ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC NGUYỄN THỊ TUYẾT TRINH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG ĐÔNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) TRÊN IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC Ngƣời thực hiện: NGUYỄN THỊ TUYẾT TRINH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG ĐÔNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) TRÊN IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Dƣơng Thị Ly Hƣơng TS Vũ Thị Thơm Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn Ban chủ nhiệm khoa YDƣợc, Đại học Quốc Gia Hà Nội, môn Dƣợc lý - Dƣợc lâm sàng, Bộ môn Y - Dƣợc học sở tạo điều kiện cho em để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giảng dạy, giúp đỡ em hoàn thành chƣơng trình học tập suốt năm qua Em xin bày tỏ tri ân lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Dƣơng Thị Ly Hƣơng, TS Vũ Thị Thơm, ngƣời tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô môn Dƣợc lý - Dƣợc lâm sàng, thầy cô môn Y - Dƣợc học sở giúp đỡ em trình hoàn thành khóa luận Em xin cảm ơn chƣơng trình thuộc đề tài Tây Bắc: “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ loài thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 tài trợ kinh phí để em thực đƣợc nội dung nghiên cứu Em xin cảm ơn Khoa Xét nghiệm Huyết Học, Bệnh viện 19.8 - Bộ Công An giúp đỡ em thực thí nghiệm Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ngƣời thân quan tâm, động viên, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Dù cố gắng, nhƣng lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy cô để khóa luận thêm hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Tuyết Trinh DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải nghĩa APTT Thời gian thromboplastin phần hoạt hóa (Activated Partial Thromboplastin Time) DIC Đông máu nội mạc rải rác (Disseminated Intravascular Coagulation) DMSO Dimethyl sulfoxide HP Heparin IC50 Liều ức chế 50% đối tƣợng thử (Inhibitory Concentration 50%) INR Chỉ số bình thƣờng hóa quốc tế (International Nomalized Ratio) LD50 Liều gây chết 50% đối tƣợng thử (Lethal Dose 50%) PBBt Cao chiết dung môi n - butanol Sâm vũ diệp PBEA Cao chiết dung môi ethyl acetat Sâm vũ diệp PBEt Cao chiết dung môi ete Sâm vũ diệp PBT Cao tổng chiết dung môi ethanol 70% Sâm vũ diệp PSBt Cao chiết dung môi n - butanol Tam thất hoang PSnH Cao chiết dung môi n - hexan Tam tất hoang PST Cao tổng chiết dung môi ethanol 70% Tam thất hoang PSW Cao chiết dung môi nƣớc Tam thất hoang PT Thời gian Prothrombin (Prothrombin Time) SVD Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) TTH Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M.Feng) v/v Thể tích/Thể tích DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ đông máu Hình 1.2 Mạng lƣới fibrin giam giữ hồng cầu Hình 1.3 Nguyên lý quy trình xét nghiệm đo thời gian PT 13 Hình 1.4 Nguyên lý quy trình xét nghiệm đo thời gian APPT 15 Hình 1.5 Nguyên lý quy trình xét nghiệm định lƣợng fibrinogen 17 Hình 1.6 Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 18 Hình 1.7 Hợp chất saponin khung oleanan từ rễ SVD 19 Hình 1.8 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) 21 Hình 1.9 Thành phần hóa học TTH 22 Hình 2.1 Sơ đồ chiết thu phân đoạn SVD 25 Hình 2.2 Sơ đồ chiết thu phân đoạn TTH 26 Hình 2.3 Ống đông máu chứa sodium citrat 3,8% 28 Hình 2.4 Pipet 28 Hình 2.5 Máy ACL TOP500 nguyên lý đo quang máy ACL TOP500 29 Hình 3.1 Ảnh hƣởng phân đoạn dịch chiết SVD lên số đông máu nội sinh APTT(s) 34 Hình 3.2 Ảnh hƣởng phân đoạn dịch chiết TTH lên số đông máu nội sinh APTT(s) 37 DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 3.1 Ảnh hƣởng PBT thời gian đông máu in vitro 31 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng PBBt thời gian đông máu in vitro 32 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng PBEA thời gian đông máu in vitro 33 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng PBEt thời gian đông máu in vitro 33 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng PST thời gian đông máu in vitro 35 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng PSBt