ẢNH HƯỞNG TƯƠNG TÁC CỦA GA3 VÀ POLYAMINES TRONG QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI THỂ HỆ IN VITRO TỪ PHÔI BẮP NON (ZEA MAYSL.) Tổng quan Sự phát sinh phôi thể hệ in vitro nghiên cứu bắp Gaurav nuôi cấy phôi non Để thu mô sẹo hiệu qu ả, phôi non cấy môi trường MS có bổ sung mgl -1 2,4-D mgl-1 NAA + mgl-1 BAP 16 chiếu sáng cường độ ánh sáng 150 µmolm-2s-1 28±2°C Các báo cáo cho thấy tỉ lệ hình thành mô sẹo cao môi trường chứa 2,4-D Thời gian nuôi cấy lâu kết c mô sẹo có màu nâu phôi bị thoái hóa T tần số phát sinh phôi khoảng 65-68% tần số hình thành chồi xanh khoảng 35-48% Đ ể phân tích ảnh hưởng tương tác polyamine GA3 s ự phát sinh phôi thể hệ, mô sẹo tăng sinh nhanh cấy truy ền môi trường MS có bổ sung kết hợp 27 polyamin (Putrescine, Spermine and Spermidine) GA3 Nồng độ cao Putrescine (150 um) k ết h ợp v ới GA3 (50-150 µM) tìm thấy có hiệu cảm ứng phát sinh phôi thể hệ lớn Mặc dù spermine nồng độ thấp h ơn (50 µM) k ết h ợp với GA3 cho thấy phát sinh phôi mạnh mẽ nh ưng putrescine nồng độ cao tìm thấy có hiệu tương đ ối nhi ều h ơn Spermidine nồng độ khác (50-150 µM) cho kết qu ả th ấp kết hợp với nồng độ GA3 thấp (50 µM) Có th ể kết lu ận r ằng spermine nồng độ thấp (50µM), putrescine nồng độ cao h ơn (150 µM) thể tương tác tích cực với GA3 điều kiện phát sinh phôi thể hệ Các kết sử dụng công cụ hiệu cho phát triển giống lai sản xuất ngô ghép tương lai nghiên cứu khía c ạnh phân t sinh lý biến đổi di truyền Giới thiệu Sau gạo lúa mì, ngô quan trọng th ứ ba, trồng tr ọt kh ắp nơi giới 145 triệu hecta với sản lượng hàng năm 779.6 triệu Các nước phát triển chiếm 64% diện tích trồng ngô giới 43% sản lượng ngô toàn cầu Ngô trồng với diện tích 8.12 triệu hecta Ấn Độ , với sản lượng 18.96 triệu với suất bình quân 2335 Kg (DASSet al., 2009) Với dân số ngày tăng, di ện tích đất giảm nhu cầu lớn chất lượng sô lượng đòi h ỏi s ự c ải ti ến nhanh mặt di truyền ngô (CHENG-HAOet al., 2008; JOSHIet al., 2009) Mặc dù có nhiều nỗ lực cho việc tăng sản lượng ngô thông qua yêu cầu lai tạo thông thường không đáp ứng y ếu t ố khác ví dụ như: hạn hán, sâu, bệnh, cỏ dại chất l ượng đ ất th ấp (OMBORIet al., 2008) Trong lai tạo ngô đại, s ự phát tri ển vi ệc ghép công nhận phương pháp quan trọng Theo ước tính, chi phí sản xuất giống ngô lai cao h ơn khoảng 7% 12% so v ới giống địa phương khoảng 30% sản lượng bị gi ảm vi ệc s d ụng hạt giống giống từ lai Do đó, đ ể có đ ược suất cao cần phải sử dụng hạt giống lai năm Ng ược lại, nhiều loại giống ngô ghép hạt giống có th ể sử dụng cho 3-4 năm Thông thường, phương pháp lai ngược s dụng nh m ột cách để chuyển gen ngoại lai thành nhiều loại ưu tú Tuy nhiên, có gen có đặc điểm không mong muốn kết hợp với gen có đặc điểm mong muốn (DENG et al., 