tận tình từ ngày đầu em làm khoá luận, đưa hướng giải đắn em gặp phải khó khăn trình làm thực nghiệm Em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Đặng Hoàng – Phó trưởng Bộ môn Hoá phân tích Độc chất, người thầy tận tình hướng dẫn em, hướng nghiên cứu trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Hoá phân tích Độc chất tạo điều kiện cho em thực khoá luận Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè giúp đỡ, động viên em vượt qua khó khăn trình học tập nghiên cứu trường Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2017, Sinh viên Đỗ Thị Tuyết Nhung iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan sắc ký lỏng tương tác thân nước 1.1.1 Nguyên tắc 1.1.2 Ưu điểm .5 1.2 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.2.1 Glycin 1.2.2 Cystein .8 1.2.3 Amoni glycyrrhizat 1.2.4 Một số phương pháp phân tích acid amin CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu .13 2.2 Nguyên vật liệu 13 2.2.1 Hoá chất 13 2.2.2 Chuẩn bị dung dịch 14 2.2.3 Chuẩn bị đệm 15 2.2.4 Thiết bị, dụng cụ .15 iv 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.2 Thẩm định quy trình 17 2.3.3 Áp dụng phương pháp chạy mẫu thị trường 19 2.4 Xử lý kết 19 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 20 3.1.1 Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 20 3.1.2 Khảo sát điều kiện pha mẫu 20 3.1.3 Khảo sát pH đệm, nồng độ đệm 23 3.1.4 Lựa chọn cột sắc ký, tốc độ dòng 24 3.1.5 Khảo sát nhiệt độ cột .25 3.1.6 Chọn bước sóng phát .26 3.2 Phương pháp phân tích đồng thời glycin, cystein amoni glycyrrhizat 28 3.3 Thẩm định phương pháp 29 3.3.1 Độ chọn lọc .29 3.3.2 Độ phù hợp hệ thống .30 3.3.3 Khoảng nồng độ tuyến tính .32 3.3.4 Độ lặp lại phương pháp 34 3.3.5 Độ thu hồi phương pháp 35 v 3.4 Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm thuốc tiêm thị trường 37 3.5 Bàn luận chung 38 3.5.1 Phương pháp xử lý mẫu 38 3.5.2 Sắc ký HILIC 38 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .40 4.1 Kết luận 40 4.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AG Ammonium glycyrrhrizate Amoni glycyrrhizat CYS Cysteine Cystein GLY Glycine Glycin HILIC Hydrophylic interaction liquid Sắc ký lỏng tương tác thân chromatography nước MP Mobile phase Pha động NP Normal phase Pha thuận RP Reverse phase Pha đảo SP Stationary phase Pha tĩnh UV Ultraviolet Tử ngoại VIS Visual Khả kiến vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Quy trình pha dung dịch chuẩn 14 Bảng 2.2: Quy trình pha đệm phosphat 15 Bảng 2.3: Các yếu tố pha động khảo sát 17 Bảng 3.1: Thời gian lưu chất phân tích tỷ lệ pha động khác 20 Bảng 3.2: Ảnh hưởng pH 23 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ đệm 24 Bảng 3.4: Thời gian lưu chất hai tốc độ dòng hai cột .25 Bảng 3.5: Thời gian lưu chất phân tích nhiệt độ 26oC 30oC 26 Bảng 3.6: Kết tính chọn lọc 30 Bảng 3.7: Kết độ phù hợp hệ thống 31 Bảng 3.8: Quy trình pha mẫu đường chuẩn 32 Bảng 3.9: Kết khảo sát khoảng tuyến tính 33 Bảng 3.10: Kết độ lặp lại 34 Bảng 3.11: Kết khảo sát độ thu hồi phương pháp .35 Bảng 3.12: Kết đánh giá hàm lượng AG chế phẩm 37 Bảng 3.13: Kết đánh giá hàm lượng CYS chế phẩm 38 Bảng 3.14: Kết đánh giá hàm lượng GLY chế phẩm .38 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cơ chế tách HILIC .3 Hình 1.3: Công thức cấu tạo glycin Hình 1.4: Công thức cấu tạo cystein Hình 1.5: Công thức cấu tạo amoni glycyrrhyzat .8 Hình 