CHƯƠNG TRÌNH CHỐNG LAO QUỐC GIA BÖnh viÖn lao vµ bÖnh phæi -@ CÔNG TÁC XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN TRONG CHƯƠNG TRÌNH CHỐNG LAO QUỐC GIA NGHỆ AN NĂM 2016 Mục lục: Xét nghiệm AFB nhuộm soi trực tiếp - phương pháp nhuộm ZN Xét nghiệm AFB nhuộm soi trực tiếp – phương pháp nhuộm huỳnh quang Nuôi cấy vi khuẩn lao môi trường đặc Nuôi cấy vi khuẩn lao môi trường lỏng Xét nghiệm sinh học phân tử Genexpert Hướng dẫn lấy đờm làm xét nghiệm Qui trình đóng gói ba lớp XÉT NGHIỆM AFB NHUỘM SOI TRỰC TIẾP PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ZIEHL – NEELSEN Mục đích Mô tả kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp tìm AFB (Acid –Fast- Bacilli) theo phương pháp nhuộm Ziehl- Neelsen (ZN) sử dụng kính hiển vi quang học Chuẩn bị Bệnh phẩm - Bệnh phẩm đờm đạt chất lượng: có nhày mủ, thể tích mẫu ml Đờm nhày Đờm mủ Có máu Nước bọt - Cặn bệnh phẩm sau ly tâm - Khuẩn lạc mọc môi trường đặc - Canh khuẩn từ tuýp MGIT (+) Yêu cầu hành - Mẫu phải đựng cốc/tuýp theo qui định - Mẫu phải đầy đủ thông tin thân dụng cụ chứa mẫu - Phiếu XN phải đủ thông tin người bệnh - Thông tin mẫu phiếu xét nghiệm phải phù hợp Trang thiết bị dụng cụ Chuẩn bị hóa chất nhuộm ZN - Dung dịch nhuộm màu Ziehl’s Carbol Fuchsin 0,3% - Dung dịch tẩy màu cồn acid HCl 3% - Dung dịch nhuộm xanh Methylen 0,3% 3 Nguyên lý Mycobacteria (trong có vi khuẩn lao) có lớp vách sáp dày nên khó bắt màu với thuốc nhuộm thông thường có tính kháng cồn - acid Phương pháp nhuộm Ziehl thuốc nhuộm có chứa phenol hơ nóng nhuộm nên fuchsin ngấm qua lớp vách vi khuẩn, tẩy màu dung dịch cồn-acid 3%, AFB giữ màu đỏ Fuchsin tế bào vi khuẩn khác bị tẩy màu đỏ, bước nhuộm tạo tương phản AFB màu đỏ màu xanh sáng Các bước thực 4.1Chuẩn bị - Sử dụng lam kính mới, vết xước mốc, lau cồn 950 làm khô - Cập nhật thông tin bệnh nhân vào sổ xét nghiệm trước thực kỹ thuật - Số xét nghiệm thống từ sổ xét nghiệm, phiếu xét nghiệm, cốc đờm lam kính Số xét nghiệm gồm phần: tử số số thứ tự sổ xét nghiệm, mẫu số số thứ tự mẫu (Ví dụ: 120/1, 120/2) Đối chiếu kiểm tra thông tin cẩn thận tránh nhầm lẫn Số xét nghiệm theo thứ tự từ đầu năm đến cuối năm - Dùng bút chì đen HB viết số xét nghiệm lên đầu mờ lam kính Không chạm tay vào phần lam kính lại - Sắp xếp cốc đờm lam kính theo thứ tự tránh nhầm lẫn - Khởi động tủ ATSH trước sử dụng 15 phút để lọc khí - Sắp xếp dụng cụ/vật liệu cần thiết vào tủ ATSH: máy sấy tiêu (bật máy 50-600C), que dàn tiêu bản, bô can chứa chất sát khuẩn, giá đựng tiêu bản, khay có lót khăn, giấy thấm dung dịch sát khuẩn, lam kính cốc đờm 4.2 Dàn tiêu 4.3 Cố định tiêu - Hơ nóng tiêu qua lửa gaz (đèn cồn) lần lần khoảng giây (mặt tiêu ngửa lên trên) 4.4 Nhuộm tiêu bản: bước Bước 1: Nhuộm màu cm - Xếp tiêu theo thứ tự giá nhuộm, tiêu cách Phủ dung dịch Fuchsin 0,3% kín