thời gian đông máu in vitro 35 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng PSnH thời gian đông máu in vitro 36 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng PSW thời gian đông máu in vitro 37 MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý trình đông máu 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Cơ chế đông máu 1.2 Điều hòa đông máu sinh lý 1.3 Rối loạn đông máu 1.3.1 Rối loạn bẩm sinh 1.3.2 Rối loạn mắc phải 1.4 Các xét nghiệm đông máu 13 1.4.1 Thời gian Prothrombin 13 1.4.2 Thời gian thromboplastin phần hoạt hóa 15 1.4.3 Định lượng fibrinogen 16 1.5 Tổng quan Sâm vũ diệp Tam thất hoang 18 1.5.1 Sâm vũ diệp……………………………………………………….18 1.5.2 Tam thất hoang 20 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Khía cạnh đạo đức nghiên cứu 24 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.3 Phƣơng pháp 27 CHƢƠNG - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 31 3.1 Kết thực nghiệm 31 3.1.1 Sâm vũ diệp 31 3.1.2 Tam thất hoang 34 3.2 Bàn luận 38 CHƢƠNG - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43 4.1 Kết luận 43 4.2 Đề xuất 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, việc sử dụng thuốc chống đông máu dự phòng điều trị bệnh nguyên nhân huyết khối đóng vai trò quan trọng Các thuốc chống đông máu nhƣ heparin, wafarin, cho thấy hiệu điều trị tốt Tuy nhiên mặt hạn chế thuốc gây nhiều tác dụng phụ nhƣ: giảm tiểu cầu, dị ứng… [16] Y- dƣợc học giới nƣớc có xu hƣớng sử dụng thuốc có nguồn gốc thực vật để nhằm hạn chế tác dụng không mong muốn Việt Nam có hai loài sâm mọc tự nhiên vùng núi cao phía Tây Bắc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) thuộc họ Ngũ gia bì - Araliace theo kinh nghiệm dân gian có tác dụng giảm đau, hoạt huyết, bổ máu [13] Tuy nhiên nghiên cứu tác dụng sinh học hạn chế Cả loài thuốc đặc biệt quý có nguy tuyệt chủng nƣớc ta Các nghiên cứu ban đầu thành phần hóa học Sâm vũ diệp (SVD) Tam thất hoang (TTH) cho thấy rễ loài có chứa saponin khung dammaran oleanan với hàm lƣợng cao [50,57] Đặc biệt, saponin số thuộc chi Panax L đƣợc chứng minh có tác dụng chức đông máu [40,44] Để làm rõ sở khoa học giá trị sử dụng loài SVD TTH, góp phần sử dụng hợp lý hóa tài nguyên thiên nhiên áp dụng giải pháp khoa học công nghệ nhằm phát triển dƣợc liệu vùng, đặc biệt nghiên cứu tác dụng trình đông máu, thực đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống đông máu phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp Tam thất hoang in vitro” Mục tiêu đề tài là: - Xây dựng mô hình đánh giá tác dụng chống đông máu in vitro - Nghiên cứu tác dụng chống đông máu in vitro phân đoạn dịch chiết SVD TTH thông qua số PT APTT CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý trình đông máu Đông máu trạng thái tự bảo vệ thể, chuỗi phản ứng hóa học yếu tố đông máu có huyết tƣơng, mô tổn thƣơng tiểu cầu [25,36,39] Sau khỏi lòng mạch - phút, máu đông lại Trong máu mô có khoảng 50 chất có ảnh hƣởng tới trình đông máu Các chất kích thích trình gây đông máu gọi chất gây đông máu Các chất ức chế trình gây đông máu gọi chất chống đông Máu có đông hay không phụ thuộc vào cân chất gây đông máu chất chống đông máu Bình thƣờng, chất chống đông máu chiếm ƣu thế, chất gây đông dạng tiền chất hoạt tính, máu không đông trình lƣu thông mạch máu Khi máu, mạch máu bị tổn thƣơng, máu lấy thể, chất gây đông máu đƣợc hoạt hóa trở nên ƣu thế, đông máu đƣợc thực [11,15,25,36] 1.1.1 Định nghĩa Đông máu trình chuyển máu thể lỏng sang thể đặc, mà thực chất chuyển fibrinogen dạng hòa tan huyết tƣơng thành fibrin dạng không hòa tan dƣới xúc tác thrombin [20,25] 1.1.2 Cơ chế đông máu Lý thuyết dòng thác đông máu từ năm 1979 [15] hoạt hoá theo chuỗi từ tiền yếu tố zymogen thành dạng enzym hoạt hoá.Quá trình đông máu diễn qua giai đoạn (Hình 1.1) [20,25,36]: - Giai đoạn I: Hình thành phức hợp prothrombinase - Giai đoạn II: Hình thành thrombin - Giai đoạn III: Hình thành fibrin 1.1.2.1 Sự hình thành phức hợp prothrombinase Khởi động cho chế đông máu hình thành phức hợp prothrombinase Đây chế phức tạp kéo dài trình đông máu Quá trình đƣợc xảy có chấn thƣơng thành mạch mô, (***p