TĨM TẮT: Hiện việc nghiên cứu mơ tả phát triển rễ bất định in vitro cỏ Hypericum Perforatum L biết phổ biến với tên St.John với chất dinh dưỡng nồng độ auxin thấp môi trường vi nhân giống lỏng Rễ tái tạo từ mô sẹo (shoot-derived) chồi môi trường MS bổ sung 4mg/l IAA IAA IBA cho kết việc cảm ứng tạo rễ từ cấy chồi Mơi trường MS ½ + 1mg/l IAA phù hợp để nuôi cấy rễ môi trường lỏng Tổng sinh khối 4,13 ± 0,67g gồm 226 ±34,4 chồi ngọn, chồi bên (shoot bud) với rễ thu từ 200mg rễ ban đầu Trước xử lý với kinetin (2mg/l) làm tăng chồi Bình Growtek phù hợp hiệu cao cho việc đưa vào sản xuất Rễ phát triển tốt in vitro bất chấp nguồn ban đầu chúng dễ dàng giám sát nguồn nuôi cấy để sản xuất bệnh mà không đánh tiềm phát sinh hình thái suốt trình phát triển Thực vật cho thấy 84-99% giống chúng kĩ thuật RAPD Ngọn chồi in vitro tăng lên nhiều lần mọc rễ liên tục chúng khảo sát để sản xuất invitro hypericin hyperforin CHỮ VIẾT TẮT IAA Indole-3aceticacid IBA Indole-3butyricacid NAA a-Naphtheleneaceticacid 2,4-D 2,4,Dichlorophenoxyaceticacid BAP 6-Benzylaminopurine Kn Kinetin(6-Furfurylaminopurine) TDZ Thidiazuron RAPD Randomly amplified polymorphic DNA RFLP Restriction fragment length polymorphism GIỚI THIỆU: Hypericum perforatum L (Họ Clusiaceae) vị thuốc nam quí thường phân bố vùng khí hậu ơn đới tương đối khơ Châu Âu Bắc Mỹ.Ở Ấn Độ, phân bố phía tây dãy Hymalaya 3000 đến 9000 fit so với mặt nước biển Cây St.John có tiềm điều trị suy nhược từ nhẹ đến vừa (Desmet Nolen, 1996) hoạt động chất “Hypericin Hyperforin” trở thành vị thuốc nam phổ biến hoạt động kháng virut, trị ung thư, sát trùng, kháng viêm giảm đau (Vatikuti Ciddi 2005) Công thức St John đáng giá khoảng 210 US$ 570 triệu đô Mỹ khắp giới Nuôi cấy in vitro công cụ hấp dẫn để tăng sinh khối sản xuất hợp chất thứ cấp từ H.perforatum (Cellarova et al., 1992; Zdunek Alfermann 1992; Murch et al 2000; Pretto Santrarem 2000; Zobayed et al.2004) Sự phát triển invitro, gia tăng sản xuất hóa chất có nguồn gốc thực vật bị ảnh hưởng nhân tố chọn mô nuôi cấy, độ tuổi, điều hịa phát thực vật Rễ nguồn mơ nhân giống in vitro gặp loài (Bhat et al 1992, Kelka Krishnamurthy 1998, Zobayed saxena, 2003; Vinocur et al 2000) Rễ phát triển liên tục bị cắt bỏ Mặc dù, thối hóa xảy cấy truyền liên tục, nhiên thao tác cấy mơi trường cứu chữa Agrobacterium rhizogenes dàn xếp biến đổi rễ có chấp nhận rộng rãi tiềm cho nuôi cấy số lượng lớn để sản xuất hợp chất thứ cấp cải tạo thực vật, nhiên, rễ cho sản phẩm bản, làm chết tế bào động vật (Paek et al.2005) Bởi phải ý tập trung tiềm vỏ rễ nuôi cấy in vitro Hơn việc sử dụng quy trình cho vi nhân giống ni cấy rễ để sản xuất