Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH LỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung Norovirus 1.1.1 Cấu tạo Norovirus 1.1.2 Cơ chế nhân Norovirus 1.2 Tác hại Norovirus đến sức khỏe 1.3 Tình hình nhiễm Norovirus Việt Nam giới 1.3.1 Tình hình nhiễm Norovirus giới 1.3.2 Tình hình nhiễm Norovirus Việt Nam 1.4 Đối tƣợng thực phẩm có nguy nhiễm Norovirus 1.5 Các phƣơng pháp xác định Norovirus 10 1.5.1 Phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử 10 1.5.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 10 1.5.3 Kỹ thật RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 11 1.5.4 Kỹ thuật RT-LAMP (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification) 12 1.6 Giới thiệu phƣơng pháp RT-LAMP 12 1.7 Một số nghiên cứu xác định Norovirus phƣơng pháp LAMP 18 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 19 Luận văn thạc sĩ khoa học 2.1 Phan Thị Thanh Hà Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1 Chủng vi rút 19 2.1.2 Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 19 2.1.3 Oligonucleotid 19 2.1.4 Hóa chất 19 2.1.5 Thiết bị 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 21 2.2.2 Phương pháp tách chiết tinh RNA vi rút 21 2.2.3 Phương pháp Real-time RT-PCR 23 2.2.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 25 2.2.5 Phương pháp giải trình tự gen 26 2.2.6 Phương pháp RT-LAMP 26 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1 Xác định trình tự đoạn gen mục tiêu chủng Norovirus Việt Nam 28 3.1.1 Phát Norovirus GI GII phương pháp Real-time RT-PCR 28 3.1.2 Xác định trình tự đoạn gen mục tiêu từ chủng Norovirus phát 32 3.2 Lựa chọn hiệu chỉnh mồi LAMP 32 3.2.1 Lựa chọn mồi LAMP 32 Lựa chọn mồi LAMP xác định Norovirus nhóm GI 33 Lựa chọn mồi LAMP xác định Norovirus nhóm GI 34 3.2.2 3.3 Hiệu chỉnh mồi LAMP 34 Tối ƣu hóa phản ứng RT-LAMP 40 3.3.1 Tối ưu lượng enzyme AMV Reverse transcriptase 41 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà 3.3.2 Tối ưu nhiệt độ nồng độ Betain 42 3.3.3 Tối ưu thời gian phản ứng 43 3.4 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP 45 3.4.1 Xác định độ nhạy phản ứng RT-LAMP 45 3.4.2 Xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP 46 3.5 Thử nghiệm quy trình tách chiết RNA 48 3.6 Xác định độ nhạy toàn quy trình 50 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên đầy đủ/ thuật ngữ Từ viết tắt AMV Avian Myeloblastosis Virus BIP Backward Inner Primer BYT Bộ Y tế DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FAO Tổ chức nông lƣơng lien hợp quốc FIP Forward Inner Primer G Genogroup LBP Loop Backward Primer LFP Loop Forward Primer NĐTP Ngộ độc thực phẩm NTP Nucleoside triphosphate ORF Open reading frame QLCL Quản lý chất lƣợng RdRp RNA dependent RNA polymerase RNA Ribonucleic acid RT-LAMP Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification RT-PCR Reverse transcriptase-polymerase chain reaction SFPA Ủy ban bảo vệ biển thủy sản VP Viral protein Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tổng hợp số nghiên cứu Việt Nam giới đặc điểm nhiễm Norovirus trẻ mắc viêm dày ruột trẻ khỏe mạnh Bảng 2.1 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR 23 Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng phản ứng Real-time RT-PCR 24 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RT-LAMP 27 Bảng 3.1 Danh sách mồi lựa chọn cho phản ứng RT-LAMP 39 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc Norovirus Hình 1.2 Cấu tạo vùng đọc mở Norovirus Hình 1.3 Cơ chế nhân Norovirus Hình 1.4 Phân nhóm Norovirus Hình 1.5 Phân bố tỉ lệ nhiễm Norovirus Rotavirus trẻ dƣới tuổi [30] Hình 1.6 Phân bố genotype Norovirus miền Bắc miền Nam Việt Nam năm 2010 Hình 1.7 Nguyên tắc phản ứng LAMP 16 Hình 2.1 Quy trình tách chiết RNA Trizol 21 Hình 2.2 Quy trình tinh RNA theo phƣơng pháp Boom 22 Hình 2.3 Quy trình tinh sản phẩm PCR 25 Hình 2.4 Quy trình phản ứng RT-LAMP 26 Hình 3.1 Đồ thị khuếch đại phản ứng Real-time RT-PCR với Norovirus GI 29 Hình 3.2 Đồ thị khuếch đại phản ứng Real-time RT-PCR với Norovirus GII 30 Hình 3.3 Đồ thị khuếch đại phản ứng Real-time RT-PCR phát Norovirus GII 18 mẫu hàu Thái Bình Dƣơng 31 Hình 3.4 Kết giải trình tự chủng Norovirus nhóm GII 32 Hình3.5 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP sử dụng mồi đặc hiệu cho Norovirus nhóm GI tác giả Fukuda năm 2006 Yoda năm 2007 33 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP sử dụng mồi đặc hiệu cho Norovirus nhóm GII tác giả Fukuda năm 2006 Yoda năm 2007 34 Hình 3.7 So sánh trình tự mồi B2 (Fukuda,2006) với gen Norovirus nhóm GII Việt Nam phần mềm trực tuyến Blast 35 Hình 3.8 Vùng bắt cặp mồi LAMP gen hoàn chỉnh Norovirus 36 Hình 3.9 Kết kiểm tra vùng bắt cặp mồi Norovirus gen hoàn chỉnh Norovirus Việt Nam phần mềm ClustalW 37 Hình 3.10 Kết so sánh mồi B2 sau hiệu chỉnh với gen Norovirus Việt Nam phần mềm Blast 38 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà Hình 3.11 Vị trí tổ hợp mồi RT-LAMP trình tự gen Norovirus Việt Nam nhóm GI GII hoàn chỉnh 39 Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP khảo sát nồng độ Enzyme AMV 41 Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP khảo sát nồng độ Betaine nhiệt độ gel agarose 42 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP tối ƣu hóa thời gian phản ứng 44 Hình 3.15 Kết xác định độ nhạy phản ứng RT-LAMP Norovirus nhóm GI GII 45 Hình 3.16 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP Norovirus nhóm GI 46 Hình 3.17 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP Norovirus nhóm GII 47 Hình 3.18 Sơ đồ thử nghiệm quy trình tách chiết RNA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 48 Hình 3.19 Kết thử nghiệm phản ứng RT-LAMP mẫu RNA sau tách chiết Trizol mẫu RNA tách chiết Trizol kết hợp tinh phƣơng pháp Boom 49 Hình 3.20 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP gel agarose 50 Hình 3.21 Kết ống eppendorf chứa sản phẩm phản ứng RT-LAMP sau li tâm 51 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm đóng vai trò quan trọng đặc biệt thời đại quốc gia, đƣợc tiếp cận với thực phẩm an toàn quyền ngƣời Ngày nay, Chính phủ nhiều quốc gia nhận định rõ tầm quan trọng việc cung cấp thực phẩm an toàn vệ sinh, hầu hết nƣớc thiết lập hệ thống luật pháp, tăng cƣờng công tác tra, giám sát, khắc phục kịp thời cố an toàn thực phẩm nhằm bảo vệ quyền lợi ngƣời tiêu dùng khuyến khích thƣơng mại Thực phẩm đảm bảo chất lƣợng an toàn vệ sinh làm giảm tỷ lệ bệnh tật, tăng cƣờng khả lao động mà góp phần phát triển kinh tế, văn hoá, xã hội thể nếp sống văn minh dân tộc An toàn thực phẩm mang lại uy tín với lợi nhuận lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp, công nghiệp chế biến thực phẩm nhƣ dịch vụ du lịch thƣơng mại Đặc điểm khí hậu nóng ẩm nƣớc ta với ảnh hƣởng biến đổi khí hậu toàn cầu tạo điều kiện cho vi khuẩn, nấm mốc, vi rút phát triển gây ảnh hƣởng đến chất