BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP.Họ và tên sinh viên: HOÀNG THỊ DUNG lớp K33C – Sinh, khóa 2007 – 2011.Họ và tên người hướng dẫn khoa học: TS.Lê Xuân ĐắcĐơn vị công tác: Viện công nghệ sinh học.Địa điểm thực tập: Viện công nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt - Hà Nội.Thời gian thực tập: Từ 14/02/2011 đến 24/04/2011.1. Mục đích – mục tiêu thực tập - Các kỹ thuật cơ bản về nuôi cấy mô và tế bào thực vật. - Kỹ thuật nhân nhanh cây ngưu tất trong ống nghiệm2. Nội dung và kỹ năng cần đạt được trong đợt thực tập.Nội dung cần thực tập.- Pha hóa chất, làm môi trường nuôi cấy trong ống nghiệm- Tạo đa trồi cây ngưu tất- Tạo cây hoàn chỉnh, trồng cây ngoài vườn ươm. Các kỹ thuật cần đạt được trong thời gian thực tập Các kỹ thuật cơ bản phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực. vật (chuẩn bị làm môi trường, nuôi cấy cây trong ống nghiệm, trồng cây ngoài vườn ươm …).3. Các công việc đã thực hiện và kết quả thu được.3.1.Phương pháp pha hóa chất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật 31.1. Mục đíchGiúp học sinh nắm vững phương pháp pha một số hóa chất cần thiết sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào tực vật như: MS, các chất kích thích sinh trưởng…3.1.2. Nguyên lýHóa chât sau khi pha không kết tủa, không lắng cặn. háo chất đượ pha thành dung dịch “stock” bảo quản trong tủ lạnh để sử dụng cho việc pha môi trường nuôi cấy.3.1.3. Dụng cụ và hóa chấta) Dụng cụ: - Cốc thủy tinh có định mức, ống đong, đũa thủy tinh, phễu,lọ nút nhám- nước cất 2 lần- Giấy lọc, giấy gián nhãn- Máy khuấy từ, bếp đun- Cân điện tử b) Hóa chất: - để pha môi trường cơ bản nuôi cấy đều tan trong nước cất. Cân lần lượt các loại hóa chất - Các loại hóa chất cần thiết để pha môi trường MS - Các chất kích thích sinh trưởng 4. Các bước tiến hành. 4.1. Chuẩn bị - Dụng cụ thủy tinh phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sấy khô. Lọ dựng dung dịch phải được dán nhãn ghi tên hóa chất, nồng độ, ngày pha, người pha. - Hóa chất: chuẩn bị theo danh sách, kiểm tra tên hóa chất, hãng sản xuất, hạn sử dụn 4.2. Pha môi trường cơ bản MS. Tất cả hóa chất óa chất cho vào cốc thủy tinh có định mức có định sẵn một lượng nước cất, khuấy tan hóa chất bằng máy khuấy từ, bổ sung nước cất đến thể tích cần thiết. Lọc dung dịch bằng giấy lọc. Đựng vào lọ có dán nhãn đầy đủ và bảo quản trong tủ lạnh Lượng hóa chất cần thiết cho 100ml stock được quy ra từ nồng độ chất đó cần cho một lít môi trường nuôi cấy và phụ thuộc vào cách ta sẽ lấy 1ml hay 5 hoặc 10ml stock cho một lít môi trường nuôi cấy.Ví dụ: lượng CaCl2.2H2O cần thiết cho một lít môi trường nuôi cấy là 44- Nếu pha stock loại cần 10 ml cho 1 lít môi trường nuôi cấy thì trong 10 ml dung dịch stock sẽ phải có 440 mg CaCl2.2H2O.Trong 100 ml stock sẽ phải có 44000 mg CaCl2.2H2O- Nếu pha loại cần 5 ml cho một lít môi trường nuôi cấy thì trong 5 ml stock sẽ phải có 440 ml CaCl2.2H2OTrong 500 ml dung dịch stock sẽ phải có 44000 mg CaCl2.2H2O Quy trình nhân giống HOÀNG THỊ THU TRANG LỚP : K9-ĐHSP SINH dâu tây invitro Giới thiệu chung Dâu tây  Cây dâu tây có tên khoa học Fragaria, thuộc Họ hoa hồng thường gọi dâu đất  Có suất xứ từ Châu Mỹ , giới có khoảng 20 loài dây tây  Ở Việt Nam trồng nhiều Đà Lạt đánh giá trồng có tiềm Một số yếu tố ảnh hưởng tới trình nhân giống  Đối tượng sử dụng: Chồi tia ban đầu bệnh khả sinh trưởng phát triển tốt  Phòng thí nghiệm: Đầy đủ trang thiết bị điều kiện nuôi cấy thích hợp (cường độ chiếu sáng, nhiệt độ phòng, độ ẩm, thời gian chiếu sáng trung bình…)  Môi trường