2009) Tuy nhiên, biến đổi gen kỹ thuật nuôi cấy mô đáng khen ngợi đối việc lai t ạo thông thường đạt gia tăng có nhiều loại ngô có kh ả ch ống ch ịu thời gian ngắn so với tiêu chuẩn ngành nông nghiệp th ực phẩm (CHEet al., 2006) Phôi non coi nguồn nuôi đáng tin c ậy hiệu để nuôi cấy mô cấy mô sẹo, dịch treo tế bào nuôi c t ế bào trần cho việc biến đổi di truyền bao gồm số l ượng l ớn tế bào phân chia mạnh (ZHANG et al., 2001; RIKIISHI et al., 2008) Các ki ểu gen ngô báo cáo khác đáng k ể s ự hình thành mô sẹp, phát sinh phôi thể hệ, tái sinh chồi (PHILLIPS, 2004) Vì vậy, cần phải thiết lập giao thức sử dụng kiểu gen ngô có s ự đáp ứng khả tái tinh cao dử dụng cho biến đổi di truy ền Gần đây, polyamine (PAs) tức spermidine (Spd), spermine (Spm), putrescine (Put) thêm vào chất điều hòa tăng trưởng th ực vật chất truyền tin thứ đường truy ền tín hiệu (LIU et al., 2007;KUSANOet al., 2008; FAROOQet al., 2009) Nhiều báo cáo cho th vai trò điều hòa chúng nhiều trình phát tri ển bao gồm s ự tăng trưởng sinh dưỡng tăng trưởng hạt phấn (RAJAM, 1989), điều hòa trình chép DNA, phiên mã gen, phân chia t ế bào (BAISand RAVISHANKAR, 2002), phát triển quan (FOSet al., 2003), s ự tăng trưởng rễ rễ bên hình thành rễ bất đ ịnh (COVEE et al., 2004) Có báo cho thấy polyamines đóng m ột vai trò quan trọng suốt trình phát sinh phô thể hệ vài quan trọng Brassica campestris spp Perkinensis (CHIet al., 1994), lúa (BAJAJ and RAJAM, 1996; RAJAM, 1997), Vitis vinifera (BERTOLDIet al., 2004), Daucus carota (TAKEDAet al., 2002) cà tím (YADAVand RAJAM, 1998) Pas ngoại sinh cảm ứng phân chia tế bào tăng kh ả tái sinh nuôi cấy tế bào thực vật (TAKEDAet al., 2002; SILVEIRA et al., 2006; DEBIASI et al., 2007; MOGORet al., 2007; STEINER et al., 2007) vài trình phát sinh quan liên hệ với n ồng đ ộ Pas n ội sinh (FRANCISCOet al., 2008, VIU et al., 2009) Ngoài ra, hình th ức liên h ợp liên kết PAs quan trọng cho trình phát triển th ực v ật (PAULet al., 2009) Mặc dù có loạt ảnh hưởng sinh lý giberellin, nh ưng có s ự ý đến vai trò giberellin (GAs) phát sinh phôi th ể hệ (JIMENEZ, 2001) GAs cho đóng vai trò quan trọng su ốt trình phát sinh phôi hợp tử loài ngũ cốc (WHITE and RIVIN, 2000; YANGet al., 2003) GA3 trước tìm th để làm tăng s ự phát sinh phôi thể hệ Santalum album (LAKSHMISITA, 1986), Theobroma cacao (KONONOWICZ and JANICK, 1984), Rumex acetosella(CULAFICet al., 1987), Spinacia oleracea (XIAO BRANCHARD, 1993), phát sinh phôi thứ cấp Camellia japonicahypocotyls (VIEITEZand BARCIELA, 1990) phát sinh phôi nuôi c mô cuống Foeniculum vulgare (HUNAULT and MAATAR, 1995) Medicago sativa (RUDUSet al., 2002) Các phôi có nguồn gốc từ t ế bào trần cần GA3 để phát triển vượt qua giai đoạn hình cầu (DAVEYand POWER, 1988) GA3 liên quan tới