toàn bề mặt tiêu Hơ nóng tiêu từ phía đến Fuchsin bốc Để phút Nếu Fuchsin tràn ngoài, bổ sung thêm Fuchsin hơ nóng lại Rửa tiêu nhẹ nhàng cho trôi hết thuốc nhuộm Nghiêng tiêu cho nước Bước 2: Tẩy màu - Phủ đầy dung dịch acid - cồn lên tiêu bản, để phút Rửa nước Nghiêng tiêu cho nước Sau rửa, tiêu không màu hồng Nếu tiêu màu hồng, tẩy lại lần 2, thời gian từ – phút hết màu hồng, rửa lại nước Bước 3: Nhuộm - Phủ đầy dung dịch xanh Methylene 0,3% lên tiêu Để 30 giây - phút Rửa nước, nghiêng tiêu cho nước Chú ý: cho vòi nước chảy nhẹ nhàng từ đầu tiêu KHÔNG xối vòi nước thẳng vào vết dàn 4.5 Làm khô tiêu - Xếp tiêu lên giá để khô tự nhiên, máy sấy tiêu Chú ý: KHÔNG làm khô tiêu cách hơ tiêu qua lửa hay dùng khăn giấy để thấm khô 4.6 Đọc tiêu 4.7 Nhận định kết Hình ảnh AFB từ bệnh phẩm: AFB có hình que mảnh, cong, bắt màu đỏ, đứng riêng biệt hay xếp thành cụm, dễ nhận biết trền xanh Đếm số lượng AFB ghi kết theo qui định Bảng XÉT NGHIỆM AFB NHUỘM SOI TRỰC TIẾP PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HUỲNH QUANG ĐÈN LED Mô tả kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp tìm AFB (Acid –Fast- Bacilli) theo phương pháp nhuộm huỳnh quang sử dụng kính huỳnh quang đèn LED Bệnh phẩm Đờm cặn bệnh phẩm sau li tâm (không nhuộm huỳnh quang chủng vi khuẩn) Trang thiết bị vật liệu Giống phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen Thay KHV quang học KHV huỳnh quang đèn LED Nguyên lý Mycobacteria có lớp vách sáp dày, nhuộm Auramine thấm vào vi khuẩn có phenol dung dịch nhuộm, tẩy màu dung dịch acidcồn AFB giữ màu vàng auramine có tính kháng acid, nhuộm xanh methylene để tạo màu tối, cho ánh sáng phát quang Khi soi ánh sáng huỳnh quang AFB phát quang màu vàng sáng tương phản rõ ràng tối Kính hiển vi huỳnh quang có ưu điểm soi nhanh KHV quang học (ánh sáng trắng) với nhuộm Ziehl – Neelsen đặc biệt có giá trị phòng xét nghiệm có khối lượng công việc lớn Kĩ thuật có độ nhạy cao mẫu bệnh phẩm vi khuẩn số vi trường quan sát nhiều Hình ảnh AFB tiêu nhuộm huỳnh quang NUÔI CẤY VI KHUẨN LAO TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC Vi khuẩn lao có khả phát triển môi trường đặc tạo thành khuẩn lạc nhìn thấy mắt thường Dựa vào thời gian mọc, hình thể, tính chất khuẩn lạc, tính kháng acid tính chất sinh vật hóa học để định danh M.tuberculosis Tính chất khuẩn lạc - Khuẩn lạc M.tu berculisis điển hình dạng khô sù xì giống xúp lơ,màu trắng ngà,mọc chậm sau 07 ngày - Khuẩn lạc nhóm Mycobacteria lao (NTM) dạng S trơn bóng, nhày, có (hoặc không) sắc tố, mọc nhanh vòng ngày Hình ảnh khuẩn lạc MTB Hình ảnh khuẩn lạc số loài NTM NUÔI CẤY VI KHUẨN LAO TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG Vi khuẩn lao có khả phát triển môi trường lỏng tạo thành hạt vụn nhìn thấy mắt thường phát hệ thống máy nuôi cấy tự động Thời