3.1: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp bước sóng 254 nm 21 Hình 3.2: Sắc ký đồ chuẩn đơn cystein bước sóng 254 nm 22 Hình 3.3: Phổ hấp thụ AG, CYS, GLY .27 Hình 3.4: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 28 Hình 3.5: Sắc ký đồ mẫu hai bước sóng 254 nm 200 nm 29 Hình 3.6: Kết độ phù hợp hệ thống 31 Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic chất glycin, cystein amoni glycyrrhizat 33 ix ĐẶT VẤN ĐỀ Acid amin đóng vai trò quan trọng thể sống, chúng thường có mặt thực phẩm bổ sung dinh dưỡng thuốc điều trị triệu chứng suy nhược thiếu acid amin Bên cạnh đó, chúng phối hợp chế phẩm điều trị với mục đích khác [6] [15], đó, glycin cystein kết hợp với amoni glycyrrhizat chế phẩm thuốc tiêm nhằm làm giảm tác dụng phụ tăng aldosteron, hỗ trợ gan thực phản ứng đào thải độc tố [21] Việc kiểm nghiệm dạng thuốc gặp phải khó khăn chứa glycin cystein hợp chất phân cực, chúng không lưu giữ phân tích trực tiếp sắc ký lỏng pha đảo Thông thường, ta sử dụng phản ứng tạo dẫn xuất cho acid amin, sau định lượng sắc ký pha đảo [23] sắc ký trao đổi ion [2] Những phương pháp phức tạp khâu chuẩn bị mẫu, khó khăn định tính, định lượng đồng thời ba hoạt chất chế phẩm Sắc ký lỏng tương tác thân nước kỹ thuật mới, giải vấn đề Dựa kết hợp pha tĩnh phân cực pha động phân cực [12], ưu điểm HILIC khả lưu giữ hợp chất phân cực [24] Do đó, HILIC áp dụng phân tích trực tiếp acid amin mà không cần tạo dẫn chất Hơn nữa, HILIC có khả phân tích hợp chất phân tử lớn, phân cực [18] amoni glycyrrhizat, ứng dụng để phân tích đồng thời ba chất amoni glycyrrhizat, glycin cystein chế phẩm Tính đến thời điểm tại, theo tìm hiểu tôi, Việt Nam giới chưa có nghiên cứu phân tích đồng thời ba chất công bố Từ lý trên, tiến hành đề tài: “Xây dựng phƣơng pháp phân tích đồng thời glycin, cystein amoni glycyrrhizat sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc (HILIC) không tạo dẫn xuất” với hai mục tiêu chính: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng glycin, cystein amoni glycyrrhizat chế phẩm thuốc tiêm sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) không tạo dẫn xuất Ứng dụng phương pháp định lượng thành phần chế phẩm 30oC, nhiên chưa thể cố định tốt thời gian lưu chất phân cực amoni glycyrrhizat Một nhược điểm khác HILIC dễ dàng nhận thấy cột cân chậm, cần có thời gian hình thành lớp dung môi thân nước bề mặt pha tĩnh Do đó, thời gian cân cột kéo dài thay đổi pha động (ít 30 phút) Pha tĩnh có hạt nhồi cột chất silica, cần bảo quản điều kiện dung môi hữu có tỷ lệ cao (ACN:H2O: 90%:10%), trước đó, để loại bỏ hoàn toàn đệm pha tĩnh, cần rửa cột tỷ lệ ACN:H2O: 60%:40%, sau tăng dần tỷ lệ dung môi hữu thành 90% 39 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu, đưa kết luận quy trình xử lý mẫu điều kiện sắc ký sau:  Xử lý mẫu: mẫu pha loãng 10 lần nước Lọc qua màng lọc, bọc tối, trước tiến hành chạy sắc ký  Điều kiện sắc ký - Cột sắc ký: Cột Agilent Zorbax RX Silica 5µm (4,6 x 250 mm) - Pha động: Kênh A: Acetonitril Kênh B: Đệm phosphat (3 mM, pH 3,5) Tỷ lệ A:B = 75:25 - Tốc độ dòng 0,8 ml/phút - Nhiệt độ cột: 30oC - Detector: bước sóng 200 nm (đối với glycin cystein) 254 nm (đối với amoni glycyrrhizat) - Thể tích tiêm mẫu: 5µl  Thẩm định quy trình định lượng theo yêu cầu AOAC (2016) dược điển Việt Nam ĨV  Kết thẩm định: - Phương pháp có tính chọn lọc tốt với glycin, cystein amoni glycyrrhizat - Có tương quan