nuôi cấy : vô trùng,có đầy đủ chất cần thiết có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng… Quy trình nhân giống dâu tây in vitro Lựa chọn khử trùng mẫu cấy Tạo thể nhân giống in vitro Nhân giống in vitro Tái sinh invitro hoàn chỉnh Chuyển vườn ươm Lựa chọn khử trùng mẫu  Mẫu cấy : chồi tia khỏe mạnh, tươi non nguyên vẹn  Khử trùng mẫu +Xử lý nước +Xử lý dung dịch xà phòng, lắc + Xử lý dung dịch khử trùng chất hóa học Calcium hypochlrorite, clorua thủy ngân Tạo thể nhân giống in vitro  Cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy ( Agar, ½ MS bổ sung thêm 0,4mg/1BA, 25g/l đường  Có thể nhân giống in vitro : thể chồi thể cắt đốt  Có bổ sung Cytokinin, GA3 chất hữu khác Nhân giống in vitro  Chồi phát triển thành cum chồi non  Thu chồi dâu tây dưa sang môi trường cum  Cắt cụm thành nhiều phần cấy vào bịch  ( thường bịch chứa 2-3 chồi) Tái sinh in vitro hoàn chỉnh  Tạo hoàn chỉnh có đầy đủ phận( rễ thân, )  Tách đơn vào môi trường tạo rễ , nhỏ tiếp tục tạo chồi  Môi trường tạo rễ có bổ sung Auxin, than hoạt tính saccarose Chuyển vườn ươm  Cây rễ lấy khỏi ống nghiệm  Rửa agar đặt chậu cấy  Xử lý nhiệt độ cường độ chiếu sáng cho phù hợp Hình ảnh dâu tây The end! Xin trân trọng cảm ơn cô bạn ý theo dõi, chúc sức khỏe thành công Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà NộiMỞ ĐẦUĐặt vấn đềNuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của ngành Công nghệ sinh học hiện đại. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được thực hiện ở nước ta từ những năm 1960 tại miền Nam và đầu những năm 1970 tại miền Bắc. Tuy nhiên chỉ những cuối năm 1980 trở lại đây, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mới phát triển mạnh mẽ và được đưa vào ứng dụng. Trong đó kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kĩ thuât chính. Những thành công của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, trong đó có bảo tồn ex situ những nguồn gen quý hiếm. Kĩ thuật nuôi cấy mô cho phép chúng ta nhân nhanh một lượng lớn cây giống trong ống nghiệm mà chỉ cần số lượng mẫu ít (thậm chí chỉ cần một chồi). Ngoài ra, kĩ thuật nhân nhanh trong ống nghiệm nhằm tạo ra một quần thể cây con có chất lượng đồng đều về mặt di truyền.Hiện nay, cây Ngưu tất được trồng và mọc chủ yếu ở Sapa, Tam Đảo, Hà Nội . Do chúng được sử dụng khá phổ biến trong y học cổ truyền với nhu cầu ngày càng tăng như: làm giảm cholesterol trong máu, hạ huyết áp, hỗ trợ điều trị ung thư, chữa trị các bệnh về khớp…Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh cây Ngưu tất (Achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật” nhằm nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Ngưu tất trong ống nghiệm.Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-021 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà NộiMục đích và yêu cầuMục đíchNghiên cứu quy trình nhân nhanh và bảo tồn cây Ngưu tất trong ống nghiệm bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.Yêu cầuXác định phương pháp khử trùng mẫu để đưa vào ống nghiệm.Xác định môi trường thích hợp để tạo đa chồi cây Ngưu tất.Xác định môi trường thích hợp để tạo rễ cây Ngưu tất.Xác định giá thể thích hợp để đưa Ngưu tất ra ngoài tự nhiên.Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-022 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà NộiPHẦN 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1. Giới thiệu chung về cây Ngưu tất1.1.1. Đặc điểm sinh họcTên việt nam: Cây Ngưu tấtTên khoa học: Achyranthes bidentata BlumeThuộc họ Giền (Amaranthaceae).