TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== TRẦN THU HÒA NGHI N CỨU MỘT S Đ C T NH H A SINH DƢ C CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LÁ XOÀI NON (Mangifera indica L.) KH A LUẬN T T NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa sinh học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS TRẦN THỊ PHƢƠNG LI N HÀ NỘI - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, có hỗ trợ từ Giảng viên hƣớng dẫn T.S Trần Thị Phƣơng Liên Các nội dung nghiên cứu kết đề tài trung thực chƣa đƣợc công bố công trình nghiên cứu trƣớc Những số liệu bảng, biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá đƣợc tác giả nghiên cứu có ghi nhật kí thí nghiệm bảng theo dõi thí nghiệm ngày trình nghiên cứu Ngoài ra, đề tài sử dụng số nghiên cứu, nhận xét, đánh giá nhƣ số liệu tác giả, quan tổ chức khác đƣợc thể phần tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày….tháng….năm 2017 Tác giả Trần Thu Hòa LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô giáo TS Trần Thị Phƣơng Liên tận tình giúp đỡ nhƣ bảo em suốt trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị bạn môn Hóa sinh – sinh lý thực vật, Khoa Sinh – KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ em suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày….tháng….năm 2017 Tác giả Trần Thu Hòa MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu 3 Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Đóng góp đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét chung xoài Mangifera indica L 1.1.1 Thực vật học 1.1.2 Phân bố, sinh thái 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Một số tác dụng Sinh - dƣợc công dụng xoài 1.2 Một số hợp chất tự nhiên thực vật 1.2.1 Các hợp chất thứ sinh chất có hoạt tính sinh học 1.2.2 Hợp chất phenolic 1.2.3 Flavonoid thực vật 1.2.4 Tannin 11 1.2.5 Alkaloid thực vật 12 1.2.6 Hợp chất coumarin 13 1.3 ệnh éo phì 14 1.3.1 Khái niệm phân loại béo phì 14 1.3.2 Thực trạng béo phì giới nƣớc 14 1.3.3 Nguyên nhân gây béo phì 15 1.3.4 Các tác hại nguy cụ thể béo phì 16 1.3.5 Một số số hoá sinh liên quan đến rối loạn trao đổi lipid máu 16 1.3.6 Giải pháp phòng điều trị 17 1.4 Bệnh ung thƣ 18 1.4.1 Nguyên nhân gây ung thƣ 18 1.4.2 Một số dấu hiệu bệnh ung thƣ 19 1.4.3 Thực trạng bệnh ung thƣ 20 1.5 Thuốc kháng sinh 22 1.5.1 Khái niệm kháng sinh kháng kháng sinh 22 1.5.2 Thực trạng sử dụng thuốc kháng sinh 22 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 24 2.1.2 Mẫu động vật chế độ thức ăn 24 2.1.3 Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết nghiên cứu 25 2.2.2 Phƣơng pháp sắc ký mỏng 26 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng phân đoạn dịch chiết từ xoài non Mangifera indica L lên trọng lƣợng số số hóa sinh máu chuột béo phì thực nghiệm 28 2.2.4 Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết dịch chiết xoài non lên chuột nhắt gây béo phì 29 2.2.5 Sử dụng phƣơng pháp hóa sinh - y dƣợc 29 2.2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 32 2.2.7 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Tách chiết, định tính, định lƣợng hợp chất tự nhiên từ xoài non Mangifera indica L 35 3.1.1 Kết tách chiết phân đoạn cao etanol 35 3.1.2 Kết sắc ký mỏng 35 3.2 Kết xác định liều độc cấp 37 3.3 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 38 3.4 Kết mô hình chuột béo phì thực nghiệm 40 