WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ HPTLC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ HPTLC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 6072 04 10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Tường Vy NCS Cao Công Khánh HÀ NỘI 2014 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng kính trọng lời cảm ơn sâu sắc tới cô giáo PGS.TS Nguyễn Tường Vy, NCS Cao Công Khánh người trực tiếp bên hướng dẫn, động viên giúp đỡ suốt trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể anh chị labo Hóa độc thực phẩm - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, người dìu dắt, hướng dẫn đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn anh chị nhóm tải báo giúp nhiều việc tìm tài liệu tham khảo cho luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, thầy cô tạo điều kiện suốt trình học tập trường thực luận văn Cuối xin dành lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, khích lệ thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, ngày 23 tháng năm 2014 Học viên Đinh Thị Thúy Hương Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHÓA LUẬN ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan thực phẩm chức 1.2 Tổng quan anthocyanin 1.2.1 Cấu trúc anthocyanin 1.2.2 Tác dung anthocyanin 1.2.3 Tính chất Anthocyanin 1.2.4 Một số phƣơng pháp phân tích anthocyanin 1.3 Tổng quan HPTLC 10 1.3.1 Sắc ký lớp mỏng 10 1.3.2 HPTLC 12 1.4 Tổng quan HPLC 14 1.4.1.Khái niệm chung 14 1.4.2 Một số khái niệm sắc ký 14 1.4.3 Thiết bị sắc ký lỏng 16 1.5 Tổng quan chiết pha rắn SPE 20 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.2 Nguyên vật liệu – thiết bị 21 2.2.1.Nguyên vật liệu 21 2.2.2 Thiết bị 22 2.3 Nội dung nghiên cứu 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 2.4.1 Khảo sát điều kiện phân tích anthocyanin HPLC 23 2.4.2 Khảo sát điều kiện phân tích anthocyanin HPTLC 25 2.4.3.Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 26 2.4.4 Thẩm định quy trình 27 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 27 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28 3.1.Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích anthocyanin HPLC 28 3.2 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích Anthocyanin HPTLC 31 3.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 32 3.4 Thẩm định phƣơng pháp 34 3.4.1 Tính chọn lọc, tính đặc hiệu 34 3.4.2 Tính thích hợp hệ thống 36 3.4.3 Khoảng tuyến tính 38 3.4.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng 33 3.4.5 Độ thu hồi phƣơng pháp 42 3.4.6 Độ lặp lại phƣơng pháp 44 3.5 Kết áp dụng phƣơng pháp xác định Anthocyanin số sản phẩm 46 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 48 4.1 Xây dựng quy trình kỹ thuật 48 4.1.1 Lựa chọn phƣơng pháp 48 4.1.2 Điều kiện xử lý mẫu 48 4.1.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng 50 4.1.4 Thẩm định phƣơng pháp xây dựng 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AOAC (Association of Official Analytical Chemists) Hiệp hội nhà hóa phân tích thức PDA (Photodiod array detector) Detector mảng diod HPLC (high – performance liquid chromatography) cao Sắc ký lỏng hiệu HPTLC (high – performance thin layer chromatography) Sắc ký lớp mỏng hiệu cao LOD (Limit of Detection) Giới hạn phát LOQ (Limit of quantification) Giới hạn định lượng RSD (Relative standard deviation) Độ lệch chuẩn tương đối SD (Standard deviation) Độ lệch chuẩn S Diện tích pic (mAu.s) C Nồng độ HL Hàm lượng tR Thời gian lưu µL microlit TPCN