lƣợng thực phẩm Theo đánh giá Tổ chức nông lƣơng liên hợp quốc (FAO), hàng năm có 20% nông sản bị nhiễm nấm mốc, thiệt hại thực phẩm ô nhiễm vi khuẩn gây thối hỏng biến chất sản phẩm thực phẩm nặng nề nhiều Khác với vi khuẩn, nhiễm vào thực phẩm, vi rút không phát triển thực phẩm, không làm ảnh hƣởng đến chất thực phẩm, không làm hƣ hỏng sản phẩm nên khó nhận biết nhiên lại gây ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng Sự lây nhiễm vi rút vào thực phẩm tƣơng tự nhƣ vi khuẩn, không từ trang trại chăn nuôi, ao hồ, nơi kinh doanh buôn bán thực phẩm mà tất khâu sơ chế, chế biến thực phẩm từ bàn tay ngƣời tiếp x c với thực phẩm Thời gian gần Việt Nam, số sản phẩm thực phẩm không gia nhiệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ sản phẩm đƣợc tiêu thụ với số lƣợng lớn có chất lƣợng cảm quan đặc trƣng với hàm lƣợng chất dinh duỡng cao sản phẩm loại; đặc biệt, sản lƣợng xuất loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà nƣớc ta sang thị trƣờng chung Châu Âu tăng nhanh năm gần Tuy nhiên, sáu tháng đầu năm 2014, Cơ quan thẩm quyền Châu Âu (EU) cảnh báo 23 lô hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ Việt Nam tiêu Norovirus Đến tháng năm 2014, Cục quản lý chất lƣợng Nông lâm sản Thủy sản thuộc Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn công văn số 1349 /QLCLCL1 yêu cầu việc lấy mẫu giám sát nhuyễn thể hai mảnh vỏ [1] Vấn đề nhiễm Norovirus thực phẩm ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng mà gây tác động không nhỏ đến kinh tế quốc dân tính cạnh tranh lành mạnh thực phẩm Việt Nam thị trƣờng quốc tế Trƣớc thực trạng đó, nhiều quy định đƣợc đƣa nhằm kiểm soát Norovirus nhuyễn thể hai mảnh vỏ Tại Liên minh châu Âu, có quy định tập trung vào việc kiểm soát phân loại khu vực nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo mức độ ô nhiễm nguồn nƣớc Ủy ban bảo vệ biển thủy sản (SFPA) kết hợp với phòng thí nghiệm quốc gia Ireland, trực thuộc Viện hải dƣơng học có nghiên cứu giám sát mức độ ô nhiễm Norovirus nhuyễn thể hai mảnh vỏ [21] Hiện nay, phƣơng pháp truyền thống phát Norovirus sử dụng phòng thí nghiệm thƣờng nhiều thời gian, độ nhạy không cao nên phù hợp trƣờng hợp phân tích mẫu bệnh phẩm Nhằm nâng cao hiệu công tác kiểm soát an toàn thực phẩm, góp phần bảo vệ sức khỏe ngƣời tiêu dùng lợi ích kinh tế quốc dân từ nguồn nuôi thủy hải sản, hƣớng tới mục tiêu phát triển phƣơng pháp phát nhanh, xác mức độ nhiễm Norovirus thực phẩm với giá thành hợp lý yêu cầu cấp thiết Do vậy, đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát nhanh Norovirus thực phẩm dựa kỹ thuật RTLAMP” đƣợc thực với nội dung nhƣ sau: Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà Xác định trình tự đoạn gen mục tiêu chủng Norovirus Việt Nam Lựa chọn hiệu chỉnh mồi LAMP Tối ƣu hóa phản ứng RT-LAMP Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP Thử nghiệm quy trình tách chiết RNA Xác định độ nhạy toàn quy trình Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà HAV, vi khuẩn E.coli, mẫu RNA phát mẫu hàu thị trường mẫu âm tính Kết đƣợc thể hình 3.17 Hình 3.17 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP Norovirus nhóm GII Từ trái sang phải: RNA chuẩn Norovirus nhóm GII, GII.4, GII.3, GII.1, GII.6, Norovirus nhóm GI, vi rút HAV, vi khuẩn E.coli, mẫu RNA phát mẫu hàu thị trường mẫu âm tính ký hiệu (-) Kết sản phẩm khuếch đại gel agarose thể hình 3.17 cho thấy mẫu Norovirus nhóm GII cho sản phẩm