Đang tải... (xem toàn văn)
Virút gây bệnh còi (MBV) là một trong những virút được xếp vào danh sách các tác nhân gây bệnh đứng thứ 2 trên tôm. MBV gây chết ở giai đoạn cuối của tôm postlarval (tỉ lệ chết hơn 90%) và giai đoạn juvenile (tỉ lệ chết hơn 70%). Cho đến nay, công tác phòng bệnh vẫn là biện pháp hiệu quả nhất để hạn chế thiệt hại do bệnh còi. Trong đó việc thả nuôi tôm giống sạch bệnh là điều cần thiết. Do đó, cần có quy trình chẩn đoán giúp phát hiện MBV ở giai đoạn bệnh chưa tiến triển trên tôm giống và tôm nhằm phát triển công tác sản xuất giống sạch bệnh cũng như hỗ trợ cho công tác phòng ngừa dịch bệnh. Trong đề tài này, các mẫu gan tôm sú và mẫu tôm post được tiến hành ly trích và chạy PCR. Kết quả ly trích mẫu gan tôm cho thấy, DNA tổng số xuất hiện rõ và đồng đều ở các mẫu, tuy nhiên băng di vẫn còn smear, do lượng DNA bị đứt gãy và protein chưa được loại bỏ hoàn toàn. Kết hợp đo OD để kiểm tra độ tinh sạch của DNA ly trích. Mẫu tôm post nhiễm MBV cũng được tiến hành ly trích DNA và chạy PCR, mẫu DNA ương tính với MBV cũng được giải trình tự và kết quả giải trình tự cũng cho thấy quy trình PCR được khảo sát có khả năng phát hiện chính xác MBV trên mẫu tôm bệnh. Trong nghiên cứu này quy trình ly trích DNA từ mẫu gan tôm sú, mẫu tôm post và quy trình PCR đã được xây dựng thành công và có thể ứng dụng trong chẩn đoán bệnh còi.iii SUMMARY The virus causes scurvy (MBV) is one of the viruses classified in the list of pathogens No. 2 on the shrimp. MBV lethal in the final stages of postlarval shrimp (90% mortality) and juvenile stages (70% mortality). So far, disease prevention is still the most effective measures to limit damage caused by scurvy. In this work stocking Pathogen is essential. Therefore, there should be procedures to help detect MBV diagnosed in advanced stage of the disease not on shrimp and shrimp to the development of diseasefree seed production as well as support for the prevention of the disease. In this subject, the liver sample prawn and DNAs were conducted post extraction and PCR. Results shrimp extracted liver samples showed that total DNA appeared clear and uniform in the sample, but still portable tape smear, due to the fault of DNA and protein is not completely eliminated. Combining OD measurements to check the purity of extracted DNA. Post MBV infected shrimp samples were carried out DNA extraction and PCR, DNA samples were also run computer with MBV sequencing and sequencing results also showed that the PCR process is surveyed accurately detect MBV on shrimp samples. In this study the process of DNA extraction from liver samples prawn, shrimp samples and post PCR process has been successfully developed and can be applied in the diagnosis of scurvy. Key word: PCR, Monodon baculovius, diagnosis.iv MỤC LỤC Lời cám ơn ........................................................................................................................... i Tóm tắt ................................................................................................................................ ii Summary............................................................................................................................ iii Mục lục .............................................................................................................................. iv Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................. v Danh sách các bảng ........................................................................................................... vi Danh sách các hình ............................................................................................................vi Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề..................................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu ........................................................................................................................2 1.3 Nội dung thực hiện ....................................................................................................... 2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 3 2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam ................................................................................... 