Thực phẩm chức m Khối lượng TFA Trifluoroacetic acid TCA Trichloroacetic acid Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1 Tên bảng Các phương pháp phân tích Anthocyanin Trang Bảng 2.1 Bảng 2.2 Danh mục mẫu phân tích Danh mục pha động HPLC khảo sát 21 24 Bảng 2.3 Gradient hệ pha động HPTLC khảo sát 25 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Gradient hệ pha động 1,2 Chương trình gradient hệ pha động, Kết định lượng Anthocyanin mẫu bột Bilberry theo dung môi dùng để chiết mẫu Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống với dung dịch biberry HPLC Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống với dung dịch Bilberry HPTLC Kết đánh giá độ tuyến tính chất chuẩn cyanidin chloride 29 30 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 33 37 38 39 Bảng 3.7 Độ lệch điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn 39 Bảng 3.8 Kết đánh giá độ tuyến tính chất chuẩn bilberry 40 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Độ thu hồi phương pháp HPLC với mẫu thực phẩm chức dạng dung dịch Độ thu hồi phương pháp HPTLC với mẫu thực phẩm chức dạng dung dịch Độ lặp lại phương pháp HPLC với mẫu bột đông khô Bilberry Độ lặp lại phương pháp HPLC mẫu nang mềm Độ lặp lại phương pháp HPTLC mẫu nang mềm Kết phân tích Anthocyanin thực phẩm chức Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú 42 43 44 45 46 47 WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN Tên hình Trang Cấu trúc aglucon anthocyanin Sơ đồ khối máy sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Bilberry với hệ pha động Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bilberry với hệ pha động Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bilberry với hệ pha động Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin với hệ pha động Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải với hệ pha động Hình ảnh HPTLC với hệ pha động Sắc ký đồ dung dịch chuẩn gốc cyanidin chloride 10 µg/mL Sắc ký đồ dung dịch bilberry chiết methanol:HCl2N(80:20) Sắc ký đồ dung dịch bilberry sau thủy phân 16 35 Hình 3.14 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 100 µg/mL Sắc ký đồ mẫu thực phẩm chức không chứa anthocyanin Sắc ký đồ mẫu thực phẩm chức không chứa anthocyanin thêm chuẩn cyanidin Sắc ký đồ mẫu thực phẩm chức không chứa anthocyanin thêm chuẩn cyanidin HPTLC Đường chuẩn dung dịch gốc Cyanidin chloride Hình 3.15 Đường chuẩn dung dịch bilberry HPTLC 40 Hình 3.16 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,5 µg/mL 41 Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,2 µg/mL 42 Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú 29 29 30 30 31 32 33 33 35 35 36 36 39 WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày sống ngày phát triển đại, bệnh tim mạch, ung thư phổ biến có chiều hướng gia tăng nhanh Đời sống ngày phát triển, người dân quan tâm đến sức khỏe thân nhiều Ở nước ta năm năm trở lại thực phẩm chức đưa vào sử dụng rộng rãi, tràn lan chúng biết đến chế phẩm sử dụng thường xuyên, lâu dài để phòng ngừa nguy gây bệnh, bổ dưỡng mà an toàn, tác dụng phụ hầu hết lứa tuổi Chính việc người lựa chọn thực phẩm chức để phòng chống bồi bổ sức khỏe nhiều Tuy nhiên hiểu tường tận thực phẩm chức Đa số thực phẩm chức có giá thành cao, Việt Nam việc kiểm soát chất lượng sản phẩm chưa chặt chẽ nên xảy nhiều bất cập có hoạt chất dẫn đến việc sử dụng chúng không mang lại hiểu Theo nghiên cứu hợp chất Anthocyanin có hoạt tính tốt như: Chống viêm, xơ vữa động mạch, ức