ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC LÊ THỊ TÂM NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG NGƢNG TẬP TIỂU CẦU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) TRÊN IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC Ngƣời thực hiện: LÊ THỊ TÂM NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG NGƢNG TẬP TIỂU CẦU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) TRÊN IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Dƣơng Thị Ly Hƣơng TS.Vũ Thị Thơm Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, ĐHQGHN, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bộ môn Y Dược học sở tạo điều kiện cho em làm khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa dìu dắt, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập suốt năm qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PSG.TS Dương Thị Ly Hương, TS Vũ Thị Thơm người tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Bộ môn Dược lí – Dược lâm sàng Bộ môn Y Dược học sở giúp đỡ em trình thực khóa luận Em xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 tài trợ kinh phí để em thực nội dung nghiên cứu Em xin cảm ơn Khoa Xét nghiệm Huyết Học, Bệnh viện Bạch Mai giúp đỡ em thực thí nghiệm Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người thân quan tâm, động viên giúp em hoàn thành khóa luận Dù cố gắng, lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 06 năm 2017 Sinh viên Lê Thị Tâm DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu AA ADP AMP ATP CADP CEPI COX-1 CT EtOAc GP IC 50 LC 50 MDA MPA NTTC PBBt PBEA PBEt PBT PPP PRP PSBt PS DCM PSnH PST SVD TTH TXA2 vWF Giải nghĩa Acid arachidonic Adenosin diphosphat Adenosin monophosphate Adenosin triphotphat Collagen Adenosin diphotphat (Collagen+ADP) Collagen Epinephrine Cyclooxygenase Thời gian lấp kín (Closure time) Ethylacetat Glycoprotein Liều ức chế 50 % đối tượng thử (Inhibitory concentration 50%) Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%) Malondialdehyde Độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation) Ngưng tập tiểu cầu Phân đoạn n-butanol Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Butanol) Phân đoạn ethylacetat Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Ethylacetat) Phân đoạn ete Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Ete) Cao tổng Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Total) Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma) Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) Phân đoạn n-butanol Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Butanol) Phân đoạn diclomethan Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Diclomethan Phân đoạn n-hexan Tam thất hoang (Panax stipuleanatus nHexan) Cao tổng Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Total) Sâm vũ diệp Tam thất hoang Thromboxan A2 Von-Willerbrand DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Bảng Trang Bảng 1.1 Các receptor bề mặt tiểu cầu Bảng 1.2 Các hợp chất saponin phân lập từ Tam thất hoang 20 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên Hình Trang Hình 1.1 Các glycoprotein màng tiểu cầu chức chúng Hình 1.2 Cấu trúc tiểu cầu Hình 1.3 Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu ADP Hình 1.4 Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu acid arachidonic Hình 1.5 Quá trình ngưng tập tiểu cầu Hình 1.6 Vai trò tiểu