nhiều trình phát tri ển, bao g ồm nảy mần, kéo dài thân, trình chuyển đổi từ phát triển sinh dưỡng sang sinh sản (OLSZEWSKI et al., 2002; MIROSHNICHENKO et al., 2009) Mặc dù vậy, nhiều nghiên cứu vai trò polyamine (KEVERS et al., 2002) GA3 (JIMÉNEZ, 2001) s ự phát sinh phôi th ể h ệ đ ược nghiên cứu cách riêng biệt, báo cáo ảnh h ưởng k ết hợp polyamine GA3 suốt trình phát sinh phôi thi ếu Trên sở lập luận trước, nghiên cứu nhằm mực đích để phân tích ảnh hưởng tác động GA3 polyamine hình thành phôi th ể hệ thiết lệp hệ thống tái sinh hiệu thông qua phát sinh phôi th ể hệ sử dụng việc nuôi cấy phôi non nhiều loại Gaurav ghép VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguồn cảm ứng mô sẹo sơ cấp Lõi bắp chưa trưởng thành giống bắp Gaurav lấy từ Trung tâm nghiên cứu trồng, G.B.Pant Đại học Nông nghiệp Công ngh ệ, Pantnagar Các trái bắp (ears )được dehusked lau c ồn ệt đ ối Các hạt bắp lần rửa với 2-3 giọt chất tẩy rửa phút sau đó, nước cất vô trùng Sau chúng đ ược x lý b ằng ethanol 70% phút 0,1% HgCl2 phút Đ ể lo ại b ỏ thủy ngân clorua, thực rửa lần với nước cất vô trùng Phôi ch ưa trưởng thành, chiều dài đến 1,5 mm, cắt vô trùng t h ạt b ắp đĩa petri Để tạo điều kiện thuận lợi cho nảy mầm, 7-8 phôi chọc nhẹ với kim vô trùng đặt chai kín có chứa môi tr ường Murashige Skoog (MS) (1962) bổ sung mg/l 2,4-D mg/l NAA + mg/l BAP với sucrose 3%, 0,8% agar pH đ ược ều ch ỉnh đ ến 5,8 (hấp 15 psi 20 phút) Sự nuôi cấy trì phòng nuôi cấy mô với 16 chiếu sáng, cường độ ánh sáng 150 μmolm-2 sec-1 nhiệt độ 28 ± °C lồng ấp BOD Mô sẹo tăng lên nhanh chóng trì môi trường MS kích thích tố Phát triển phôi soma Nghiên cứu ảnh hưởng Amin sinh phôi th ể hệ, mô sẹo tăng lên nhanh chóng Gaurav cấy môi tr ường MS có bổ sung v ới 50 μM, 100 μM 150 μM Putrescine, Spermine Spermidine v ới n ồng độ GA3 khác (50 μM, 100 μM, 150 μM) Bởi PA (polyamine) GA3 hai chất điều hòa sinh trưởng không bền nhiệt, đó, chúng lọc vô trùng với màng lọc kích th ước 0,22 μ rót sau hấp khử trùng môi trường lỏng Thao tác đ ược th ực hi ện dòng chảy thành lớp vô trùng Tái phân hóa Đối với tái sinh phôi soma nuôi cấy môi trường MS có ch ứa mgl-1 BAP bổ sung sucrose 3% cho tái sinh Chồi tái sinh đ ược đ ặt lên môi trường rễ bổ sung với 0.5mgl-1 IAA sucrose 3% cho rễ phát triển Cây bén rễ tốt rửa nước để loại bỏ môi trường, sau xử lý 100 mgl-1 Bavistin (BVN) để ngăn ngừa nhiễm nấm m ốc Sau chúng cấy vào chậu có hỗn hợp đất trùng cát (3:1 v / v) tưới 50 ml nước máy Các trồng điều ki ện ẩm nhà kính (Vista Biosciences, Ấn Độ) nhiệt độ 28 ± ° C t ối đa s ự trưởng thành Dữ liệu phân tích cách sử dụng ph ương pháp thống kê chuẩn KẾT QUẢ: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật c ảm ứng t ạo mô sẹo từ phôi chưa trưởng thành Phôi