gian cho kết dương tính từ – 14 ngày tùy thuộc số lượng vi khuẩn có mẫu lâm sàng Nguyên lý: Một hợp chất phát quang nhạy cảm với oxy gắn vào lớp silicon đáy tuýp môi trường Lượng oxy hòa tan môi trường làm mờ phát quang phát quang Khi vi khuẩn sinh trưởng tiêu thụ oxy, hợp chất phát quang thoát ức chế phát quang, mức độ phát quang tương ứng với mật độ vi khuẩn có môi trường, máy báo dương mật độ vi khuẩn tuýp khoảng 105 đến 106 / 1ml Máy BATEC báo kết tự động 60 phút /lần bằng tín hiệu đèn sáng âm thanh: Hình ảnh tuýp MGIT dương Hình ảnh tiêu nhuộm ZN từ tuýp MGIT (+) AFB cuộn thừng AFB vụn Nhiễm vi khuẩn AFB kết thành đám 10 XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN LAO VÀ ĐỘT BIẾN KHÁNG RIFAMPICIN TRÊN GENEXPERT MTB/RIF GeneXpert MTB/RIF (Cepheid, Sunnyvale, California) hệ thống đóng, tự động hoàn toàn nhằm xác định vi khuẩn lao gen kháng Rifampicin trực tiếp từ bệnh phẩm Trong có phận (Cartridge) chứa tất bước từ tách chiết DNA, chạy phản ứng nhân gen đặc hiệu (PCR) vi khuẩn lao đột biến kháng thuốc rifampicin từ mẫu bệnh phẩm sau thời gian tiếng Máy trả kết kép: kết cho biết bệnh phẩm có vi khuẩn lao hay không vi khuẩn lao có kháng thuốc rifampicin hay không Quy định loại bệnh phẩm Thực thường quy xét nghiệm Xpert MTB/RIF áp dụng với bệnh phẩm đờm Các loại bệnh phẩm khác áp dụng nghiên cứu đánh giá Quy định chất lượng số lượng bệnh phẩm - Bệnh phẩm đờm tích tối thiểu 1ml, tối đa 3ml có chất nhầy mủ, không lẫn dị vật (máu, mảnh vụn thức ăn, đất, ) - Bệnh phẩm chứa tuýp 50ml, vặn chặt nắp - Tuýp bệnh phẩm ghi đầy đủ thông tin theo quy định lấy mẫu (sổ tay lấy mẫu) 11 HƯỚNG DẪN LẤY ĐỜM LÀM XÉT NGHIỆM Vật liệu: - Xét nghiệm trực tiếp: Cốc nhựa sạch, miệng rộng, nắp xoáy, nhựa dẻo, cứng, khó vỡ, dễ thiêu hủy.- Bút (loại chịu nước) Nơi lấy đờm: - Có khu vực riêng cho người bệnh lấy đờm: + Lấy trời nơi thoáng khí, người qua lại + Hoặc xây buồng lấy đờm đảm bảo thông khí tính riêng tư cho người bệnh - Có bảng hướng dẫn lấy đờm hình ảnh minh họa - Có bồn rửa tay Số lượng mẫu thời điểm lấy đờm - Xét nghiệm phát hiện: Để chẩn đoán bệnh lao phổi cần lấy mẫu đờm chỗ: mẫu lấy sau khám bệnh, mẫu sau mẫu khoảng Nếu người bệnh có điều kiện thuận lợi lấy mẫu đờm buổi sáng để xét nghiệm tốt - Xét nghiệm theo dõi: Mỗi lần xét nghiệm theo dõi lấy mẫu đờm buổi sáng thời điểm xét nghiệm đờm theo dõi tuỳ thuộc vào công thức điều trị định thầy thuốc Hướng dẫn lấy đờm - Phát cho người bệnh cốc đựng đờm ghi đủ thông tin vào thân cốc đờm - Giải thích cho người bệnh mục đích lấy đờm, lấy đờm trước điều trị tốt - Hướng dẫn cách khạc đờm đạt chất lượng, cách mở đậy nắp cốc đờm dẫn người bệnh tới nơi qui định lấy đờm - Hướng dẫn người bệnh cách lấy đờm: + Súc miệng nước thường trước lấy đờm + Hít vào thật sâu, thở thật mạnh Làm – lần + Ho khạc đờm sâu từ lồng ngực + Mở nắp cốc đờm đưa lại gần miệng, nhổ đờm vào cốc 12 + Đậy nắp cốc đờm, xoáy chặt nắp - Trường hợp khó khạc đờm hỗ trợ cách vỗ rung, uống thuốc long đờm khí dung nước muối ấm - Xét nghiệm viên điều dưỡng viên phải kiểm tra chất lượng mẫu đờm, có nước bọt, số lượng ít, yêu cầu người bệnh ho khạc thêm đến lấy mẫu đảm bảo chất lượng Lưu ý: Tiêu chuẩn mẫu đờm đạt chất lượng + Số lượng đờm 3-5 ml + Có nhày mủ + Không lẫn thức 13 HƯỚNG DẪN LẤY ĐỜM LÀM XÉT NGHIỆM Không khạc đờm từ mũi miệng Vặn chặt nắp Hít vào thật sâu Thở thật mạnh Hít vào thật sâu, thở thật mạnh (lần 2) Hít sâu, thở mạnh lần 3, ho khạc thật sâu từ phổi Đặt cốc đờm (đã mở nắp) vào sát miệng, nhổ đờm vào đáy cốc Vặn chặt nắp Nộp cốc đờm phiếu xét nghiệm cho người hướng dẫn (NVYT) Không đặt cốc đờm lên phiếu xét nghiệm Lưu ý: Nếu lượng đờm (< 2ml) chất nhày mủ, làm lại bước để có mẫu đờm đạt chất lượng Đờm tốt chẩn đoán bệnh xác! 14 QUI TRÌNH ĐÓNG GÓI BA LỚP Thực thao tác đóng gói tủ an toàn sinh học + Lớp thứ (tuýp chứa mẫu): tuýp nhựa loại 50ml chứa đờm tuýp chủng vi khuẩn (nuôi cấy đặc lỏng) + Gói tuýp mẫu giấy vệ sinh để làm lớp đệm thấm hút có rò rỉ mẫu + Gói tiếp bên màng nilon mỏng + Cho tiếp vào túi nilon dày có khóa (lớp thứ hai) Khóa chặt túi nilon buộc bên chun vòng + Cho gói mẫu vào hộp vận chuyển mẫu (lớp thứ ba) Hộp vận chuyển mẫu hộp lạnh hộp xốp có túi đá lạnh (nếu vận chuyển mẫu bệnh phẩm cho nuôi cấy) + Cho phiếu xét nghiệm danh sách vận chuyển mẫu vào túi nilon kín đặt vào hộp vận chuyển mẫu, đóng kín hộp, dán băng dính kín + Dán nhãn (ghi đủ thông tin nơi gửi nhận) Dán nhãn cảnh báo cần thiết Sơ đồ đóng gói lớp Lớp thứ nhất: Tuýp đựng đờm chủng nuôi cấy Lớp vật liệu thấm hút Màng nilon mỏng Lớp thứ hai: Túi nilon dày loại có khóa Lớp thứ ba: Hộp lạnh hộp xốp 15 Hình ảnh mô tả bước đóng gói mẫu Đóng gói tuýp đựng đờm Đóng gói tuýp chủng nuôi cấy Gói lớp thứ giấy vệ sinh Bao gói màng nilon mỏng Cho vào túi nilon dày loại có khóa 16 Khóa chặt túi nilon buộc bên chun, vòng Cho đứng mẫu vào hộp vận chuyển mẫu Đặt Phiếu xét nghiệm danh sách mẫu vào túi nilon có khóa, cho vào hộp vận chuyển mẫu, đóng kín hộp Dán nhãn ghi rõ địa nơi gửi, nơi nhận nhãn cảnh báo cần thiết 17 18 ... thời gian mọc, hình thể, tính chất khuẩn lạc, tính kháng acid tính chất sinh vật hóa học để định danh M.tuberculosis Tính chất khuẩn lạc - Khuẩn lạc M.tu berculisis điển hình dạng khô sù xì giống... lạnh hộp xốp có túi đá lạnh (nếu vận chuyển mẫu bệnh phẩm cho nuôi cấy) + Cho phiếu xét nghiệm danh sách vận chuyển mẫu vào túi nilon kín đặt vào hộp vận chuyển mẫu, đóng kín hộp, dán băng dính... Khóa chặt túi nilon buộc bên chun, vòng Cho đứng mẫu vào hộp vận chuyển mẫu Đặt Phiếu xét nghiệm danh sách mẫu vào túi nilon có khóa, cho vào hộp vận chuyển mẫu, đóng kín hộp Dán nhãn ghi rõ địa