Đặc điểm hình thái:Ngưu tất là cây thân thảo, sống lâu năm, cao 60-80 cm, rễ củ hình trụ dài, có nhiều rễ phụ. Thân phình lên ở những đốt, màu lục hoặc nâu tía. Cành mọc gần như thẳng đứng. Lá mọc đối xứng hoặc hình mác. Gốc thuôn hẹp, đầu nhọn dài từ 5-10 cm, rộng từ 1-4 cm, hai mặt nhẵn, gân lá mặt trên thường có màu nâu tía, mép lá uốn lượn, cuống lá dài từ 1-1,5 cm. Cụm hoa là một bông dài từ 2-5 cm, mọc ở ngọn thân và kẽ lá đầu cành, hoa rất nhiều, thường gập xuống sít vào cuống của cụm hoa, sau khi đã nở lá bắc dài 3mm, 5 lá dài, 5 nhị, bầu hình trứng. Hoa mọc hướng lên nhưng khi biến thành quả sẽ mọc quặp xuống. Quả nang, hình bầu dục, chỉ chứa một hạt [29] [30].Cây thường mọc ở Trung Quốc và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Cây Ngưu tất thích hợp gieo trồng ở điều kiện của nước ta và phát triển tốt, được Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------ ----------------------- ĐẶNG NGỌC HÙNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH THÁI NGUYÊN – NĂM 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------ ----------------------- ĐẶNG NGỌC HÙNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: 60.62.60 LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. LÊ ĐÌNH KHẢ THS. ĐOÀN THỊ MAI THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Lời nói đầu Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục hình ảnh Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3 1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp . 3 1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp . 3 1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào 4 1.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật 4 1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào . 4 1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào 6 1.4.1. Môi trường nuôi cấy . 6 1.4.2. Các chất điều hoà sinh trưởng 8 1.4.3. Môi trường vật lý 10 1.4.4. Vật liệu nuôi cấy . 11 1.4.5. Điều kiện vô trùng 11 1.4.6. Buồng nuôi cấy . 12 1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống 12 1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị . 12 1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động . 13 1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh 13 1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ) 14 1.5.5. Đưa cây ra môi trường tự nhiên . 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.6. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn liễu (E. exserta) . 16 1.6.1. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) . 16 1.6.2. Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta) 17 1.6.3. Bạch đàn lai 17 1.6.4. Nhân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------------------------------ Nguyễn Minh Quế ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU DẺ VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN DẺ TRÙNG KHÁNH - CAO BẰNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------------------------------ Nguyễn Minh Quế ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU DẺ VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN DẺ TRÙNG KHÁNH - CAO BẰNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ TÂM Thái Nguyên, năm 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để có được kết quả này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, chân thành đến cô giáo - TS Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin gửi lời cảm ơn các kỹ thuật viên phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng Di truyền - Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN và khoa Sau đại học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của gia đình và các bạn bè đồng nghiệp. Mặc dù có nhiều cố gắng, song không tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các quý thầy cô và các bạn. Thái Nguyên, ngày 25 tháng 08 năm 2009 Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi, các số liệu trong công trình này là hoàn toàn trung thực, chính xác. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về những kết quả này. Tác giả Nguyễn Minh Quế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm hình thái và hệ thống phân loại dẻ 1.2. Vai trò của cây dẻ 1.3. Một số thành tựu của nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong nhân Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của ngành Công nghệ sinh học hiện đại. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được thực hiện ở nước ta từ những năm 1960 tại miền Nam và đầu những năm 1970 tại miền Bắc. Tuy nhiên chỉ những cuối năm 1980 trở lại đây, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mới phát triển mạnh mẽ và được đưa vào ứng dụng. Trong đó kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kĩ thuât chính. Những thành công của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, trong đó có bảo tồn ex situ những nguồn gen quý hiếm. Kĩ thuật nuôi cấy mô cho phép chúng ta nhân nhanh một lượng lớn cây giống trong ống nghiệm mà chỉ cần số lượng mẫu ít (thậm chí chỉ cần một chồi). Ngoài ra, kĩ thuật nhân nhanh trong ống nghiệm nhằm tạo ra một quần thể cây con có chất lượng đồng đều về mặt di truyền. Hiện nay, cây Ngưu tất được trồng và mọc chủ yếu ở Sapa, Tam Đảo, Hà Nội . Do chúng được sử dụng khá phổ biến trong y học cổ truyền với nhu cầu ngày càng tăng như: làm giảm cholesterol trong máu, hạ huyết áp, hỗ trợ điều trị ung thư, chữa trị các bệnh về khớp… Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh cây Ngưu tất (Achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật” nhằm nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Ngưu tất trong ống nghiệm. Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-02 1 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Mục đích và yêu cầu Mục đích Nghiên cứu quy trình nhân nhanh và bảo tồn cây Ngưu tất trong ống nghiệm bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Yêu cầu Xác định phương pháp khử trùng mẫu để đưa vào ống nghiệm. Xác định môi trường thích hợp để tạo đa chồi cây Ngưu tất. Xác định môi trường thích hợp để tạo rễ cây Ngưu tất. Xác định giá thể thích hợp để đưa Ngưu tất ra ngoài tự nhiên. Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-02 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Ngưu tất 1.1.1. Đặc điểm sinh học Tên việt nam: Cây Ngưu tất Tên khoa học: Achyranthes bidentata Blume Thuộc họ Giền (Amaranthaceae). Đặc điểm hình thái: Ngưu tất là cây thân thảo, sống lâu năm, cao 60-80 cm, rễ củ hình trụ dài, có nhiều rễ phụ. Thân phình lên ở những đốt, màu lục hoặc nâu tía. Cành mọc gần như thẳng đứng. Lá mọc đối xứng hoặc hình mác. Gốc thuôn hẹp, đầu nhọn dài từ 5-10 cm, rộng từ 1-4 cm, hai mặt nhẵn, gân lá mặt trên thường có màu nâu tía, mép lá uốn lượn, cuống lá dài từ 1-1,5 cm. Cụm hoa là một bông dài từ 2-5 cm, mọc ở ngọn thân và kẽ lá đầu cành, hoa rất nhiều, thường gập xuống sít vào cuống của cụm hoa, sau khi đã nở lá bắc dài 3mm, 5 lá dài, 5 nhị, bầu hình trứng. Hoa mọc ... nước +Xử lý dung dịch xà phòng, lắc + Xử lý dung dịch khử trùng chất hóa học Calcium hypochlrorite, clorua thủy ngân Tạo thể nhân giống in vitro  Cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy ( Agar, ½ MS