chế đông tụ tiểu cầu, chống ung thư, thúc đẩy hình thành cytokine điều hòa phản ứng miễn dịch, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Chính mà thực phẩm chức chứa Anthocyanin sản xuất ngày nhiều đối tượng sử dụng phong phú [4], [5], [11] Trên giới có số nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng chất thuộc nhóm Anthocyanin mẫu thực phẩm cách sử dụng kĩ thuật như: UV-VIS, HPLC-PDA, MS, ESI [16], [22], [24] Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng Tuy nhiên phương pháp chủ yếu nghiên cứu đối tượng mẫu thực phẩm, đồ uống, nghiên cứu thực phẩm chức Tại Việt Nam chưa Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON có nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin thực phẩm chức Xuất phát từ thực tiễn đặt vấn đề nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình định lượng Anthocyanin thực phẩm chức phương pháp HPTLC HPLC” Với mục tiêu sau đây: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin thực phẩm chức kỹ thuật HPLC kỹ thuật HPTLC Áp dụng quy trình kỹ thuật xây dựng phân tích số mẫu thực phẩm chức thị trường Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 4.1.3 Xây dựng phương pháp định lượng Cùng với việc tham khảo tài liệu thực nghiệm, lựa chọn quy trình phân tích Anthocyanin thực phẩm chức chứa anthocyanin, thông số chạy máy quan trọng sau: HPTLC: thể tích tiêm mẫu 5µL, bước sóng phát định lượng 520nm,quét sắc đồ 520 nm, tốc độ 20 mm/giây, pha tĩnh silica gel 60 F254, thành phần pha động Ethyacetate: aicd formic: nước (10:2:3;v/v/v) HPLC: thể tích bơm mẫu 50 µL; bước sóng phát định lượng Anthocyanin 520 nm; cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5µm) với tiền cột loại; tốc độ pha động mL/phút; nhiệt độ buồng cột 400C; thành phần pha động gồm acetonitril 2% TCA, 1% Amoniacetate, 2% THF ( pH 2,5) chạy theo chương trình gradient nồng độ Các thông số phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm với hệ thống HPLC Điểm khác đề tài lựa chọn chương trình gradient giúp rửa giải anthocyanin cách hiệu mẫu thời gian cho lần phân tích 26 phút nghiên cứu trước [22], [16], [33], [24] thời gian phân tích dài (trên 40 phút) Quy trình xử lý mẫu lựa chọn đơn giản, có khả làm mẫu, giúp cho việc xác định định lượng chất sắc đồ dễ dàng, điều khẳng định thông qua kết khảo sát dung môi Phương pháp thẩm định phù hợp với yêu cầu AOAC Khoảng tuyến tính Anthocyanin rộng từ 0,5 – 100 ppm So sánh kết với nghiên cứu tác giả Dolores Muller cộng [12] có khoảng tuyến tính từ 15 - 159 ppm, tác giả Brown et al (2005) có khoảng tuyến tính 15 - 182 ppm, tác giả Teow et al (2007) có khoảng tuyến tính 24,6 – 258 ppm cho thấy nghiên cứu có khoảng nồng độ 50 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON tuyến tính rộng hơn, Giới hạn phát giới hạn định lượng (LOD = 0,2 ppm, LOQ = 0,5 ppm) nhỏ với nghiên cứu sử dụng HPLC [32], [12] Tác giả Teow et al (2007) cho kết giới hạn phát giới hạn định lượng 24,6 – 43 ppm, tác giả Brown et al (2005) cho giới hạn phát triển giới hạn định lượng 15 ppm, 38 ppm Để khẳng định lựa chọn phương pháp HPLC phù hợp phân tích anthocyanin mẫu thực phẩm chức chứa nó, tiến hành thử nghiệm phân tích hàm lượng anthocyanin mẫu bột đông khô bilberry chuẩn với phương pháp AOAC Mẫu sau trải qua trình xử lý pha loãng 100 lần với dung dịch pH pH (theo AOAC) đem đo UV bước sóng 520 700 thu kết sau: STT 10 Lƣợng cân mẫu 0,0945 0,0945 0,0908 0,0908 0,0914 0,0914 0,0938 0,0938 0,0893 0,0893 pH pH 520 700 0,499 0,038 0,501 