3.5 Tác dụng phân đoạn dịch chiết cao EtOH từ xoài non lên chuột béo phì thực nghiệm 44 3.6 Kết thử hoạt tính độc tế bào invitro 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 KẾT LUẬN 48 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU TH M KHẢO 49 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh xoài non Mangifera indica L 24 Hình 2.2 Chuột nhắt thí nghiệm 24 Hình 2.3: Phƣơng pháp lấy máu đo glucose huyết 30 Hình 3.1 Ảnh chụp mỏng sau giải li hình thuốc thử (mẫu 2) 36 Hình 3.2 Chuột éo chuột thƣờng sau tuần nuôi 41 Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn tăng trọng nhóm chuột với chế độ dinh dƣỡng khác vòng tuần 42 Hình 3.4 iểu đồ so sánh số số lipid máu chuột nuôi thƣờng nuôi béo phì thực nghiệm 43 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn biến động số sinh hóa lô chuột điều trị không điều trị cao phân đoạn 46 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Phân loại BMI ngƣời trƣởng thành châu Âu châu Á 14 Bảng 2.1: Thành phần thức ăn vỗ béo cho chuột 25 Bảng 3.1 Thành phần tỉ lệ dung môi đƣợc sử dụng thí nghiệm sắc ký 35 Bảng 3.2 Kết thử độc tính cấp theo đƣờng uống 37 Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính kháng sinh cao phân đoạn EtOH từ xoài non (đơn vị MIC (µg/ml)) 38 Bảng 3.4 Trọng lƣợng trung bình (tính theo gram) hai nhóm chuột nuôi hai chế độ dinh dƣỡng khác 42 Bảng 3.5 So sánh số số lipid máu chuột nuôi thƣờng nuôi béo phì thực nghiệm 43 Bảng 3.6 So sánh trọng lƣợng (g) lô chuột éo phì trƣớc sau điều trị 45 Bảng 3.7 So sánh số sinh hóa lô chuột điều trị không điều trị dịch chiết cao EtOH từ xoài non sau tuần 45 Bảng 3.8 Kết thử hoạt tính độc tế bào 47 DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT LDL – c : Cholesterol xấu HDL – c : Hight denistylipoprotein Cholesterol TG : Triglyceride Glu : Glucose TC : Cholesterol EtOH : Ethanol EtOAc : Ethyl acetate GOD: glucose oxidase CHO: enzyme cholesterol oxydase ATCC: Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ CCL -17TM : mô biểu bì miệng KB MTT: (3-(4,5-dimethylthiazol-2 - yl )- 2, - diphenyltetrazolium) OD phản ánh số lƣợng tế bào sống IC50: nồng độ chất thử ức chế 50% phát triển tế bào DMEM: Dulbeccos Modified Eagle Medium MEME: Minimum Esental Medium with Eagle salt FBS: Fetal Bovine Serum SD: độ lệch chuẩn KB (CCL – 17TM): dòng tế ung thƣ iểu mô biểu bì miệng Hep G2 (HB – 8065TM): dòng tế ung thƣ gan LU-1 (HTB – 57TM): dòng tế ung thƣ phổi MCF-7 (HTB – 22TM): dòng tế ung thƣ vú SK-Mel (HTB – 68TM): dòng tế ung thƣ da MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Theo Y học cổ truyền, xoài có vị chua ngọt, tính mát, có tác dụng làm mát, lợi tiểu, chống sa nội tạng, đƣợc dùng trị ệnh hô hấp nhƣ ho, viêm phế quản cấp hay mạn tính, phù thũng Hơn nữa, xoài có chất anthxyanhdin có tác dụng hạ đƣờng huyết phòng iến chứng mắt mạch máu ệnh tiểu đƣờng Kết nghiên cứu an đầu Đại học Queensland (Úc) cho thấy số hợp chất xoài có tác dụng chữa ệnh tƣơng tự nhƣ loại thuốc trị tiểu đƣờng làm giảm cholesterol Chính thế, nhiều ác sĩ châu Âu sử dụng xoài nhƣ phƣơng thuốc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đƣờng vô hiệu Những kết nghiên cứu cho thấy số đƣờng huyết (glycemic index) xoài thấpkhoảng 41-60, xoài không gây ảnh hƣởng lớn đến việc làm tăng lƣợng đƣờng máu [29] Trên thực tế, việc nghiên cứu đặc tính y dƣợc từ hoạt chất thiên