3 2.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm và tác hại của nó ........................................................... 6 2.3 Một số bệnh phổ biến trên tôm sú ................................................................................ 6 2.3.1.Bệnh đốm trắng – WSSV (White Spot Baculo Virút) ............................................. 6 2.3.2. Bệnh đầu vàng – (Yellow head diseases) ................................................................. 7 2.3.3. Bệnh đỏ toàn thân ..................................................................................................... 7 2.3.4. Hội chứng taura ........................................................................................................ 7 2.4 Bệnh còi trên tôm ........................................................................................................ 8 2.4.1. Tác nhân gây bệnh .................................................................................................... 9 2.4.2. Dấu hiệu bệnh lý ....................................................................................................... 9 2.4.3. Phân bố ................................................................................................................... 10 2.4.4. Loài và giai đoạn cảm nhiễm ................................................................................. 10 2.4.5. Phương thức lây nhiễm ........................................................................................... 10 2.4.6. Chẩn đoán bệnh ...................................................................................................... 10 2.4.6.1 Dự chuẩn .............................................................................................................. 10v 2.4.6.2 Kiểm khẳng định .................................................................................................. 11 2.4.7 Các biện pháp kiểm soát bệnh ................................................................................. 12 2.5 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ..................................................... 12 2.6. Phương pháp phân tích định tính và định lượng thô nucleic acid ............................. 13 2.6.1 Phương pháp điện di DNA trên gel ......................................................................... 13 2.6.2 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế.......................................................... 13 2.7 Giải trình tự DNA ....................................................................................................... 13 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 15 3.2 Vật liệu và hóa chất .................................................................................................... 15 3.2.1 Vật liệu .................................................................................................................... 15 3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................... 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 16 3.3.1 Thu mẫu và bảo quản mẫu ...................................................................................... 16 3.3.2. Phương pháp ly trích DNA ..................................................................................... 16 3.3.3. Phương pháp PCR xác định tôm nhiễm MBV ....................................................... 17 3.3.4. Phương pháp đo OD ............................................................................................... 18 3.3.5 Giải trình tự sản phẩm PCR được khuếch đại ......................................................... 18 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả ly trích DNA từ mẫu tôm .............................................................................. 29 4.2 Xây dựng quy trình PCR có khả năng phát hiện virút MBV trên tôm sú. ................ 20 4.3 Ứng dụng quy trình phát hiện virút MBV trên mẫu tôm post thu thập được ........... 22 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận ...................................................................................................................... 24 5.2 Đề nghị ....................................................................................................................... 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 25 PHỤ LỤC