hợp tử giống ngô Gaurav đáp ứng với môi tr ường c ảm ứng (5 mg/l 2,4-D mg/l NAA + mg/l BAP) gi ới h ạn s ự tăng s ố lượng mô sẹo (bảng 1) (in terms of increase in volume of callus )(Table 1) Dấu hiệu tạo mô sẹo nhận thấy sau 3, ngày nuôi cấy , bề mặt mặt đáy vảy (scutellum) Phôi đ ược đặt môi trường với trục phôi cho thấy s ự hình thành s ẹo rễ (hình 1B) Tuy nhiên, mô vùi môi trường,đều không cho thấy kéo dài rễ hay tạo mô sẹo Hơn nữa,những mô môi trường với trục phôi, mô sẹo nh ững môi trường khảo nghiệm Khi phôi chưa trưởng thành nuôi cấy môi tr ường có mg/l 2,4-D, sẹo xốp trắng phát sau tuần môi tr ường nuôi cấy Trong môi trường bản, sẹo tăng trưởng chậm Tuy nhiên, sau tuần sẹo cho thấy tăng trưởng nhanh bở trạng thái t ự nhiên với màu trắng sữa, mà sau tr thành phôi phát tri ển t sẹo(embryogenic calli) (bảng 2) Ở ngô, sẹo gọi v ụn hay loại 2.Hơn nữa, phần trăm lớn phôi phát sinh từ mô sẹo (77.11%) ước lượng (hình 2A) Sau tuần nuôi cấy sẹo tr nên nâu r ễ b đầu hình thành Trong môi trường bổ sung mg/l NAA+ mg/l BAP tu ần tr đi, vụn phôi từ sẹo xuất mặt đáy vảy Bề mặt c nh ững sẹo vụn xốp Trong môi trường bản, mô sẹoxuất v ừa ph ải Nhưng phôi phát sinh từ sẹo rắn (loại 1) quan sát sau nuôi c Hơn nữa, môi trường phần trăm thấp phôi phát sinh từ sẹo (65.78%) so sánh với sẹo tăng trưởng môi trường bổ sung 2,4D (Hình 2B) Sự hóa nâu nhận tháy suốt 5-6 tuần nuôi c vài mô sẹo (bảng 2) Số lượng sẹo tăng mạnh đ ược nh ận thấy sau 15 ngày nuôi cấy (hình 1C) nhiên s ự tăng tr ưởng đ ược nh ận thấy chậm sau 30 ngày môi trường Hiệu tương tác GA3 polyamin : Những phôi xuất phát từ mô sẹo cho thấy tăng tr ưởng nhanh môi trường MS bổ sung với nồng độ khác c GA3 polyamin, tất chúng cho thấy khác biệt rõ ràng (bảng 3) Đáp ứng mạnh phôi thể hệ ghi nhận môi trường có b ổ sung putrescine (150 µM) cộng với GA3 với nh ững n ồng độ khác 50 µM, 100 µM Nồng dộ cao Putrescine (150 µM) v ới GA3 (50-150 µM) nhân thấy có hiệu cảm ứng tạo phôi th ể h ệ Tuy vậy, spermine nồng độ thấp(50 µM) với nồng độ GA3 cho th tăng nhanh , kết hợp GA3 + putrescine nồng đ ộ cao đ ược th tương đối hiệu kết hợp khác Spermidine n ồng đ ộ (50-150 µM) kết hợp với nồng độ GA3 thấp GA3 (50 µM) cho k ết qu ả Những phôi hình cầu ghi nhận rõ ràng nghiên cứu ngô cv Gaurav (hình 1D-E) Sự tái sinh chuyển vườn: Cho việc tái sinh cây, phôi thể hệ môi tr ường MS bổ sung mgl-1 BAP 3% sucrose cho thấy hình thành nhanh chồi (hình 1G) Phôi thể hệ phát triển thành khu vực màu xanh b ề m ặt mô sẹo( hình 1F), có khác việc phát triển ch ồi 2-3 (Hình 1G-H).Chồi tái sinh từ phôi xuất phát t mô sẹo đ ược chuyển qua môi trường rễ sau tuần, nhiều rễ đ ược hình thành (hình I-J) Nhờ tăng trưởng nhanh chóng, tạo rễ tốt đ ược chuyện chậu trồng thành công nhà kínhđến tr