0,032 0,428 0,048 0,429 0,049 0,465 0,047 0,047 0,048 0,429 0,046 0,43 0,046 0,536 0,047 0,537 0,046 Hàm lƣợng trung bình RD RSD(%) 520 0,132 0,138 0,136 0,138 0,196 0,187 0,155 0,154 0,187 0,186 700 0,056 0,053 0,05 0,05 0,063 0,06 0,056 0,054 0,059 0,055 Hàm lƣợng mg/g 44,42 44,30 35,30 35,06 33,99 35,19 33,01 33,01 44,07 43,95 38,23 5,19 13,57 Bảng kết 3.11 cho thấy mẫu bột đông khô bilberry chuẩn theo phương pháp HPLC cho thấy hàm lượng (mg/g) 46,12% độ lệch tương đối phương pháp 2,33, theo AOAC hàm lượng anthocyanin đạt 38,23% độ lệch tương đối theo phương pháp 13,57 Nhìn kết thấy định lượng anthocyanin phương pháp HPLC có độ xác cao hơn, hiệu xuất tốt hơn, sai số 51 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Điều lần khẳng định quy trình định lượng anthocyanin phương pháp HPLC phù hợp 4.1.4 Thẩm định phương pháp xây dựng o Tính thích hợp hệ thống Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống cho thấy : Với HPLC: RSD% thời gian lưu 0,085 diện tích pic 1,59 nằm giới hạn chấp nhận Điều chứng tỏ hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao phù hợp cho việc định lượng anthocyanin thực phẩm chức Với HPTLC: RSD % giá trị Rf 1,59 diện tích pic 1,99, nhỏ nên nằm giới hạn chấp nhận Chính hệ thống HPTLC phù hợp cho việc đinh lượng anthocyanin thực phẩm chức o Khoảng nồng độ tuyến tính, LOD, LOQ Chúng xây dựng khoảng tuyến tính đủ rộng để ứng dụng đánh giá nhiều tiêu hàm lượng Khoảng nồng độ tuyến tính hệ thống HPLC 0,5 – 100 ppm có biên độ cao so với vài nghiên cứu trước Trong khoảng nồng độ tuyến tính (0,5 – 100 ppm) hệ số tương quan hồi quy phương pháp HPLC có r2 = 0.9996 Phương pháp HPTLC khoảng nồng độ tuyến tính (10-50 ppm) có r2 = 0.9994 Điều cho thấy có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích với nồng độ chất phân tích hai phương pháp Tuy nhiên kết LOD, LOQ phương pháp cho thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao hơn, khoảng nồng độ tuyến tính cao, khả phát định lượng anthocyanin khoảng nồng độ rộng hơn, giới hạn phát thấp với nồng độ nhỏ (0,5ppm) phương pháp HPTLC có giới hạn phát nồng độ cao 20 lần 52 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON (10ppm) Đây bước đầu thể hệ thống HPLC phù hợp hơn, tối ưu HPTLC xác định hàm lượng anthocyanin thực phẩm chức o Độ lặp lại phương pháp Kết thẩm định độ lặp lại: với phương pháp HPLC mẫu chuẩn bilberry cho giá trị RSD % hàm lượng 2,33; mẫu NM01 thêm chuẩn bilberry 3,98 Trong giá trị mẫu NM01 thêm chuẩn phương pháp HPTLC 10,13 Điều cho thấy phương pháp HPLC có độ xác cao nhiều so với phương pháp HPTLC Từ nghiên cứu áp dụng phương pháp HPLC để định lượng anthocyanin thực phẩm chức áp dụng HPTLC để phát nhanh tiến hành kiểm tra chất lượng chế phẩm (định tính) o Độ thu hồi Kết thẩm định độ thu hồi với phương pháp HPLC mẫu TPCN anthocyanin thêm chuẩn bilberry cho giá trị RSD % hàm lượng 4,70 với phương pháp HPTLC 13,01 Điều cho thấy phương pháp HPLC có độ đúng, độ thu hồi cao nhiều so với phương pháp HPTLC Từ kết thực nghiệm suốt trình nghiên cứu phương pháp thấy HPLC phương pháp lựa chọn việc xác định hàm lượng anthocyanin thực phẩm chức nên áp dụng phương pháp HPLC để định lượng anthocyanin thực phẩm chức áp dụng HPTLC để phát nhanh tiến hành kiểm tra chất lượng chế phẩm (định tính) 53 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau hoàn thành nghiên cứu này, sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phương pháp HPLC, HPTLC để xác hàm lượng anthocyanin, thu kết sau:  Xây dựng phương pháp định lượng anthocyanin thực phẩm chức chứa anthocyanin trải qua giai đoạn:  Giai đoạn xử lý mẫu: mẫu chiết methanol : HCl 2N (80:20), lắc xoáy, rung siêu âm, thủy phân 150 phút nhiệt độ 800, định mức, lọc tiến hành chạy sắc ký viên nang, chạy SPE lấy dịch chạy sắc ký mẫu dạng dung dịch  Giai đoạn phân tích HPTLC: o Pha tĩnh: mỏng silica gel 60 F254 (20×10) o Pha động: Ethylacetate: acid formic: nước (10:2:3;v/v/v) o Quét sắc đồ 520 nm, tốc độ 20 mm/giây o Thể tích tiêm mẫu: µL  Giai đoạn phân tích HPLC với điều kiện: o Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; µm) tiền cột loại o Pha động: chạy theo chương trình gradient nồng độ Kênh A:2% TCA, 1% Amoniacetate, 2%THF (pH 2,5), Kênh B: Acetonitril 22 23 26 A 90 90 70 70 90 B 10 10 30 30 10 Thời gian (phút) Thành phần pha động (%) o Nhiệt độ cột: 400C o Tốc độ dòng: mL/phút o Thể tích tiêm mẫu: 50 µL o Detector PDA với bước sóng phát 520 nm 54 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Phương pháp xây dựng xác định khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn cho anthocyanin, xác định LOD, LOQ anthocyanin, có độ chọn lọc, độ lặp lại, độ thu hồi tốt Độ lặp lại độ thu hồi đáp ứng yêu cầu AOAC  Áp dụng quy trình phân tích để xác định hàm lượng anthocyanin 11 mẫu thực phẩm chức gồm viên nang cứng, nang mềm dạng dung dịch Kết cho thấy, có số mẫu không phát anthocyanin nghiên cứu Đây kết đáng báo động tình trạng lạm dụng anthocyanin thực phẩm chức năng, đặt yêu cầu cần phải kiểm soát chặt chẽ thực phẩm Từ kết thu được, nhận thấy phương pháp HPLC tối ưu hóa việc xác định anthocyanin thực phẩm chức phương pháp HPTLC lựa chọn để định tính, phát nhanh anthocyanin mẫu chế phẩm cần tiến hành kiểm tra KIẾN NGHỊ - Hai phương pháp cho kết xác định anthocyanin có độ tin cậy cao Cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu đối tượng khác viên nang dạng dung dịch như: loại trà thảo dược dạng lỏng, dạng túi, dạng bột, số loại thuốc, máu, nước tiểu - Nghiên cứu thực đối tượng mẫu thực phẩm chức mà nhiều đối tượng mẫu khác chứa anthocyanin mà nghiên cứu chưa đề cập tới Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn, tìm phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin nhiều đối tượng mẫu khác - Phương pháp tiến hành anthocyanin dạng aglycon Ngoài ra, anthocyanin nhiều dạng glycoside Do đó, cần mở rộng ngiên cứu anthocyanin dạng glycoside nhiều đối tượng khác 55 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Trần Tử An (2010), "Kiểm nghiệm dược phẩm", Nhà xuất Y học, Hà Nội Trần Tử An (2007), "Hóa phân tích- tập 2", Nhà xuất Y học, Hà Nội Võ Thị Bạch Huệ (2007), Hóa Phân Tích Huỳnh Thị Thanh Huyền (2011), "Anthocyanin nguyên liệu chứa Anthocyanin", luận văn thạc sỹ, Trường Đại học Kỹ thuật Công Nghệ HCM, Phạm Luận (2010), "Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao", khoa Hóa học, Trường ĐHKHTN Hà Nội Trần Cao Sơn (2010), "Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật", Nxb Khoa Học Kỹ Thuật B Tiếng Anh Ajaz Ahmad, M Mujeeb, Bibhu Prasad Panda (2010), "An HPTLC Method for the Simultaneous Analysis of Compactin and Citrinin in Penicillium citrinum Fermentation Broth", Journal of Planar Chromatography-modern TLC, 23(4), pp 282–285 Fulcrand 11 et al (1996), "Structure of new anthocyanin-derived wine pigments", J Chem Soc Perkin Trans, pp 735-739 S A Borman (1982), "HPTLC: taking off", Anal Chem, 54, pp 790A-794A 10.Tibo Cserhati (2007), "Liquid Chromatography of Natural Pigment and