hóa chất từ thực vật có thành tựu lớn lao đáng ý suốt vài năm vừa qua (Ziv 2005; Hvoslef- Eide et al 2005; Srivastava Srivastava , 2007) Nuôi cấy số lượng lớn rễ theo quy trình cung cấp điều kiện tốt cho sinh khối sản xuất hợp chất thứ cấp ngang hay cao rễ ngồi tự nhiên -Việc thiết kế quy trình thích hợp việc xem xét vài yếu tố giới hạn: vật liệu hóa chất (chất dinh dưỡng kiếm được, hấp thụ được, thoát oxy, ) nhân tố khác khuôn chống đỡ phù hợp để nuôi cấy vật mỏng manh rễ thực vật nhạy cảm Lọ Grotek sử dụng thành công để tăng sinh khối (tiết kiệm, thuận lợi) nuôi cấy rễ - Trật tự mô phân sinh xem xét cách tổng quát để kháng thay đổi xảy gene suốt trình phân chia TB phương thức xem xét để nâng cao tính ổn định di truyền với loại thực vật Tần số biến dị dòng soma phụ thuộc vào nhân tố loài, kiểu gene, loại mô cấy,thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện ni cấy trì cấy truyền liên lục Trong việc tìm tất suy xét này, có cơng nghệ đơn giản cho vi nhân giống H.perforatum, rễ phát triển in vitro từ hai nguồn khác ngẫu nhiên môi trường lỏng Tăng lọ Grotek đánh giá độ tin cậy thực vật tái tạo từ rễ từ hai nguồn thơng qua phép phân tích RAPD VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP: 1/ Vật liệu: H.perforatum L chọn từ Bageshwar (Uttrakhand, Ấn Độ) giữ điều kiện nhà kính nơng trại ngun cứu CIMAP, Lucknow a) Vô mẫu: Ngọn chồi non khử trùng bề mặt với ethyl alcohol 70% khoảng 30 giây  rửa nước cất vô trùng 0,15 HgCl2 phút  rửa nước cất vơ trùng Ban đầu, cấy mẫu có độ dài 2-3cm cắt bỏ chồi với 1-2 đốt gồm nụ nách môi trường MS, môi trường bổ sung Kn 2,4 D riêng rẽ hay kết hợp (nồng độ 0.0; 0.25; 0.5; 1.0; 2.0 5.0 mg/l), pH 5.86 0.02, hấp khử trùng 121 oC, 15 phút Điều kiện nuôi cấy To25 ±2oC, sử dụng ánh sáng trắng cường độ ánh sáng 20 µmol m -2 s1 Tối thiểu có trì cho nghiệm thức Sự nhân chồi phản ứng phát sinh mô sẹo kiểm tra sau tuần nuôi cấy b) Cảm ứng tạo rễ từ nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo truyền sang môi trường chứa IAA, IBA, NAA ( 1.0, 2.0 4.0 mg/l ) riêng rẽ hay kết hợp với Kn ( 0.1, 0.2, 0.4 mg/l) lọ 100ml chứa 40ml môi trường +35 sucrose +0.8 % agar Và môi trường đối chứng (khơng có chất điều hịa thực vật) Theo dõi ghi chép nghiệm thức thí nghiệm lặp lại lần Tần số cảm ứng rễ kiểm tra sau tuần nuôi cấy c) Sự mọc rễ micro-shoot(vi chồi) in vitro: Trong in vitro chồi phát triển 3.0 – 4.0 cm cắt bỏ chuyển vào mơi trường MS MS ½ bổ sung auxin khác IAA, IBA NAA ( 1.0, 2.0 4.0 mg/l) Và mơi trường MS, MS ½ đối chứng Khoảng 15 trì cho ngiệm thức Xác định số lượng rễ phát triển phát sinh, số rễ/mô sau tuần nuôi cấy Số lượng rễ chồi so