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI-RÚT GÂY BỆNH CÒI (Monodon baculovirus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT PCR Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : BÁO THỊ XUÂN HƯƠNG Niên khóa : 2009 – 2013 Tháng 06/2013 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI-RÚT MBV GÂY BỆNH CÒI (Monodon baculovius) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS LÊ ĐÌNH ĐÔN BÁO THỊ XUÂN HƯƠNG KS HUỲNH ĐĂNG SANG Tháng 06/2013 ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học toàn thể thầy cô truyền đạt kiến thức cho suốt trình học trường PGS TS Lê Đình Đôn giúp đỡ trình làm thực tập tốt nghiệp KS Huỳnh Đăng Sang tạo điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ trình thực tập Viện Công Nghệ Sinh học Môi trường – Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Chị Lê Tố Trâm (Sở Nông nghiệp Phát triển nông thôn tỉnh Cà Mau), giúp đỡ thời gian lấy mẫu Cà Mau Các em Hồ Thị Bích Trâm - lớp Công nghệ Sinh học khóa 36 giúp suốt trình thực tập Bạn bè thân yêu lớp Công nghệ Sinh học khóa 35 chia sẻ vui buồn hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên suốt năm qua Thành kính ghi nhớ công ơn cha mẹ người thân gia đình chỗ dựa vững cho con, động viên, khuyến khích, tạo điều kiện cho học tập tốt Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013 Sinh viên thực Báo Thị Xuân Hương i TÓM TẮT Vi-rút gây bệnh còi (MBV) vi-rút xếp vào danh sách tác nhân gây bệnh đứng thứ tôm MBV gây chết giai đoạn cuối tôm postlarval (tỉ lệ chết 90%) giai đoạn juvenile (tỉ lệ chết 70%) Cho đến nay, công tác phòng bệnh biện pháp hiệu để hạn chế thiệt hại bệnh còi Trong việc thả nuôi tôm giống bệnh điều cần thiết Do đó, cần có quy trình chẩn đoán giúp phát MBV giai đoạn bệnh chưa tiến triển tôm giống tôm nhằm phát triển công tác sản xuất giống bệnh hỗ trợ cho công tác phòng ngừa dịch bệnh Trong đề tài này, mẫu gan tôm sú mẫu tôm post tiến hành ly trích chạy PCR Kết ly trích mẫu gan tôm cho thấy, DNA tổng số xuất rõ đồng mẫu, nhiên băng di smear, lượng DNA bị đứt gãy protein chưa loại bỏ hoàn toàn Kết hợp đo OD để kiểm tra độ tinh DNA ly trích Mẫu tôm post nhiễm MBV tiến hành ly trích DNA chạy PCR, mẫu DNA ương tính với MBV giải trình tự kết giải trình tự cho thấy quy trình PCR khảo sát có khả phát xác MBV mẫu tôm bệnh Trong nghiên cứu quy trình ly trích DNA từ mẫu gan tôm sú, mẫu tôm post quy trình PCR xây dựng thành công ứng dụng chẩn đoán bệnh còi ii SUMMARY The virus causes scurvy (MBV) is one of the viruses classified in the list of pathogens No on the shrimp MBV lethal in the final stages of postlarval shrimp (90% mortality) and juvenile stages (70% mortality) So far, disease prevention is still the most effective measures to limit damage caused by scurvy In this work stocking Pathogen is essential Therefore, there should be procedures to help detect MBV diagnosed in advanced stage of the disease not on shrimp and shrimp to the development of diseasefree seed production as well as support for the prevention of the disease In this subject, the liver sample prawn and DNAs were conducted post extraction and PCR Results shrimp extracted liver samples showed that total DNA appeared clear and uniform in the sample, but still portable tape smear, due to the fault of DNA and protein is not completely eliminated Combining OD measurements to check the purity of extracted DNA Post MBV infected shrimp samples were carried out DNA extraction and PCR, DNA samples were also run computer with MBV sequencing and sequencing results also showed that the PCR process is surveyed accurately detect MBV on shrimp samples In this study the process of DNA extraction from liver samples prawn, shrimp samples and post PCR process has been successfully developed and can be applied in the diagnosis of scurvy Key word: PCR, Monodon baculovius, diagnosis iii MỤC LỤC Lời cám ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt v Danh sách bảng vi Danh sách hình vi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm Việt Nam 