tuyến tính nồng độ chất phân tích đáp ứng phân tích - Có độ thu hồi tốt với chất 40 4.2 Kiến nghị Dựa kết nghiên cứu, xin đưa vài đề xuất sau: Tiến hành nghiên cứu độ ổn định cystein theo thời gian điều kiện bảo quản khác nhau, từ đưa yêu cầu bảo quản với chế phẩm chứa cystein Áp dụng HILIC phổ biến định lượng chế phẩm chứa acid amin nói riêng hợp chất phân cực, hấp thụ yếu vùng tử ngoại-khả kiến nói chung dựa phù hợp ưu HILIC nhóm chất 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hoá phân tích, Tập 2, Hà Nội Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam, Trung tâm Dược điển - Dược thư Việt Nam, tr.PL-193 Bộ Y Tế (2014), Thông tư số 44/2014/TT-BYT: Hướng dẫn ASEAN thẩm định quy trình phân tích, chủ biên, Văn phòng phủ Nguyễn Văn Rư Nguyễn Xuân Thắng (2015), Hoá sinh học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam 4, Y học, Hà Nội, 1324 Tiếng Anh Ronald M Abel cộng (1973), "Improved survival from acute renal failure after treatment with intravenous essential L-amino acids and glucose: Results of a prospective, double-blind study", New England Journal of Medicine 288(14), tr 695-699 Andrew J Alpert (1990), "Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds", Journal of chromatography A 499, tr 177-196 AOAC (2016), AOAC official methods of analysis Appendix F guidelines for standard method performance requirements Bernard A Olsen Brian W.Pack (2013), Hydrophilic Interaction Chromatography Mark F.Vitha, ed, Tập 177, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, tr.102 10 Bernard A Olsen Brian W.Pack (2013), Hydrophilic interaction chromatography, Mark F Vitha, ed, 99 - 101 11 Bieke Dejaegher, Debby Mangelings Yvan Vander Heyden (2008), "Method development for HILIC assays", Wiley interScience, tr 1438 - 1448 12 Bieke Dejaegher Yvan Vander Heyden (2010), "HILIC methods in pharmaceutical analysis", Wiley interScience, tr 698 - 715 13 Bogusław Buszewski Sylwia Noga (2012), "Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)—a powerful separation technique", Analytical and bioanalytical chemistry 402(1), tr 231-247 14 Hong-Ren Chen Shuenn-Jyi Sheu (1993), "Determination of glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid in traditional Chinese medicinal preparations by capillary electrophoresis", Journal of chromatography A 653(1), tr 184-188 15 George C Cotzias, Melvin H Van Woert Lewis M Schiffer (1967), "Aromatic amino acids and modification of parkinsonism", New England Journal of Medicine 276(7), tr 374-379 16 D Fekkes, Van Dalen A Edelman M (1995), "Validation of the determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography using automated pre-column derivatization with o-phthaldialdehyde", Journal of chromatography B, tr 177 - 186 17 Gerard De Groot, Reinder Koops Hogendoorn (1988), "Improvement of selectivity and sensitivity by column switching in the determination of glycyrrhizin and glycyrrhetic acid in human plasma by high-performance liquid chromatography", Journal of chromatography A 456, tr 71-81 18 Aikaterini M Gremilogianni, Nikolaos C Megoulas Michael A Koupparis (2010), "Hydrophilic interaction vs ion pair liquid chromatography for the determination of streptomycin and dihydrostreptomycin residues in milk based on mass spectrometric detection", Journal of chromatography A 1217(43), tr 66466651 19 Yunsheng Hsieh (2008), "Potential of HILIC-MS in