sánh ANOVA Student t-test ứng dụng để so sánh nghiệm thức riêng lẻ d) Sự phát triển rễ cắt bỏ môi trường bán rắn: Đoạn rễ dài khoảng 2cm khơng có nhánh bên cắt từ nuôi cấy mô sẹo chồi nuôi cấy tách biệt pertri chứa môi trường MS ½ + IAA IBA (1, 2, mg/l) Và môi trường đối chứng e) Sự phát triển rễ bị cắt môi trường lỏng: Đoạn rễ (200mg) dài khoảng 2-3cm bị cắt từ chồi nuôi cấy hay mô sẹo phát triển môi trường bán rắn chuyển vào môi trường lỏng MS ½ gồm 0.5, 1, 2, mg/l IAA IBA lọ 250ml với 30ml môi trường Và môi trường đối chứng Ủ 75rpm máy lắc phịng ni cấy Ghi chép hệ Kết bổ sung nồng độ khác (0.1, 0.5, 2mg/l) cytokinin( TDZ,BAP Kn) vào môi trường ni cấy tiềm phát sinh hình thái rễ kiểm tra Thông số: tổng số chồi nụ chồi, độ dài chồi với phát triển rễ ghi chép Thông số tương tự ghi chép sau tuần phát triển rễ lọ 250ml chứa 30g giọt thủy tinh (glass bead) (3-4mm) khoảng chống chịu bình Grotek gồm 250ml mơi trường lỏng điều kiện khơng đổi Trong bình Grotek, khoảng 1g TB rễ ghép vào raft? Tối thiểu trì cho nghiệm thức thí nghiệm lặp lại lần phân tích ANOVA Chỉ số phát triển tính tốn cơng thưc: Chỉ số phát triển Đánh giá độ tin cậy tái sinh từ rễ bất định Độ tin cậy gene mẫu đối chứng, rễ bất định từ nguồn khác (ngọn chồi mô sẹo in vitro) lựa chọn ngẫu nhiên từ nhà kính làm PCR dựa vào kĩ thuật RAPD DNA mô non tươi (1g) mẫu đánh dấu từ đến 15, mẫu số đại diện cho mẹ, mẫu số rễ thu từ nuôi cấy mô chồi mô sẹo, 4-15 mẫu lựa chọn ngẫu nhiên từ trồng nhà kính Kiểu NTSys PC 2.02j sử dụng để biểu diễn tập hợp thơng tin hồn thành Đánh giá tương tự tính tốn sử dụng hệ số Nei Li (Nei Li 1979) tập hợp thông số kĩ thuật tiến hành phương pháp UPGMA (Unweighted pair group method arithmetic mean averages) biểu diễn sơ đồ nhánh KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sự thành lập điều kiện vô trùng Sự phát sinh chồi vào tạo mô sẹo quan sát sau tuần thành lập môi trường MS bổ sung 5.0mg l-1 Kn MS bổ sung 0.5 mg l-1 2,4D 0.25 mg l-1 Kn Các cấu trúc mô sẹo sử dụng nguồn ban đầu nghiên cứu Thành lập rễ từ mô sẹo Dữ liệu thu nhận sau tuần cấy mô sẹo cho thấy, thử nghiệm hầu hết tất auxin IAA, IBA NAA có IAA thúc đẩy phát triển rễ nhanh hơn, NAA khuyến khích cho phát sinh mơ sẹo Dấu hiệu phát sinh rễ từ mô sẹo quan sát thấy sau tuần sinh trưởng môi trường MS bổ sung 4.0 mg l-1 IAA Số lượng rễ cao 48.0 ± 6.06/mẫu với độ dài trung bình 2.25 ± 0.78 cm thể môi trường MS bổ sung IAA (4.0 mg l-1) Mẫu mô sẹo môi trường hormone tự không thấy phát triển rễ Sự thành lập in vitro vi chồi Dữ liệu thu nhận sau tuần cho thấy IAA IBA (1.0, 2.0 4.0 mg l -1) cho kết hiệu phát triển rễ mô chồi (Hình 1b) Ở nồng độ thấp (1.0 hoăc 2.0 mg l-1) IAA IBA cho kết hiệu so với nồng độ cao (4.0 mg l -1) Hình 1: IBA mơi trường MS ½ nồng độ nghiệm thức cho 100% cảm ứng tạo rễ mô chồi Hiệu tạo rễ cao mơi trường MS ½ so với môi trường MS NAA tất nồng độ MS ½ MS ức chế hình thành phát triển rễ đồng thời hỗ trợ phát triển mô sẹo Các liệu cảm ứng auxin gây dẫn đến thành lập mô chồi thể bảng Sự phát triển rễ cắt bỏ môi trường bán rắn Sự tạo rễ mơi trường bán rắn cho thấy q trình phát triển rễ hỗ trợ tốt điều kiện MS ½ bổ sung IAA 4.0 mg l -1 sau tuần (Hình 1c) Trên rễ trung bình 14.6 ± 1.82 với độ dài 1.82 ± 0.62 cm tạo mẹ (1cm phần rễ) Sự phân hố chồi khơng quan sát thấy môi trường bán rắn IAA IBA (1.0 – 4.0 mg l-1) ảnh hưởng kết nhiều phát triển rễ MS ½ môi trường MS Sự phát triển rễ cắt bỏ phân hố chồi de novo mơi trường lỏng Quan sát thấy nồng độ thay đổi IAA (0.5, 1.0, 2.0 hoăc 4.0 mg l -1) bổ sung mơi trường MS ½ thúc đẩy phát triển rễ lẫn phát triển chồi từ mơ rễ ban đầu Trong đó, nồng độ IAA tương tự môi trường MS thúc đẩy phát triển rễ Sự hình thành chồi từ rễ in vitro sau tuần phát triển nốt nhỏ mô phát triển mạnh phần cuối gần gốc (hình 1d) sau tuần có phần cuối ngoại vi Tuyến hypericin ý (hình 1e) Các rễ so sánh dày hơ, màu nâu đậm hố gỗ lớp ngồi, cung cấp chồi (Hình 1f), rễ thường mảnh trắng, khơng sản xuất chồi Cảm ứng phát sinh hình thái phân cực rễ mẹ quan sát thấy sớm ((Kelkar Krishnamurthy 1998; Vinocur et al 2000) Dữ liệu thu nhận sau tuần phát sinh chồi cho thấy rễ were mor ecopiously branched, dài dày MS ½ so với MS nguyên Sự phát triển rễ cảm ứng phát sinh chồi MS nguyên bổ sung 1.0 mg l-1 IAA cao hầu hết nồng độ thí nghiệm (bảng 5) Sử dụng 200 mg rễ inoculum (chất tiêm chủng); tổng sinh khối ̴ 4.13 ± 0.67g bao gồm 226 ± 34.4 chồi rễ cấu trúc mà rễ thu (Hình 5, hình 2a) Ở chồi trung bình 9.4/cm phát triển từ rễ đơn môi trường mô lỏng Chiều dài TB (5.61 ± 1.0 cm) rễ cao (1.82 ± 0.062) kể mơi trường bán rắn Khi rễ hình thành sau phân hố chồi mơi trường MS ½ bán rắn bổ sung IAA (1.0 mg -1 l ), chồi bắt đầu phát triển tuần thành lập, nhiên, độ dài chồi ngắn nhiều so với nuôi cấy môi trường lỏng Chỉ số phát triển gia tăng cao với số chồi thu nhận môi trường lỏng bổ sung với hạt thuỷ tinh Growtek điều kiện mô thể bảng Khi rễ thành lập môi trường lỏng 0.1, 0.5, 1.0 2.0 mg l -1 TDZ BAP, rễ chuyển sang tượng hoa phân hố chồi khơng quan sát Tuy nhiên, thành lập rễ 2.0 mg l-1 Kn tuần cáy chuyền sang mơi trường MS ½ bổ sung 1.0 mg l-1 IAA tăng tỉ lệ tái sinh chồi (247 ± 41) (Hình 2c) Tất chồi tái sinh có hình thái tương tự Ước lượng dịng xác phân hố thực vật từ rễ bất định Khoảng 48 dải mở rộng tái sinh