Synthetic Dyes", journal of chromatography library, 71, pp 63 - 349 11 Dolores Müller, Markus Schantz, and Elke Richling (2012), "High Performance Liquid Chromatography Analysis of Anthocyanins in Bilberries (Vaccinium myrtillus L.), Blueberries (Vaccinium corymbosum L.), and Corresponding Juices", Institute of Food Technologists, 10, pp 1750-3841 12 Dreiseitel A, et al (2009), "Berry anthocyanins and their aglycons inhibit monoamine oxidases A and B", Pharmacol Res, 59(5), pp 306–311 13 Bernard Fried, Joseph Sherma (2007), Thin-Layer Chromatography, pp Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 14 Gabriele Korte, Andrea Dreiseitel, Peter Schreier, Anett Oehme, et al Sanja Locher (2009), "An Examination of Anthocyanins and Anthocyanidins Affinity for Cannabinoid Receptors", Journal of Medicinal Food, pp 1407-1410 15.L Gao, G Mazza (2005), "Characterization, Quantitation, and Distribution of Anthocyanins and Colorless Phenolics in Sweet Cherries", American Chemical Society, 11, pp 1057-1109 16 Georgiana C Cretu , Gertrud E Morlock (1 March 2014), "Analysis of anthocyanins in powdered berry extracts by planar chromatography linked with bioassay and mass spectrometry", Food Chemistry, Volume 146 , pp.104–112 17 Hassan Y A (2003), Separation Techniques in Clinical Chemistry 18 Wu L.C, R Prior (2005a), "Systematic identification and characterization of anthocyanins by HPLC- ESI-MS/MS in common foods in the United States: Fruits and berries", J Agric Food Chem, 53, pp 2589-2599 19.Mokina Waksmundzka-Hajino, Joseph Sherma, Teres Kowalska (2008), Thin Layer Chromatography in Phytochemistry 20 Nakamura Yuko, Hitoshi Matsumoto, Masashi Morifuji, Hiroyuki Iida, and Yasuo Takeuchi Chromatography (2010), Tandem "Development Mass and Spectrometry Validation Method for of a Liquid Simultaneous Determination of Four Anthocyanins in Human Plasma after Black Currant Anthocyanins Ingestion", Agricutural Food Chemistry, 5S, pp 1174-1179 21 Véronique C hey nier, Camila Gómez, Agnès Ageorges (2012), "Flavonoids: Anthocyanins", Handbook of analysis of active compounds in functional foods, 18, pp 379 - 397 22 Aracely Castandeca - Ovando, Ma de Lourdes Pacheco - Hernandez, Ma Elena Paez - Hernandez, Jose A Rodriguez, Andres Galan - Vidal* (2009), "Chemical studies of anthocyanin: A review", Food Chemistry, 113, pp 859 - 871 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 23 Eike Reich, WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Anne Schilbli (2007), "High-Performacne Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medicinal Plants", Thieme Medical Publishers, Inc, US ISBN 1-58890-409-1 24 Antonieta Ruiza, Isidro Hermosín-Gutiérrezb, Carola Vergaraa, Dietrich von Baera, Antonieta Hitschfelda Moisés Zapataa, Claudia Mardonesa Luis Obandoc (May 2013), "Anthocyanin profiles in south Patagonian wild berries by HPLCDAD-ESI-MS/MS", Food Research International, 51(2), pp 706–713 25 Suhad S., Humadi, Viorica Istudor (2009), "Quantitative analysis of bioactive compounds in hibiscus sabdariffa l extracts II quantitative analysis and biological activities of anthocyanins", Farmacia, 7, pp 77 - 81 26 Seeram, Navindra P (2008), "Berry Fruits: Compositional Elements, Biochemical Activities, and the Impact of Their Intake on Human Health, Performance, and Disease", Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(3), pp 627–639 27 Fossen T, Andersen, O.M (2000), "Anthocyanins from tubers and shoots of the purple potato", Solatium tuberosum J Ilort Sci Biotech, 75, pp 360-363 28 Takashi Ichiyanagi, Yoshihiko Hanato, Seiichi Matasugo, and Tetsuya Konishib (2004), "Structural Dependence of HPLC Separation Pattern of Anthocyanins from Bilberry (Vaccinium myrtillus L.)", Chem Pharm Bull, 52(5), pp 628—630 29 Berezkin V (1995), "The discovery of thin layer chromatography", J Planar Chro- matogr.