cầu trình đông cầm máu Hình 1.7 Nguyên lí hệ thống PFA-100 12 Hình 1.8 Nguyên lí xét nghiệm ngưng tập tiểu cầu 13 Hình 1.9 Các đích tác dụng thuốc ức chế ngưng tập tiểu cầu 14 Hình 1.10 Cơ chế ức chế ngưng tập tiểu cầu aspirin 15 Hình 1.11 Sâm vũ diệp 16 Hình 1.12 Tam thất hoang 16 Hình 1.13 Hợp chất saponin khung oleanane từ thân rễ Sâm vũ diệp 18 Hình 1.14 Thành phần hoá học Tam thất hoang 19 Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dịch chiết Tam thất hoang 23 Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp 24 Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm 26 Hình 3.1 Ảnh hưởng phân đoạn tổng Sâm vũ diệp đến độ NTTC Hình 3.2 Ảnh hưởng phân đoạn n-butanol Sâm vũ diệp đến độ NTTC 27 27 Hình 3.3 Ảnh hưởng phân đoạn ethylacetat Sâm vũ diệp đến độ NTTC Ảnh hưởng phân đoạn ete Sâm vũ diệp đến độ NTTC 28 Hình 3.5 So sánh hiệu làm giảm độ ngưng tập tiểu cầu phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp 29 Hình 3.6 Ảnh hưởng phân đoạn tổng Tam thất hoang đến độ NTTC 30 Hình 3.4 Ảnh hưởng phân đoạn n-butanol Tam thất hoang đến độ NTTC Ảnh hưởng phân đoạn n-hexan Tam thất hoang đến độ Hình 3.8 NTTC Ảnh hưởng phân đoạn diclomethan Tam thất hoang đến độ Hình 3.9 NTTC So sánh hiệu làm giảm độ ngưng tập tiểu cầu phân Hình 3.10 đoạn dịch chiết Tam thất hoang Hình 3.7 28 30 31 31 32 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN .2 1.1 Sinh lý học tiểu cầu 1.1.1 Đời sống tiểu cầu .2 1.1.2 Cấu trúc tiểu cầu 1.1.3 Chức tiểu cầu 1.2 Các xét nghiệm đánh giá chức tiểu cầu 10 1.3 Các thuốc kháng tiểu cầu 13 1.4 Vài nét sơ lƣợc hai loài Sâm vũ diệp Tam thất hoang 16 1.4.1 Đặc điểm thực vật 16 1.4.2 Thực trạng phân bố .17 1.4.3 Thành phần hóa học 17 1.4.4 Công dụng .21 1.4.5 Các nghiên cứu nước hoá học dược lý 21 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên liệu, đối tƣợng nghiên cứu 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Kết 27 3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu Sâm vũ diệp .27 3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu Tam thất hoang 29 3.2 Bàn luận 33 Kết luận: 37 Đề xuất: 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh lý huyết khối nhóm bệnh có số bệnh nhân tử vong cao giới Huyết khối nguyên nhân hàng đầu tắc nghẽn mạch máu gây tử vong để lại di chứng nặng nề cho người bệnh [30] Nhiều nghiên cứu cho thấy tiểu cầu đóng vai trò quan trọng trình hình thành huyết khối Ngay kích hoạt, tiểu cầu thực trình bám dính, phóng thích, ngưng tập tiểu cầu tạo cục máu đông dẫn đến hình thành huyết khối [18] Vì vậy, thuốc kháng tiểu cầu liệu pháp lý tưởng phòng điều trị bệnh lý liên quan đến huyết khối [30] Bên cạnh thuốc khẳng định giá trị phòng điều trị huyết khối aspirin, clopidogrel, … việc tiếp tục tìm kiếm thuốc có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu vấn đề đáng quan tâm nhà khoa học Đặc biệt, với xu quay trở với giá trị thiên nhiên, việc tìm kiếm thuốc có nguồn gốc tự nhiên đối tượng quan tâm nghiên cứu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) hai loài thuộc chi Panax, họ Nhân sâm (Araliacea), loài sâm đặc hữu vùng Tây Bắc, phân bố chủ yếu vùng núi Hoàng Liên Sơn [15] Theo kinh nghiệm dân gian, Sâm vũ diệp Tam thất hoang dùng làm thuốc bổ giống loài sâm khác, có tác dụng giảm đau, bổ huyết, cầm máu,…[12].Tuy nhiên, nghiên cứu dược lý độc tính tiến hành tương đối đầy đủ số loài thuộc