sản xuất phân tích RADP 12 phát triển in vitro, điều khiển mẹ mẫu chồi từ nguồn sử dụng 11 mẫu mồi 12 nucleotide ngẫu nhiên Số lượng dải tạo primer xếp từ đến (Hình 3) Tất primer nhiều dạng tạo số tượng đa hình, 48 dải 21 (43.75%) đơn hình cịn lại 27 (54.25%) đa hình Phân tích cụm tái as dendrogram on the basis of similarity co-efficient generated from liệu RAPD 48 dải xuất vùng tương tự từ 0.84 đến 0.99 Tất 20 nghiệm thức nhóm lại thành nhóm cụm với mức độ 84% (Hình 4) Các rễ in vitro có nguồn gốc từ chồi mô sẹo cho kết tương tự từ 99-95% với mẹ Từ nghiên cứu này, rõ ràng thay đổi diện vi nhân giống H.perforatum Tính đa hình dải mở rộng cho kết từ thay đổi trình tự primer-binding site (ví dụ đột biến điểm) thay đổi trình tự, làm thay đổi kích thước ngăn cản mở rộng thành cơng DNA đích (ví dự thêm, bớt, đảo) (Williamsetal 1990) Sử dụng công nghệ RADP, diện đột biến di truyền vi nhân giống phát sinh từ chồi báo cáo (Hashmietal 1997; Watanabeetal 1998; Bindiya and Kanwar 2003) Mặt khác, vài báo cáo khác cơng bố, khơng có dịng soma biến đổi phát sử dụng marker phân tử (Rani and Raina 2000) Điều thiếu sai biệt phương thức phát đủ nhạy cảm vấn đề tranh cãi Tuy nhiên, phân tích thực nghiệm phần nhỏ tổng số gene, tiểu sử đoạn DNA đa hình chưa phát có thay đổi gen có ổn định trình tự lưa chọn đặc thù (Harding 2004) Sự đa hình tích luỹ đột biến trình phát sinh quan gián tiếp phát triển dòng thời gian dài Tuy nhiên, vài báo cáo gần đây, tính đa hình gene kèm với nghiên cứu trao đổi chất thứ cấp mang lại lợi ích quan trọng Nghiên cứu đa hình dịng soma vi nhân giống H perfornatum đưa sử dụng RFLP (Halusskova Cellarova 1997) phân tích phát sinh tế bào (Brutovska cộng sự, 1998) Tuy nhiên nghiên cứu pân tích RADP không khả dụng Ngày nhiều công nghệ phức tạp RFLP, giá cao sử dụng đồng vị phóng xa phổ biến phương pháp phát có số bất lợi ứng dụng thơng thường hệ thống vi nhân giống Do RAPD phá vỡ vài vấn đề có liên quan tới phân tích RFLP Theo hiểu biết tốt nay, địi hỏi báo cáo phân tích dịng cách xác tái sinh từ rễ bất định Từ kết có cho thấy tính tồn vẹn gene thực vật vi nhân giống xác định trước chuyển đồng Sự đầu tư cho thấy tằng phát triển rễ bất định invitro khơng kể nguồn đáp ứng nguồn nguồn luân phiên mẹ cho bước đầu sản xuất invitro Xa hơn, môi trường lỏng tốt cho phát triển chồi rễ nhanh Các nghiên cứu chứng minh tìm thấy sớm nơi đoạn rễ hạt sử dụng nguồn mẹ (Zobayed Saxena 2003), nhiên hoạt động gần tỉ mỉ xác sử dụng rễ bất định để pát triển chồi mô sẹo in vitro cho nguồn cung cấp Hơn nữa, đầu tư yêu cầu nguồn dinh dưỡng thấp, yêu cầu auxin thấp bước đầu phụ thuộc cytokinin cho sản phẩm