nhiên xoài non chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều Một số nƣớc Thế Giới có nhiều nghiên cứu ứng dụng chế phẩm từ xoài Nhật ản, Trung Quốc, Mỹ, Ấn Độ, Cu a,… Trên thị trƣờng Cu a có chế phẩm Vimang (dịch chiết toàn phần từ vỏ, thân, xoài) đƣợc sử dụng nhƣ thực phẩm chức để hỗ trợ điều trị số ệnh miễn dịch, dị ứng, chống oxy hóa, hỗ trợ điều trị HIV Một số nghiên cứu xoài Việt Nam đƣợc thực từ năm 1989, công trình nghiên cứu sau chứng minh đƣợc khả kháng khuẩn sâu răng, chống viêm xoài; tìm số chủng men dịch chiết xoài; công nghệ tách chiết sản xuất mangiferin từ xoài [29] Trong năm gần đây, công nghệ tách chiết hợp chất từ thực vật không ngừng phát triển ƣớc đầu đạt đƣợc thành đáng kể chất cách xác 3.2 Kết xác định liều độc c p Xác định LD50 dịch chiết tổng số từ xoài non chuột nhắt trắng ằng đƣờng uống theo phƣơng pháp Lorke 17] Chuột cho nhịn đói trƣớc 12 thí nghiệm, đƣợc phân lô ngẫu nhiên, lô đƣợc cho uống theo liều tăng dần đến 2g/kg thể trọng Theo d i iểu số chuột chết 72 để đánh giá mức độ độc xoài non Bảng 3.2 Kết thử độc tính c p theo đƣờng uống Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết 1000mg/kg 13 0% 1200mg/kg 13 0% 1500mg/kg 13 0% 2000mg/kg 13 0% Sau 72 theo d i với liều uống tăng dần thấy chuột chết Đến liều cao 2000mg/kg thể trọng chết, chƣa tính đƣợc LD50 nghĩa kết luận phân đoạn dịch chiết từ xoài non hoàn toàn không độc dù liều cao theo đƣờng uống 37 3.3 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính kháng sinh cao phân đoạn EtOH từ xoài non (đơn vị MIC (µg/ml)) STT Tên ch t E.faecalis S.aureus N m men Gram - Gram + B.cereus E.Coli P.aeruginosa S.enterica C.clbicans ATCC13124 ATCC25923 ATCC13245 ATCC25922 ATCC27853 ATCC12228 ATCC1023 Mẫu cao 128 256 256 256 256 256 128 Kháng Streptomycin 256 256 128 32 256 128 _ sinh Tetramycin 16 64 256 256 _ Kanamycin 128 128 64 16 _ Nystatin _ _ _ _ _ _ Cyclohexamide _ _ _ _ _ _ 32 Giá trị iểu cột: án kính vùng ức chế ( _ ) : Không có iểu ức chế, vi khuẩn phát triển ình thƣờng Các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế TCC đƣợc cung cấp ởi viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia: 38 chủng vi khuẩn Gram- Escherichia coli ATCC 25922: hay đƣợc gọi vi khuẩn đại tràng, loài vi khuẩn ký sinh đƣờng ruột động vật máu nóng ( ao gồm chim động vật có vú) Vi khuẩn cần thiết trình tiêu hóa thức ăn thành phần khuẩn lạc ruột Sự có mặt E.coli nƣớc ngầm thị thƣờng gặp cho ô nhiễm phân - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835: hay gọi tr c khuẩn mủ xanh, mầm ệnh hội gây nhiễm trùng ệnh viện công ệnh nhân ị suy giảm miễn dịch Chủng vi khuẩn thƣờng gây nhiễm trùng đƣờng hô hấp, đƣờng tiết niệu, vết ỏng, vết thƣơng, gây nhiễm trùng huyết - Salmonella enterica ATCC 12228: vi khuẩn gây ệnh thƣơng hàn nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa ệnh hiểm nghèo dễ lan vi khuẩn phân ngƣời ị ệnh nhiễm vào thức ăn hay nƣớc uống truyền sang ngƣời khác chủng vi khuẩn Gram+ - Enterococcuc faecalis ATCC 13124: loại liên cầu sống đƣờng tiêu hóa động vật có vú Liên cầu gây nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, viêm phổi, viêm màng não, xâm nhập qua vết mổ gây nhiễm trùng máu - Stapphylococus aureus ATCC 25923: hay tụ cầu vàng phần hệ vi sinh vật sống thƣờng trú da Tụ cầu gây nhiều ệnh nhiễm trùng khác điểm hình ệnh chốc lở da hình thành ổ ápxe