chi Panax (như Nhân sâm, Tam thất gần Sâm Việt Nam [24]) nghiên cứu hai loài Sâm vũ diệp Tam thất hoang nhìn chung hạn chế Các nghiên cứu ban đầu thành phần hóa học Sâm vũ diệp Tam thất hoang cho thấy rễ hai loài có chứa saponin khung dammaran oleanan với hàm lượng cao [10,34,37,46] Saponin thành phần hóa học tìm thấy loài khác thuộc chi Panax [51] Đặc biệt, saponin số loài thuộc chi Panax chứng minh có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu [35] Liệu với thành phần giàu saponin rễ Sâm vũ diệp Tam thất hoang, hai loài có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu không? Để làm sáng tỏ điều đó, thực đề tài: “Nghiên cứu tác dụng chống ngƣng tập tiểu cầu phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp Tam thất hoang in vitro”, với mục tiêu: Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu phân đoạn dịch chiết Tam thất hoang CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý học tiểu cầu Tiểu cầu tế bào máu nhỏ nhất, nhân, đường kính 3-4µm, sản xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu tuỷ xương Số lượng tiểu cầu lưu hành máu ngoại vi khoảng 150 - 450 × 109/L Nguyên mẫu tiểu cầu bắt nguồn từ tế bào nguồn dòng tủy, tế bào gốc sinh máu tạo nên Mỗi mẫu tiểu cầu tạo 3000 tiểu cầu [23] 1.1.1 Đời sống tiểu cầu Tiểu cầu có đời sống ngắn, khoảng từ 8-14 ngày Với điều kiện lắc liên tục thể nhiệt độ phòng lưu giữ tiểu cầu khoảng ngày [23] 1.1.2 Cấu trúc tiểu cầu Tiểu cầu có kích thước 2-4mm, thể tích 7-8mm3 Bình thường có 150-450× 109 tiểu cầu lít máu ngoại vi [23] Quan sát kính hiển vi điện tử cho thấy tiểu cầu có siêu cấu trúc phức tạp gồm lớp màng, hạt, hệ thống vi ống, hệ thống kênh mở [23]  Màng tiểu cầu Gồm lớp lipid kép bao quanh tiểu cầu, glycoprotein quan trọng, đóng vai trò receptor bề mặt, nơi diễn số hoạt động đông máu tiểu cầu [23] Các receptor tiểu cầu trình bày tóm tắt bảng 1.1 Bảng 1.1 Các receptor bề mặt tiểu cầu [42] Các loại receptor Cấu trúc Chức năng/ phối tử GP IIb/ IIIa Integrin αIIbβ3 Receptor fibrinogen, v-WF, fibronectin, vitronectin, thrombospondin GP Ia/IIa Integrin α2β1 Receptor collagen GP Ib/IX/V Leucin Receptor v-WF GP VI Họ Receptor globulin miễn dịch Receptor collagen Glycoprotein (GP) bề mặt tiểu cầu Các thành phần quan trọng màng tiểu cầu: Glycoprotein Ib (GPIb): protein xuyên màng có nhiệm vụ liên kết với yếu tố vWF giúp cho tiểu cầu dính bám vào collagen Glycoprotein IIb/IIIa (GP IIb/IIIa): protein màng, hoạt động phụ thuộc vào ion Ca, có nhiệm vụ liên kết với fibrinogen, giúp cho tiểu cầu ngưng tập với tạo thành đinh cầm máu Chức chúng thể hình 1.1 [23] Hình 1.1 Các glycoprotein màng tiểu cầu chức chúng [23] Ngoài ra, phospholipid điện tích âm, đặc biệt phosphatidylserin (PS) có vai trò quan trọng trình đông máu, chất ban đầu cho phản ứng enzym tiểu cầu để tạo thromboxan A2 (TXA2), sản phẩm quan trọng trình hoạt hóa tiểu cầu chất chủ vận mạnh gây nên trình ngưng tập tiểu cầu Màng tiểu cầu có khả nhận chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên [42]  Hệ thống vi ống vi sợi Vi ống: nằm cạnh màng tiểu cầu tạo nên khung đỡ tham gia vào hoạt động co rút tiểu cầu bị kích thích [23] Vi sợi: gốm sợi actin, liên hệ chặt chẽ với vi ống tham gia vào hoạt động tạo giả túc tiểu cầu [23] Nhận xét: Hầu hết mức liều phân đoạn Ete Sâm vũ diệp (1-2-5 mg/mL) làm giảm đáng kể độ ngưng tập tiểu cầu so với chứng DMSO (với p