khuếch đại Do đó, khẳng định phƣơng pháp có độ đặc hiệu 100% tập hợp chủng thử nghiệm 47 Luận văn thạc sĩ khoa học 3.5 Phan Thị Thanh Hà Thử nghiệm quy trình tách chiết RNA Phƣơng pháp tách chiết RNA Trizol đƣợc sử dụng nhiều nghiên cứu có khả phân tách hiệu RNA khỏi DNA, proteine lipid [32] Tuy nhiên, thử nghiệm tách chiết RNA từ mẫu hàu, nhận thấy tồn chất ức chế phản ứng Real-time RT-PCR Nhƣ đề cập phần Tổng quan, phản ứng LAMP có khả chống chịu đƣợc số chất ức chế phản ứng PCR Tuy nhiên, đặt câu hỏi liệu khả khuếch đại phản ứng LAMP có bị ảnh hƣởng chất ức chế từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ phƣơng pháp tách chiết Trizol Để trả lời câu hỏi này, RNA thu nhận đƣợc từ phƣơng pháp tách chiết Trizol tiếp tục đƣợc tinh phƣơng pháp Boom [31] Các hạt Norovirus đƣợc nhiễm chủ động vào mẫu với nồng độ 1000 phiên bản/g tuyến tiêu hóa trƣớc giai đoạn tách chiết RNA Trizol, RNA nhận đƣợc từ giai đoạn tách chiết RNA Trizol RNA sau tinh phƣơng pháp Boom đƣợc thử nghiệm phƣơng pháp RT-LAMP, sản phẩm sau đƣợc điện di gel agarose (Hình 3.19) Nhuyễn thể hai mảnh vỏ Mổ lấy phần ống tiêu hóa Nhiễm chủ động hạt NoV Tách chiết Trizol Thử nghiệm RT-LAMP Tinh hạt Silica (Phƣơng pháp Boom) Thử nghiệm RT-LAMP Hình 3.18 Sơ đồ thử nghiệm quy trình tách chiết RNA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 48 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà Hình 3.19 Kết thử nghiệm phản ứng RT-LAMP mẫu RNA sau tách chiết Trizol mẫu RNA tách chiết Trizol kết hợp tinh phương pháp Boom Từ trái sang phải: mẫu dương tính ký hiệu (+), mẫu tách chiết Trizol kết hợp tinh phương pháp Boom pha loãng 10 lần, mẫu tách chiết Trizol kết hợp tinh phương pháp Boom, mẫu tách chiết Trizol pha loãng 10 lần mẫu tinh Trizol giữ nguyên nồng độ Kết hình 3.19 cho thấy mẫu RNA đƣợc tách chiết Trizol không cho sản phẩm khuếch đại, nhiên mẫu pha loãng 10 lần lại cho sản phẩm khuếch đại, kết luận có có mặt chất ức chế mẫu, làm ảnh hƣởng đến kết Mẫu RNA tách chiết Trizol kết hợp tinh phƣơng pháp Boom cho kết dƣơng tính hai mẫu pha loãng 10 lần giữ nguyên nồng độ, kết luận việc kết hợp tách chiết RNA Trizol tính phƣơng pháp Boom cho phép loại bỏ chất ức chế Do lƣợng mẫu nhiễm vào 1000 phiên thể gen/g nhuyễn thể nên kết luận hiệu suất thu hồi nhƣ cao 49 Luận văn thạc sĩ khoa học 3.6 Phan Thị Thanh Hà Xác định độ nhạy toàn quy trình Để đánh giá độ nhạy toàn quy trình phân tích mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ, số mẫu bệnh phẩm có chứa Norovirus đƣợc nhiễm chủ động vào mẫu thực phẩm nồng độ 30, 100, 300, 1000, 3000 phiên bản/g tuyến tiêu hóa Sau đó, toàn quy trình phân tích xây dựng đƣợc áp dụng để phân tích mẫu nói Nồng độ vi rút nhỏ có kết dƣơng tính quy trình phân tích đƣợc sử dụng độ nhạy quy trình Hình 3.20 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP gel agarose Từ trái sang phải: mẫu âm tính GI, mẫu âm tính GII, mẫu RNA GI nồng độ 30 phiên bản/g tuyến tiêu hóa, mẫu RNA GII nồng độ 30 phiên bản/g tuyến tiêu hóa, mẫu sau marker: mẫu RNA Norovirus GII nồng độ 100, 300, 1000, 3000 phiên bản/g tuyến tiêu hóa mẫu dương tính Norovirus GII, mẫu cuối bên phải: mẫu RNA Norovirus GII nồng độ 100, 300, 1000, 3000 phiên bản/g tuyến tiêu hóa mẫu dương tính Norovirus GI Quan sát kết điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP gel agarose nhận thấy mẫu Norovirus nhóm GI GII nồng độ 30 phiên bản/g tuyến tiêu hóa không cho sản phẩm khuếch đại, mẫu