2.2 Tình hình dịch bệnh tôm tác hại 2.3 Một số bệnh phổ biến tôm sú 2.3.1.Bệnh đốm trắng – WSSV (White Spot Baculo Vi-rút) 2.3.2 Bệnh đầu vàng – (Yellow head diseases) 2.3.3 Bệnh đỏ toàn thân 2.3.4 Hội chứng taura 2.4 Bệnh còi tôm 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý 2.4.3 Phân bố 10 2.4.4 Loài giai đoạn cảm nhiễm 10 2.4.5 Phương thức lây nhiễm 10 2.4.6 Chẩn đoán bệnh 10 2.4.6.1 Dự chuẩn 10 iv 2.4.6.2 Kiểm khẳng định 11 2.4.7 Các biện pháp kiểm soát bệnh 12 2.5 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) 12 2.6 Phương pháp phân tích định tính định lượng thô nucleic acid 13 2.6.1 Phương pháp điện di DNA gel 13 2.6.2 Phương pháp định lượng quang phổ kế 13 2.7 Giải trình tự DNA 13 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 3.2 Vật liệu hóa chất 15 3.2.1 Vật liệu 15 3.2.2 Hóa chất 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Thu mẫu bảo quản mẫu 16 3.3.2 Phương pháp ly trích DNA 16 3.3.3 Phương pháp PCR xác định tôm nhiễm MBV 17 3.3.4 Phương pháp đo OD 18 3.3.5 Giải trình tự sản phẩm PCR khuếch đại 18 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết ly trích DNA từ mẫu tôm 29 4.2 Xây dựng quy trình PCR có khả phát vi-rút MBV tôm sú 20 4.3 Ứng dụng quy trình phát vi-rút MBV mẫu tôm post thu thập 22 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 24 5.2 Đề nghị 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp base pair Ctv Cộng tác viên DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucletide triphosphate ĐBSCL Đồng sông Cửu Long EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid HPV Hepatopanceatic parvovi-rút IMNV Infectiuos meonecrosis virus IHHNV Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus NTTS Nuôi trồng thủy sản OD Opitical density PCR Polymera chain reaction PCI Phenol: Clochrofrom: Isoamyl alcohol PL Postlarval SDS Sodium Dodecyl Sulfate Taq Thermus aquaticus TBE Tris Borate EDTA TE Tris – EDTA TSV Taura syndrome virus UV Ultraviolet radiation V Volt (đơn vị hiệu điện thế) YHV Yellow head virus WSSV White Spot Syndrome Virus NTTS Nuôi trồng thủy sản vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi xác định MBV 15 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 17 Bảng 3.3 Chương trình nhiệt PCR 17 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hinh 2.1 Triệu chứng tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn màu xanh sẫm Hinh 2.2 Nguyên tắc PCR 12 Hình 4.1 Tôm nghi ngờ nhiễm MBV 19 Hình 4.2 Kết ly trích DNA tổng số từ mẫu tôm sú .21 Hình 4.3 Kết chạy PCR mẫu DNA tổng số 23 vii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, thủy sản ngành có vai trò quan trọng đem lại hiệu kinh tế đáng kể cho đất nước Với tổng sản lượng thủy sản năm 2012 ước đạt 5.745 ngàn tấn, tăng 5,1% so với năm 2011, đó: sản lượng thủy sản khai thác ước đạt 2.633 ngàn tấn, tăng 3,9%; sản lượng nuôi trồng thủy sản ước đạt 3.112 ngàn tấn, tăng 6,2% kì năm 2011 (Theo thông tin từ Ngành Nông nghiệp Phát triển Nông Thôn thống kê năm 2012) Tuy nhiên, nghề nuôi tôm phát triển dịch bệnh xảy ngày nhiều bệnh vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV), hội chứng Taura (TSV), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử gan tụy (HPV), bệnh còi (MBV), bệnh hoại tử cơ/ đục (IMNV), bệnh hoại tử quan tạo máu quan biểu mô (IHHNV) Cơ quan Quốc tế Dịch bệnh Động vật (năm 2003) xếp MBV vào danh sách tác nhân gây bệnh đứng thứ tôm, vi-rút thường gây bệnh tôm sú giai đoạn tôm ấu trùng (hatchery-reared larval), tôm hậu ấu trùng (postlarval) tôm lớn (juvenile) Bệnh còi không gây chết tôm ạt làm cho tôm chậm lớn MBV gây chết giai đoạn cuối tôm postlarval (tỉ lệ chết 90%) giai đoạn juvenile (tỉ lệ chết 70%) (Thông tin từ Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh), tôm bố mẹ trưởng thành mang vi-rút truyền sang tôm ấu trùng Việc sử dụng đàn tôm giống mang sẵn tác nhân gây bệnh nguyên nhân quan trọng làm bùng phát dịch bệnh còi Hiện chưa có thuốc đặc hiệu để trị bệnh nên công tác phòng ngừa tổng hợp bao gồm tẩy trùng ao nuôi, ngăn cản xâm nhập vi sinh vật mang mầm bệnh vào ao nuôi sử dụng tôm giống bệnh khuyến cáo biện pháp an toàn sinh học (Escobedo Bonilla, 2008) Vì thế, nhu cầu kiểm tra tôm bố mẹ, tôm giống vi-rút gây bệnh