phân chia chồi tái sinh chồi, gây nên nồng độ cytokinin nội sinh Bổ sung cytokinin (Kn) làm tăng hoạt động phân chia chồi Điều có lợi nghiên cứu hướng phát sinh hình thái ứng dụng đánh giá hiệu Trong nghiên cứu chúng ta, TDZ khơng kích thuchs phát sinh chồi nghiên cứu trước (Zobayed Saxena 2003) Các vùng gần đỉnh sản xuất với số lượng lớn chồi vùng, tổng số chồi từ rễ cắt cao so với rễ tồn vẹn khơng bị cắt Điều giống vùng gần đỉnh, gần với chồi, chứa đựng nồng độ hormone nội sinh cao nồng độ nhân tố phá triển cần cho tái sinh chồi Cũng hoạt động vùng kéo dài ngoại biên vùng có số lượng giới hạn tế bào có khả đáp ứng Điều cho cắt bề mặt tiếp xúc với môi trường tốt hoăc ảnh hưởng vết thương – điều khiển tái biệt hố lập invitro (Vinocur cộng sự, 2000) Kể hỗ trợ matrix hạt thuỷ tinh pha môi trường tĩnh làm tăng phân chia kéo dài chồi (Hình 2B) Hạt thuỷ tinh sử dụng thành công chất hỗ trợ gian bào địi hỏi có khả nhân giống Rauwwolfia serpentina (Goel cộng 2007) Cũng nghiên cứu gần đây, hạt thuỷ tinh hồn lại mơ rễ để trì điều kiện ngập úng phần chất tĩnh hạt thuỷ tinh hỗ trợ mô ống Growtek chứng tỏ ý nghĩa hiệu giá trị thời kỳ nạp lượng Do lựa chọn hệ thống mơ ống (Growtek) có hiệu quả, đơn giản, tiết kiệm thời gian hệ thống có hiệu giá trị cao đặt sản xuất (Hình 2d,e) Hơn nữa, dễ dàng để thu hoạch sinh khối Mặc dù Growtek TM bioreactor thí nghiệm quy mơ, xa mở rộng quy mơ có thể; nheiefu nghiên cứu địi hỏi thơng qua nghị định thư với quy mô lớn Dey (2002), thành công sử dụng mô ống Growtek cho dòng khối lượng hiệu giá trị vài kinh tế quan trọng Bổ sung dinh dưỡng oxigen làm tăng lên rõ ràng phát triển sinh khối mơ hỗ trợ mảng giữ cho mô không thay đổi tiếp xúc với mơi trường.Có sản xuất khơng ngừng rễ suốt với chồi môi trường giống bước Rễ invitro trì tiềm tạo hình đến phân hố Các vi chồi sản xuất phân chia xa tạo rễ, chúng biết khả chúng cho sản xuất sinh khối vô trùng sử dụng quy mơ lớn mơ lỏng sử dụng ống Growtek làm tăng nhanh phát triển với bioreactor kích thước lớn  ... chống đỡ phù hợp để nuôi cấy vật mỏng manh rễ thực vật nhạy cảm Lọ Grotek sử dụng thành công để tăng sinh khối (tiết kiệm, thuận lợi) nuôi cấy rễ - Trật tự mô phân sinh xem xét cách tổng quát... môi trường lỏng Tăng lọ Grotek đánh giá độ tin cậy thực vật tái tạo từ rễ từ hai nguồn thơng qua phép phân tích RAPD VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP: 1/ Vật liệu: H.perforatum L chọn từ Bageshwar (Uttrakhand,... RAPD phá vỡ vài vấn đề có liên quan tới phân tích RFLP Theo hiểu biết tốt nay, địi hỏi báo cáo phân tích dịng cách xác tái sinh từ rễ bất định Từ kết có cho thấy tính tồn vẹn gene thực vật vi nhân