ưởng thành THẢO LUẬN: Cảm ứng tạo mô sẹo ngô phụ thuộc vào yếu tố khác nh kiểu gen, điều kiện nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, tuổi (RIKIISHI et al, 2008) Mô sẹo giảm tăng trưởng chuy ển sang môi tr ường t ạo phôi có lẽ phân cực phôi nghèo ch ất dinh d ưỡng đ ể nuôi c phôi Sự kéo dài rễ bắt đầu tạo sẹo bị c ản có th ể không thông khí Phôi khoảng 1,0-1,5 mm thúc đẩy mô sẹo tái sinh mô già khả để đáp ứng (như biệt hóa tiềm mô phân sinh) Tương tự quan sát báo cáo tr ước (GARCIA et al, 2000.) Trong nghiên cứu 2,4-D NAA + BAP sử d ụng đ ể kích thích hình thành mô sẹo từ phôi ngô chưa trưởng thành Môi trường MS có bổ sung 5,0 mg/l1 2,4-D tìm thấy phù h ợp đ ể cảm ứng mô sẹo ngô (cv Gaurav), điều tìm thấy phù h ợp v ới r ất nhi ều báo cáo khác (Pedrosa Vasil, 1996) Auxin nồng độ cao y ếu t ố quan trọng để kích thích đáp ứng lại phát sinh phôi ngô (ZHAO et al, 2008) Hầu hết mầm chịu đựng auxin tổng h ợp m ạnh nh 2,4-D không biểu triệu ch ứng đ ộc tính đột biến (Pedrosa Vasil, 1996) Nhiều người nghiên cứu nói x lý tế bào có khả sinh phôi với 2,4-D nồng độ cao th ời gian ngắn để tạo phôi soma (chug Khurana,2002) Trong nghiên cứu này, môi trường có bổ sung mg/l NAA + mg/l BAP t ốt cho c ảm ứng mô s ẹo ngô (cv.Gaurav) điều m ức đ ộ n ội sinh phytohormones Cytokinin kết hợp với auxin để kích thích sinh phôi nuôi cấy mô s ẹo báo cáo cho ngũ cốc (JIA et al, 2008.).Ph ần l ớn tái sinh c loại ngũ cốc thông qua sinh phôi từ mô sẹo sau có th ể phát tri ển thành chồi, phôi soma hoàn chỉnh Cảm ứng nhóm mô sẹo tạo thú vị tái sinh, kỹ thuật gen thay đổi xếp nhiễm sắc thể (FRANSZ et al, 1990) Trong nghiêm cứu nay, vai trò polyamin với GA3 cảm ứng phôi soma đánh giá Putrescine spermine v ới GA3 đ ược quan sát có ảnh hưởng đến cảm ứng phôi soma Ảnh h ưởng c polyamin ngoại sinh đến hình thành phát triển chồi xác nhận b ởi s ố tác giả (DEBIASI et al, 2007; MO‘LGOR et al, 2007) PAs ngoại sinh đ ược s dụng rộng rãi cho nghiên cứu, chức PAs s ự phát tri ển c tế bào phân hóa tế bào có khả sinh phôi (TAKEDA et al, 2002) Hầu hết chức sinh học polyamin giải thích chất polycationic chúng,cho phép tương tác với đại phân t anion là, DNA, RNA nhóm mang điện tích âm màng tế bào Nh ững quan sát cho thấy polyamin ngoại sinh nguồn nitơ cho trồng (BAGANI FRACASSINI, 1985) hoạt động Free radical scavengers (Nhóm khóa hoạt tính gốc tự do) để bảo vệ màng ch ống l ại “s ự peroxide hóa Lipid” (sự oxy hóa mỡ th ể) (EL MESKAOUI TREMBALY, 2009) Putrescine tìm thấy có hiệu v ới thay đổi nồng độ GA3 Putrescine ngoại sinh kích thích tế bào nhân lên tái sinh mô, kết tăng khả sinh phôi, giống với báo cáo trước (SAKHANOKHO et al, 2005) Coffea canephora (Clelia et al, 2008; KUMAR et al, 2008) Hơn nữa, putrescine ngoại sinh đ ược báo cáo thúc đẩy gia tăng putrescine nội sinh Araucaria angustifolia (Steiner et al, 2007), đó, putrescine coi y ếu t ố quan trọng thúc đẩy cảm ứng tạo phôi soma Áp dụng spermine ngoại sinh môi trường nuôi cấy hoạt động chất chống oxy hóa tế bào nuôi cấy mô sẹo (DEBIASI et al, 2007) Ng ười ta cho r ằng tỷ lệ tương đối chuyển hóa polyamine quan trọng l ượng n ội sinh trình phát triển (ARIBAUD et al 1999) Một loạt k ết qu ả từ loài thực vật khác cho thấy GA3 kích thích GAST (Gibberellic Acid kích thích chép gen) ch ủ yếu liên quan đ ến kéo dài t ế bào phân chia tế bào (Zimmermann et al, 2010) Kể từ GAS kích thích phân chia tế bào kéo dài tế bào (Reid et al, 1983), polyamines liên quan đến phân chia tế bào, s ự k ết h ợp c c ả hai GA3 + polyamin kích thích phân chia tế bào in-vito (SMITH et al, 1985.) GA3 kích thích tổng hợp sắc tố quang h ợp phát tri ển phôi soma cải thiện khả quang h ợp , d ự tr ữ carbohydrates nảy mầm in-vitro (Nasim et al, 2010) KẾT LUẬN, môi trường MS có bổ sung PAs có tác d ụng tăng c ường tăng trưởng mô sẹo có khả sinh phôi, số lượng phôi soma t mô s ẹo thúc đẩy phân chia tế bào, thảo luận với kết đ ược mô t ả số tác giả (MO LGOR et al., 2007) Bằng cách này, có th ể suy phôi soma polyamin thúc đẩy hình thành rễ lá, polyamines (amongst polyamines), putrescine coi quan trọng cho trình Như vậy, nghiên cứu này, c ảm ứng invitro tăng khả sinh phôi cách sử dụng PAs ngoại sinh có th ể sử dụng tốt cho trồng theo hướng cải thiện giống Putrescine có tác dụng kích thích spermine sau spermidine Báo cáo tương tựcũng báo cáo Acharas sapota c ng ười nghiên c ứu trước (Purohit et al, 2007) Báo cáo mô tả tái sinh đánh giá cao d ựa GA3 k ết h ợp polyamines cảm ứng tạo phôi soma (Gaurav) giống ngô thông qua nuôi cấy phôi chưa trưởng thành Bao gồm bốn bước sau: cảm ứng tạo mô sẹo môi trường bổ sung mg/l 2,4-D + 3% sucrose 4-5 tuần, sinh phôi môi trường bổ sung GA3 (50µm - 150 µm) n ồng đ ộ cao (150 µm ) Putrescine nồng độ spermine thấp (50 µm ) 3-4 tu ần, tái sinh từ mô sẹo soma môi trường có ch ứa 2mg/l BAP + 3% sucrose tuần rễ môi trường có chứa 0.5 mg/l IAA + 3% sucrose  ... ảnh hưởng tác động GA3 polyamine hình thành phôi th ể hệ thiết lệp hệ thống tái sinh hiệu thông qua phát sinh phôi th ể hệ sử dụng việc nuôi cấy phôi non nhiều loại Gaurav ghép VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG... dù có loạt ảnh hưởng sinh lý giberellin, nh ưng có s ự ý đến vai trò giberellin (GAs) phát sinh phôi th ể hệ (JIMENEZ, 2001) GAs cho đóng vai trò quan trọng su ốt trình phát sinh phôi hợp tử... n ội sinh phytohormones Cytokinin kết hợp với auxin để kích thích sinh phôi nuôi cấy mô s ẹo báo cáo cho ngũ cốc (JIA et al, 2008.).Ph ần l ớn tái sinh c loại ngũ cốc thông qua sinh phôi từ mô