còi trước thả nuôi vấn đề quan trọng nhằm hạn chế nguy bùng phát dịch bệnh Kỹ thuật PCR biết đến phương pháp có độ nhạy, độ xác cao thời gian phát nhanh Đề tài: “Nghiên cứu phát vi-rút gây bệnh còi (Monodon baculovirus) tôm sú (Penaeus monodon) PCR” 2.6 Phương pháp phân tích định tính định lượng thô nucleic acid Sau thu nhận nucleic acid dạng sạch, người ta tiến hành phân tích định tính định lượng chúng số phương pháp như: phương pháp điện di DNA gel, phương pháp định lượng quang phổ kế 2.6.1 Phương pháp điện di DNA gel Điện di kỹ thuật để tách định lượng acid nucleic với kích thước hàm lượng khác Kỹ thuật dựa đặc tính acid nucleic đại phân tử tích điện âm có mặt gốc PO43- bề mặt Do đó, acid nucleic điện trường với cường độ dòng điện hiệu điện thích hợp, chúng di chuyển dần phía cực dương đoạn DNA có kích thước lớn di chuyển chậm so với đoạn DNA có kích thước nhỏ, nhờ mà đoạn DNA có kích thước khác phân tách tạo băng DNA khác gel Gel sử dụng kỹ thuật điện di gel agarose (với phân tử DNA có kích thước lớn) polyacryamid (các phân tử DNA có kích thước nhỏ) (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997) 2.6.2 Phương pháp định lượng quang phổ kế Nguyên tắc phương pháp dựa vào hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm (OD260nm – Optical Density260nm) mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid mẫu dựa vào tương quan sau: đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ 50 μg/ml cho dung dịch DNA sợi đội 40 μg/ml cho dung dịch RNA hay DNA sợi đơn Tuy nhiên cách tính với dung dịch nucleic acid Để kiểm tra độ dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD 280 nm (OD280nm) Bước sóng 280 nm bước sóng mà protein có mức hấp thụ cao protein hấp thu ánh sáng bước sóng 260 nm nucleic acid, sai lệch giá trị thật nồng độ nucleic acid Một dung dịch nucleic acid xem tỷ số OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1,8 – (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997) 2.7 Giải trình tự DNA tự động Giải trình tự DNA tự động dựa theo nguyên lý phương pháp dideoxy cải tiến dựa vào thiết bị tự động hóa nhanh xác Máy đọc trình tự hai 13 mạch đơn, phát cảm giác nhầm lẫn kỹ thuật Trong kỹ thuật đánh dấu chất đồng vị phóng xạ mà chất huỳnh quang (fluochrome) Mỗi loại dideoxy nucleotide đánh dấu fluochrome có màu khác Máy giải trình tự phát lúc tượng huỳnh quang bốn độ dài sóng khác (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 1999) Các phương pháp xác định trình tự nucleic acid dựa vào nguyên tắc: nguyên tắc hóa học: dựa vào phương pháp hóa học thủy giải đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau; nguyên tắc enzyme học: dựa vào tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự xác định nhờ DNA polymerase Với việc sử dụng thêm dideoxynucleotide với deoxynucleotide thông thường, kết tổng hợp hình thành tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác Các phân đoạn DNA phân tách qua điện di gel polyacrylamide có khả phân tách hai trình tự DNA chênh nucleotide Việc sử dụng đoạn nucleotide có đánh dấu đồng vị phóng xạ, kết trình tự cần xác định đọc phóng xạ tự ghi từ điện di (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997) 14 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài Thời gian thực đề tài từ tháng 12 năm 2012 đến 05 năm 2013 Mẫu tôm thu thập vùng nuôi bị dịch Việc nghiên cứu phát MBV mẫu tôm nghi ngờ nhiễm thực phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Viên Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường – Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 3.2 3.2.1 Vật liệu hóa chất Vật liệu Mẫu tôm post nhiễm MBV tiếp nhận từ “Trung Tâm Kiểm Tra Chất Lượng Thủy Sản Cà Mau” sử dụng làm đối chứng dương trình nghiên cứu Mẫu tôm thu mua từ số chợ Thành phố Hồ Chí Minh sử dụng để lấy mẫu gan phục vụ cho nghiên cứu quy trình ly trích Tám mẫu tôm post thu thập từ hộ nuôi tôm thuộc huyện Cần Giờ 3.2.2 Hóa chất Hóa chất điện di: Agarose (abm, Mỹ), Ethidiumbromide 10 mg/ml (Sigma, Mỹ), loading dye, thang DNA 1000 bp (abm, Mỹ), dung dịch đệm TBE 10X Hóa chất ly trích DNA: NaCl, EDTA, SDS, TE 10X, Urea, Tris, Phenol: Chlorofrom: isoamyl alcohol, Ethanol 100%, Ethanol 70%, TE buffer Hóa chất PCR (abm, Mỹ) gồm Taq DNA