chứa đầy mủ, sƣng đau, tấy đỏ thƣờng kèm theo chảy mủ Nếu tụ cầu xâm nhập vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, xâm nhập vào phổi gây viêm phổi, vào xƣơng gây viêm tủy xƣơng, gây nhiễm trùng 39 tim van tim Tụ cầu lƣu thông máu, đƣợc chuyển đến hệ quan thể gây ệnh nhiễm trùng nghiêm trọng, nguy hiểm đến tính mạng - Bacillus cereus ATCC 13245: chủng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm chủng Nấm men Candida albicans ATCC 10231: gây nhiễm nấm thể ngƣời nhƣ miệng, âm đạo, dƣơng vật gây ngứa rát Rất nhiễm trùng trở thành xâm hại lan rộng khắp thể Tình trạng nhiễm nấm phổ iến với tr sơ sinh tháng tuổi, ngƣời già, ngƣời ị suy giảm hệ thống miễn dịch ( ao gồm HIV/ IDS, loại thuốc sử dụng sau cấy ghép nội tạng, tiểu đƣờng, sử dụng corticosteroid), rủi ro khác ao gồm việc sử dụng giả sau dùng kháng sinh trị liệu Từ ảng số liệu rút kết luận : mẫu cao phân đoạn có hoạt tính ức chế mạnh tất mẫu vi sinh vật thử hoạt tính, chí cao nhiều so với chất kháng sinh đƣợc điều chế vào sử dụng từ lâu Y học Nhƣ vậy, nói cao EtOH từ xoài non có tính kháng viêm cao với chủng vi sinh vật đƣợc sử dụng thí nghiệm Đây triển vọng tốt cho nghiên cứu chuyên sâu chủng vi sinh vật khác thách thức Y tế Dịch tễ học 3.4 Kết mô h nh chuột éo ph th c nghiệm Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lƣợng an đầu 17 - 20g) đƣợc chia làm lô Lô 1: Cho ăn chế độ ình thƣờng (thức ăn Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng) Lô 2-4: Cho ăn thức ăn giàu lipid cholesterol cao Sau tuần nuôi theo chế độ trên, tiến hành cân trọng lƣợng 40 chuột Dƣới hình ảnh so sánh chuột ăn thức ăn thƣờng chuột ăn thức ăn giàu lipid cholesterol cao A – Chuột thƣờng B – Chuột éo H nh 3.2 Chuột éo chuột thƣờng sau tuần nuôi Kết thay đổi trọng lƣợng chuột thí nghiệm đƣợc thể ảng 3.4 hình 3.3 41 Bảng 3.4 Trọng lƣợng trung nh (tính theo gram) hai nhóm chuột nuôi ằng hai chế độ dinh dƣỡng khác Trọng lƣợng (g) Nhóm Ban đầu Tuần Tuần Tuần Tuần Ăn thƣờng 17,93 22,78 28,95 34,72 40,73 Ăn éo 18,09 29.27 39,71 47,66 52,87 Hình 3.3 Biểu đồ iểu diễn s tăng trọng nhóm chuột với chế độ dinh dƣỡng khác vòng tuần Qua thử nghiệm tạo thành công mô hình chuột éo phì thực nghiệm Sau tuần với chế độ thức ăn giàu lipid cholesterol thấy có khác iệt r rệt khối lƣợng chuột nuôi ằng thức ăn giàu lipid so với chuột nuôi ằng thức ăn thƣờng Cụ thể: chuột nuôi ằng thức ăn thƣờng thể tăng thêm 22,8g ứng với 227,16% so với an đầu Trong chuột nuôi ằng thức ăn giàu lipid cholesterol trọng lƣợng thể tăng thêm 42 34,78g ứng với 292,26% cao gấp 1,298 lần so với chuột nuôi thƣờng Chọn ngẫu nhiên 13 chuột nuôi éo Sau cho nhịn đói 12 giờ, lấy máu tổng số phân tích số hoá sinh để đánh giá ảnh hƣởng chế độ nuôi éo đến số lipid huyết Bảng 3.5 So sánh số số lipid máu chuột nuôi thƣờng nuôi éo ph th c nghiệm Các số lipid (mmol/l) TC TG HDL-c LDL-c Glucose Nhóm ăn 4.16 1.18 1.64 2.83 6.15 thƣờng ±0.44 ±0.2 ±0.2 ±0.32 ±0.37 6.03* 2.54* 0.97* 3.91* 8.93* ±0.31 ±0.21 ±0.2 ±0.37 ±0.35 ↑1,45 ↑2,15 ↓1,69 ↑1,38 ↑1,45 Nhóm ăn éo So sánh éo/thƣờng lô H nh 3.4 Biểu đồ so sánh số số lipid máu chuột nuôi thƣờng nuôi éo ph th c nghiệm 43 Từ bảng số liệu bảng 3.5 hình 3.4 cho thấy số hóa sinh có khác biệt lớn lô nuôi thƣờng lô nuôi béo Cụ thể: Hàm lƣợng glucose chuột béo phì 8.93 mmol/l, tăng 45.2% so với chuột nuôi thƣờng (6.15mmol/l) với mức ý nghĩa P