quantitative bioanalysis of drugs and drug metabolites" 20 Jia S, Kang YP Park JH (2011), "Simultaneous determination of 23 amino acids and biogenic amines in fermented food samples by liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry", Journal of chromatography A, tr 75-102 21 Joseph E Pizzorno Michael T Murray (2013), Textbook of natural medicine, Tập 4, Churchill Livingstone, United States of America, tr.807 22 NV Komarova, JS Kamentsev Solomonova (2004), "Determination of amino acids in fodders and raw materials using capillary zone electrophoresis", Journal of chromatography B 800(1), tr 135-143 23 Ingolf Krause, Annette Bockhardt Neckermann (1995), "Simultaneous determination of amino acids and biogenic amines by reversed-phase highperformance liquid chromatography of the dabsyl derivatives", Journal of chromatography A 715(1), tr 67-79 24 Praveen Kumar, Antoni Rubies Ramon Companyó (2012), "Hydrophilic interaction chromatography for the analysis of aminoglycosides", Journal of separation science 35(4), tr 498-504 25 Ruiping Li, Yi Zhang Lee (2010), "Development and validation of a hydrophilic interaction liquid chromatographic method for determination of aromatic amines in environmental water", Journal of chromatography A 1217(11), tr 1799-1805 26 Shion-Jane Lin, Hshinn-Hshiung Tseng Wen (1996), "Determination of gentiopicroside, mangiferin, palmatine, berberine, baicalin, wogonin and glycyrrhizin in the traditional Chinese medicinal preparation Sann-Joong-KueyJian-Tang by high-performance liquid chromatography", Journal of chromatography A 730(1-2), tr 17-23 27 Mondello L (2002), Multidimensional Chromatography, Wiley, England, New York, tr.102 - 104 28 RL Heinrikson SC Meredith (1984), "Amino acid analysis by reverse-phase high-performance liquid chromatography: precolumn derivatization with phenylisothiocyanate", Analyse biochemical, tr 65 - 74 29 Sean C Sweetman (2009), Martindale Tập 36, the Pharmaceutical Press, London, UK, tr.2316 30 Alexander LN Van Nuijs, Isabela Tarcomnicu Adrian Covaci (2011), "Application of hydrophilic interaction chromatography for the analysis of polar contaminants in food and environmental samples", Journal of chromatography A 1218(35), tr 5964-5974 31 Wenyi Yu, Hongli Jin Shen (2017), "Purification of high-purity glycyrrhizin from licorice using hydrophilic interaction solid phase extraction coupled with preparative reversed-phase liquid chromatography", Journal of chromatography B 1040, tr 47-52 PHỤ LỤC Sắc ký đồ chuẩn đơn AG, GLY pha pha động, đệm phosphat, nước 254 nm Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp độ lặp lại Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp khoảng tuyến tính ... nghiên cứu Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời glycin, cystein amoni glycyrrhizat chế phẩm thuốc tiêm sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) không tạo dẫn xuất Thẩm định phương pháp tiêu... 1201439 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI GLYCIN, CYSTEIN VÀ AMONI GLYCYRRHIZAT BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC (HILIC) KHÔNG TẠO DẪN XUẤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ... cứu phân tích đồng thời ba chất công bố Từ lý trên, tiến hành đề tài: Xây dựng phƣơng pháp phân tích đồng thời glycin, cystein amoni glycyrrhizat sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc (HILIC) không tạo