polymerase, PCR buffer 10X, MgCl2 25 mM, Nucleotides 25 mM (dNTPs), nước cất, đoạn mồi 261F 261R Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi sử dụng nghiên cứu (Win ctv, 2005) Đoạn mồi Trình tự Mồi 261F 5’-TCCAATCGCGTCTGCGATACT-3’ Mồi 261R 5’-CGCTAATGGGGCACAAGTCTC-3’ 15 Kích thước sản phẩm 261 bp 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thu mẫu bảo quản mẫu Mẫu tôm post lấy ngẫu nhiên từ hộ nuôi tôm thuộc huyện Cần Giờ Tất mẫu tôm bảo quản cồn 95% cho cồn ngập hết mẫu Ghi tên chủ nuôi, nơi lấy mẫu, thời gian lấy mẫu dán vào hộp đựng mẫu Nếu mẫu không xét nghiệm phải định kỳ thay dung dịch bảo quản mẫu, mẫu bảo quản 4oC 3.3.2 Phương pháp ly trích DNA Trong nghiên cứu này, DNA ly trích từ mẫu gan tôm Sú mẫu tôm post theo quy trình Caipang ctv (2004) chỉnh sửa Quy trình tiến hành sau: Cho mẫu gan tôm vào eppendorf 1,5 ml thêm 500 ml dung dịch đệm ly trích thô DNA (10 mM Tris, 125 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% SDS 4M Urea pH 7,5) Dùng chày vô trùng nghiền cho mẫu đồng Ủ 37oC Thêm 500 μl hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl (PCI) lắc nhẹ, ủ 37oC Ly tâm 9000 vòng 15 phút 4oC Hút dịch vào eppendorf thêm 500 μl hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl (PCI) lắc nhẹ, ủ 37oC Ly tâm 9000 vòng 15 phút 4oC Hút dịch vào eppendorf thêm lượng ethanol tương đương với thể tích dịch vừa hút Ly tâm 9000 vòng 15 phút 4oC Hút bỏ phần dịch lấy phần kết tủa Rửa tủa DNA cồn 70% (1ml) ly tâm 9000 vòng 10 phút 4oC Hút bỏ phần dịch phía để khô tự nhiên Hòa tan DNA kết tủa 30 μl 1X TE buffer (pH 7,5) Nên thực phản ứng PCR sau tách chiết Tuy nhiên giữ mẫu - 20oC thời gian ngắn (khoảng – ngày) 16 Điện di dịch ly trích với gel agarose 1% 80V 20 phút nhuộm với Ethidium Bromide để kiểm tra trình ly trích, xác định diện DNA dịch ly trích thông qua băng DNA tổng số có sau nhuộm gel chụp hình tia UV 3.3.3 Phương pháp PCR xác định tôm nhiễm MBV Quy trình thực dựa theo nghiên cứu Caipang ctv, (2004) Các mẫu tôm post mẫu gan tôm sú sau ly trích dùng làm khuôn mẫu để chạy PCR Các thao tác pha trổn hỗn hợp tiến hành tủ cấy vô trùng Sử dụng găng tay thao tác để giảm tối đa khả tạp nhiễm enzyme không mong muốn từ bàn tay người thao tác lên ống phân tích Mỗi phản ứng gồm thành phần sau: Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ đầu PCR buffer 10 X MgCl2 25 mM dNTP 10 μM Mồi 261F 10 μM Mồi 261R 10 μM Tad DNA polymerase U/ μl DNA mẫu Nước cất Thêm vừa đủ 25μl Bảng 3.3 Chương trình nhiệt chạy PCR Nồng độ cuối 1X 1,5 mM 200 μM 0,3 μM 0,3 μM 0,1 U μl Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ Tiền biến tính 94 phút Biến tính 94 30 giây Bắt cặp 60 30 giây Kéo dài 72 30 giây Kéo dài cuối 72 phút Giai đoạn 35 Kiểm tra kết cách điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5%, thời gian 30 phút Sản phẩm điện di với thang DNA 1000 bp (abm, Mỹ) Kích thước sản phẩm PCR (với cặp mồi 261F 261R) 261 bp 17 3.3.4 Phương pháp đo OD Các mẫu DNA ly trích từ mẫu tôm post mẫu tôm sú đo OD để kiểm tra độ tinh Tỷ số OD260nm/OD280 nằm khoảng 1,8 - (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997) Sau có kết đo OD, chọn mẫu DNA ly trích nằm khoảng từ 1,8 – 2, tiến hành điện di gel agarose 1% 3.3.5 Giải trình tự sản phẩm PCR khuếch đại Sau thực phản ứng PCR với cặp mồi 261F/261R, 15 μl sản phẩm khuếch đại mẫu tôm nghi ngờ nhiễm MBV lấy từ Cần Giờ giải trình tự chiều với cặp mồi 261F/261R công ty Nam Khoa (793/58 Trần Xuân Soạn, quận 7, TP Hồ Chí Minh) Kết giải trình tự xem xử lý phần mềm BioEdit Trình tự DNA so sánh với trình tự khác công bố ngân hàng gen NCBI chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov) để xác định mức độ tương đồng khẳng định sản phẩm khuếch đại trình tự MBV 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ly trích DNA từ mẫu gan tôm DNA tổng số ly trích từ mẫu gan tôm mẫu tôm post theo quy trình Caipang ctv (2004) cải biến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Hình 4.1 Kết ly trích DNA tổng số từ mẫu gan tôm Kết (hình 4.1) cho thấy băng DNA tổng số xuất rõ đồng mẫu, nhiên băng điện di có vệt smear, điều giải thích lượng DNA bị đứt gãy protein tạp chưa loại bỏ hoàn toàn Kết hợp với việc đo OD để kiểm tra độ tinh DNA ly trích, kết đo OD (bảng 4.1, bảng 4.2) thể với số A260/280 đặc trưng lượng protein tạp dịch ly trích A230/260 đặc trưng cho hàm lượng phenol trình ly trích tồn dư, thông qua số cho thấy hầu hết mẫu DNA ly trích tinh sạch, nằm khoảng cho phép (1,8 - số A260/280 xấp xỉ số A260/230) nên dùng làm DNA khuôn mẫu để thực phản ứng PCR Do vậy, quy trình ly trích nghiên cứu có khả áp dụng để thu DNA tổng số phát bệnh tôm MBV Việt Nam 19 Bảng 4.1 Kết đo OD mẫu DNA ly trích từ gan tôm Mẫu Nồng độ DNA OD260 nm/OD280 nm OD260nm/OD230nm 4.700 1,922 2,027 5.855 1,806 1,857 4.288 1,927 2,043 2.501 1,857 1,979 1.377 1,937 1,926 4.987 1,822 1,668 3.575 1,833 1,804 4.166 1,893 1,632 Bảng 4.2 Kết đo OD mẫu DNA ly trích từ tôm post Mẫu Nồng độ DNA OD260nm/OD280nm OD260nm/OD230nm 4.215 1,988 2,087 5.828 1,780 1,407 2.970 2,007 1,755 5.796 1,769 1,459 3.489 2,001 1,673 Tuy nhiên áp dụng số quy trình ly trích khác tối ưu nồng độ chất sử dụng để tăng lượng DNA tăng độ tinh DNA sử dụng phản ứng PCR 4.2 Xây dựng quy trình PCR có khả phát vi-rút MBV tôm sú Mẫu tôm kiểm tra xác định dương tính với MBV sử dụng để xây dựng quy trình PCR phát vi-rút Áp dụng quy trình ly trích nghiên cứu quy trình PCR Win ctv (2005) để phát MBV với cặp mồi 261F 261R DNA mẫu tôm sử dụng làm đối chứng dương 20 261 bp Hình 4.2 Kiểm tra quy trình PCR với mẫu tôm dương tính MBV theo quy trình ly trích DNA cải tiến Giếng thang DNA 1000 bp, giếng mẫu tôm bệnh, giếng đối chứng âm Điện di với gel agarose 1,5% hiệu điện 80 V 30 phút Kết phản ứng PCR với mẫu tôm bệnh cho thấy cặp mồi chu trình nhiệt mà Win thiết kế có khả phát MBV gây bệnh tôm sú Việt Nam Kích thước sản phẩm khuếch đại cặp mồi 261F 261R khoảng 261 bp phù hợp với kích thước sản phẩm PCR nghiên cứu Win Điều cho thấy cặp mồi sử dụng gắn đặc hiệu với DNA vi-rút MBV ly trích từ mẫu tôm bệnh Việt Nam, việc sử dụng cặp mồi 261F 261R chu trình nhiệt Win chẩn đoán phát bệnh MBV kỹ thuật PCR tôm sú Việt Nam có tính khả thi Mẫu DNA dương tính với MBV giải trình tự công ty Nam Khoa kết giải trình tự MBV sau xử lý phần mềm BioEdit BLAST NCBI có tương đồng cao (93%) so với công bố trình tự gen MBV có GenBank AY819785.2 21 4.3 Ứng dụng quy trình phát vi-rút MBV mẫu tôm post thu thập huyện Cần Giờ Áp dụng quy trình phát MBV vừa xây dựng để kiểm tra mẫu tôm post thu thập hộ nuôi thuộc huyện Cần Giờ 22 10 11 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm khuếch đại thực PCR với tám mẫu tôm post lấy từ huyện Cần Giờ Giếng 1: thang DNA 1000 bp; giếng 2: đối chứng dương; giếng 3,4,5,6,7,8, 9, 10 sản phẩm tám mẫu khuếch đại với cặp mồi 261F/261R; giếng 11: đối chứng âm Điện di với gel agarose 1,5% hiệu điện 80 V 35 phút Sau thực phản ứng PCR với quy trình vừa xây dựng Sản phẩm khuếch đại mẫu tôm lấy từ huyện Cần Giờ (hình 4.3) không xuất băng (ở giếng từ – 10) Từ kết luận mẫu thu thập cho kết âm tính với MBV Như vậy, tám mẫu tôm post lấy từ huyện Cần Giờ mẫu tôm bệnh, không mang vi-rút MBV 23 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Quy trình ly trích DNA Caipang ctv (2004) sử dụng để ly trích DNA tôm Việt Nam Quy trình PCR vừa xây dựng phát tôm nhiễm MBV Có thể ứng dụng quy trình ly trích DNA quy trình PCR vừa thiết lập để phát tôm nhiễm MBV Việt Nam 5.2 Đề nghị Tối ưu hóa quy trình nhằm rút ngắn thời gian phản ứng gia tăng độ nhạy Xác định độ nhạy phương pháp PCR Sử dụng quy trình để kiểm tra phát vi-rút gây bệnh MBV tôm giống, tôm bố mẹ, tôm thịt Sử dụng gen β – actin làm nội chuẩn 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 10 11 12 13 14 Bùi Quang Tề 2003 Bệnh tôm nuôi phương pháp phòng trị Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Minh Hậu Nguyễn Thanh Phương 2004 Tỷ lệ cảm nhiễm WSSV (White Spot Syndrome Virus) MBV (Monodon Baculovirus) tôm sú (Penaeus monodon) thả số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ chuyên ngành thủy sản (2004) Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 1997 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Nguyễn Văn Hảo 2004 Một số bệnh thường gặp tôm sú (Penaeus monodon) – phương pháp chẩn đoán biện pháp phòng trị Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Thanh Phương, Trần Ngọc Hải 2004 Giáo trình Kỹ thuật sản xuất giống nuôi giáp xác Khoa Thủy