—Mod TLC 8, pp 401-405 30 Luigia Longo and Giuseppe Vasapollo, Dipartimento di Ingegneria dell’Innovazione, Universita di Lecce (2004), "Determination of Anthocyanins in Ruscus aculeatus L Berries", Agricultural and food chemitry, 10, pp 1120-1126 31 Zhimin Xu, Luke R Howard (2012), "Analysis Methods of Anthocvanins", Analysis of Antioxidant-RichPhytochemicals, Chapter 5, pp 945-978 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 32 Zhe Zhang, Xiaolan Kou, Ken Fugal, and Jerry Mclaughilin (2004), "Comparison of HPLC Methods for Determination of Anthocyanins and Anthocyanidins in Bilberry Extracts", J Agric Food Chem, 52, pp 688 - 691 33 Jungmin Leea, Christopher Rennakera, Ronald E Wrolstad "Correlation of two anthocyanin quantification methods: b (2008), HPLC and spectrophotometric methods", Food Chemistry 110 pp 782–786 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON PHỤ LỤC mAU 527 40 35 30 232 25 272 20 250 15 10 654 311 -5 -10 -15 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm Phụ lục 1: Phổ hấp thụ UV – VIS chất chuẩn gốc Cyanidin chloride 0.50 Purity Curve Zero Line Peak mAU 30 20 0.25 10 0.00 22.80 22.85 22.90 22.95 23.00 23.05 23.10 23.15 23.20 23.25 23.30 23.35 23.40 23.45 23.50 peak purity index: 0,999030 Phụ lục 2: Sắc ký đồ thể độ tinh khiết cyanidin chloride 300 /23.243/3423451 mAU 520nm,4nm (1.00) 250 200 150 100 50 -50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu NM01 thêm chuẩn bilberry Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM mAU 520nm,4nm (1.00) /23.314/597863 50 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 40 30 20 10 -10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 Phụ lục 4: Sắc ký đồ xác định độ thu hồi mẫu DD 01 thêm chuẩn bilberry /24.875/1921966 mAU 520nm,4nm (1.00) 150 125 100 75 50 25 -25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 /24.867/1989995 mAU 520nm,4nm (1.00) 150 125 100 75 50 25 -25 0.0 2.5 Phụ lục 5: Sắc ký đồ xác định độ lặp lại mẫu thực phẩm chức Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Phụ lục 6: Hình ảnh sắc đồ HPTLC xác định độ thu hồi mẫu DD01 thêm chuẩn bilberry Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Phụ lục 7: Hình ảnh sắc đồ HPTLC mẫu TPCN không chứa anthocyanin Phụ lục 8: Hình ảnh sắc ký đồ HPTLC xác định độ lặp lại mẫu NM01 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Phụ lục 9: Hình ảnh 3D xác định độ chọn lọc phương pháp HPTLC Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM ... Xây dựng quy trình định lượng Anthocyanin thực phẩm chức phương pháp HPTLC HPLC Với mục tiêu sau đây: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin thực phẩm chức kỹ thuật HPLC. .. dưỡng Thực phẩm chức sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên thực phẩm trình chế biến bổ sung thêm chất khác Cũng thực phẩm thuốc, thực phẩm chức nằm nơi giao thoa thực phẩm thuốc người ta gọi thực phẩm chức. .. Khảo sát xây dựng điều kiện chạy máy HPLC, HPTLC để phân tích Anthocyanin - Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết Anthocyanin thực phẩm chức - Đánh giá (thẩm định) quy trình phân