sản- Trường Đại Học Cần Thơ Phạm Hùng Vân 2002 Cẩm nang kỹ thuật PCR RT – PCR phát tác nhân vi-rút thường gây bệnh tôm sú Penaeus monodon Công ty Thương mại Dịch vụ Nam Khoa Tài liệu kỹ thuật thủy sản FAO 2005 Hướng dẫn chẩn đoán bệnh động vật thủy sản châu Á Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Từ Thanh Dung, Trần Thị Tuyết Hoa 2008 Giáo trình Dịch tể học quản lý dịch bệnh thủy sản Khoa Thủy sản – trường Đại Học Cần Thơ Trần Thị Minh Tâm 1999 Bệnh thường gặp tôm phương pháp chẩn đoán phòng trị Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Tài liệu nước Surachetpong W., Bonnie T., Kathy F.J., Donald V L 2005 Improvement of PCR method for the detection of monodon baculovirus (MBV) in penaeid shrimp Aquaculture 249: 69 – 75 Caipang C.M.A., Sibonga M.F.J., Amar M.J.A and Geduspan J.S 2004 Development of a Polymerase Chain Reaction (PCR) Assay for the Detection of Philippine Isolates of the Penaeus monodon – type Baculovirus (MBV) Current Research Journal of Biological Sciences 3: 416-420 Hsu.Y.L., K.H.Wang, Y.H.Yang,M.C.Tung, C.H.Hu, C.F.Lo, C.H.Wang, T.Hsu 2000 Diagnosis of Penaeus monodon-type baculovirus by PCR and by ELISA of occlusion bodies Diseases of aquatic organisms 40: 93 – 99 Tài liệu internet Bộ Thủy Sản, 2006 Tình hình nuôi trồng thủy sản giới http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=1292058&news_ID=2186109, truy cập ngày 14/3/2013 Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phân tử Nhà xuất Nông nghiệp, Tp Hồ Chí Minh.Tôm nuôi bị chết hàng loạt 25 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 http://www.kiengiang.gov.vn/index2.jsp?menuId=396&articleId=5949, cập nhật ngày 16/3/2013 Bộ thủy sản, 2008 Đồng Bằng Sông Cửu Long tôm chết hàng loạt – thực trạng giải phát http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=1015068&News_ID=23430635, truy cập ngày 14/3/2013 Bộ Thủy sản, 2006 Hiện trạng nuôi tôm Việt Nam, Cơ hội thách thức http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=22&news_ID=2186109, truy cập ngày 14/3/2013 Bộ NN&PTNT, 2008 Hàn Đình Sơn Đồng Bằng Sông Cửu Long nghề nuôi tôm gặp nhiều khó khăn http://www.vietnamnet.vn/kinhte/2008/09/803454/, cập nhật ngày 14/11/2008 Cung Diễm, 2006 Kiểm tra tôm giống trước nhập http://www.vietlinh.com.vn/dbase/VLTTShowContent.asp?ID=2732, cập nhật ngày 16/3/2013 Duy Hoàng, 2008 Trà Vinh tiêu hủy 24,5 triệu tôm giống bị nhiễm bệnh http://www.monre.gov.vn, cập nhật ngày 16/3/2013 Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004 Bệnh Monodon Baculovirus tôm he Nhà xuất nông nghiệp http://www.longdinh.com/home.asp?act=chitiet&ID=977&catID =1,cập nhật ngày 16/3/2013 Hà Anh, 2007 Bệnh tôm đôi lời bàn http://nhanong.net, cập nhật ngày 16/3/2013 Mai Phương Hà Yên, 2003 Báo động đỏ bệnh tôm nuôi http://www.vietnamnet.com.vn/kinhte/toancanh/2003/12/39177/, cập nhật ngày 14/3/2013 Tổng Cục Thống kê, 2007 http://www.gso.gov.vn, cập nhật ngày 14/11/2008 Nguyễn Văn Hảo ctv, 1997 Tình hình dịch bệnh tôm sú nuôi giới Việt Nam http://www.longdinh.com, truy cập ngày 14/3/2013 Nguyễn Kiểm, 2008 ĐBSCL: Chất lượng tôm giống – Nỗi lo nhà nông http://www.vietlinh.vn/dbase/VLTTShowContent.asp?ID=591, truy cập ngày 16/3/2013 Tình hình nuôi trồng thủy sản giới http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=1292058&news_ID=3133290, cập nhật ngày 14/3/2013 Thảo An, 2008 Đồng Bằng Sông Cửu Long – mùa tôm ảm đảm http://sggp.org.vn/kinhte/2008/9/165267/, cập nhật ngày 25/3/2013 Song Huỳnh, 2008 Các vùng bán đảo Cà Mau: Tôm nuôi bị chết hàng loạt http://www.kiengiang.gov.vn/index2.jsp?menuId=396&articleId=5949 , cập nhật ngày 16/3/2013 26 PHỤ LỤC Kết giải trình tự phần mềm BioEdit ... bùng phát dịch bệnh Kỹ thuật PCR biết đến phương pháp có độ nhạy, độ xác cao thời gian phát nhanh Đề tài: Nghiên cứu phát vi-rút gây bệnh còi (Monodon baculovirus) tôm sú (Penaeus monodon) PCR ... CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI-RÚT MBV GÂY BỆNH CÒI (Monodon baculovius) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS... vi-rút thường gây bệnh tôm sú giai đoạn tôm ấu trùng (hatchery-reared larval), tôm hậu ấu trùng (postlarval) tôm lớn (juvenile) Bệnh còi không gây chết tôm ạt làm cho tôm chậm lớn MBV gây chết giai