lại với nồng độ 100, 300, 1000, 3000 phiên bản/g tuyến tiêu hóa cho sản phẩm khuếch đại nhiều rõ nét Do có 50 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà thể kết luận độ nhạy toàn quy trình phát GI GII 100 phiên thể gen/g tuyến tiêu hóa Trong trƣờng hợp hiệu tách chiết đạt 100%, kết độ nhạy nhận đƣợc cao so sánh với độ nhạy phƣơng pháp RT-LAMP xác định Norovirus nghiên cứu Jou JM năm 2012 (1000 copies/µl) [20] độ nhạy kit phát triển Eiken (60 copies/ phản ứng) [24] Song song với việc kiểm tra phƣơng pháp điện di gel agarose, sản phẩm phản ứng RT-LAMP ống eppendorf đƣợc li tâm với tốc độ 6000 vòng/ ph t ph t để kiểm tra kết tủa mắt thƣờng Kết quan sát ống eppendorf sau li tâm đƣợc thể hình 3.21 Hình 3.21 Kết ống eppendorf chứa sản phẩm phản ứng RT-LAMP sau li tâm Từ trái sang phải: mẫu âm tính, mẫu với nồng độ 30, 100, 300, 1000, 3000 phiên bản/g tuyến tiêu hóa mẫu Norovirus dương tính Quan sát hình 3.21 nhận thấy ống chứa mẫu Norovirus âm tính ống chứa mẫu RNA với nồng độ 30 phiên bản/g tuyến tiêu hóa không xuất kết tủa, ống lại chứa mẫu với nồng độ 100, 300, 1000, 3000 phiên bản/g tuyến tiêu hóa mẫu Norovirus dƣơng tính xuất kết trắng đục, quan sát dễ dàng mắt thƣờng Nhƣ vậy, kết quan sát kết tủa mắt thƣờng hoàn toàn tƣơng đƣơng với phƣơng pháp điện di 51 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà Tóm lại, khẳng định phƣơng pháp RT-LAMP sử dụng mồi hiệu chỉnh với điều kiện đƣợc tối ƣu nhƣ quy trình tách chiết thử nghiệm đạt độ nhạy, độ đặc hiệu cao ; kết nhận đƣợc so sánh với kết từ phƣơng pháp Real-time RT-PCR hoàn toàn ứng dụng xác định mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 52 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nhận đƣợc trình nghiên cứu, đƣa số kết luận nhƣ sau:  Phát đƣợc 8/60 mẫu hàu nhiễm Norovirus GII  Hiệu chỉnh đƣợc mồi LAMP phù hợp cho biến chủng Norovirus  Xây dựng phản ứng RT-LAMP phát Norovirus với điều kiện tối ƣu: - lƣợng AMV: 2U/phản ứng - nhiệt độ ủ: 63°C - nồng độ Betain GI: 1M, GII: 0,8M - thời gian ủ: 60 phút  Độ nhạy phƣơng pháp RT-LAMP phát Norovirus GI GII 10 phiên bản/phản ứng 25µl, tƣơng đƣơng với phản ứng Real-time RT-PCR Độ đặc hiệu phƣơng pháp đạt 100% chủng khảo sát  Quy trình tách chiết RNA Trizol kết hợp tinh hạt silica theo phƣơng pháp Boom cho sản phẩm RNA đạt chất lƣợng đảm bảo cho phản ứng RT-LAMP  Toàn quy trình phân tích đƣợc thử nghiệm mẫu thực phẩm nhiễm chủ động Norovirus, kết xác định đƣợc Norovirus với độ nhạy phát 100 phiên bản/g tuyến tiêu hóa 53 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà Kiến nghị  Mở rộng nghiên cứu số đối tƣợng mẫu thực phẩm khác hàu  Tăng số lƣợng mẫu thực phẩm khảo sát  Nghiên cứu xây dựng Kit RT-LAMP phát nhanh Norovirus thực phẩm, phục vụ công tác kiểm tra an toàn thực phẩm 54 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cục quản lý chất lƣợng Nông lâm sản Thủy sản, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2014), Công văn 1349 /QLCL-CL1 việc lấy mẫu khảo sát Norovirus Lê Quang Hòa (2012), Nghiên cứu phát triển sinh phẩm phát nhanh Norovirus loại nhuyễn thể thực phẩm chế biến không gia nhiệt dựa kỹ thuật RT-LAMP, Đại học Bách Khoa Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Đỗ Phúc (2011), Norovirus phát Norovirus kĩ thuật Realtime-PCR, Viện Vệ sinh-Y tế Công cộng TP Hồ CHí MInh, Hồ Chí Minh Tài liệu hội nghị Tổng kết chương trình mục tiêu quốc gia vệ sinh an toàn thực phẩm năm 2014 kế hoạch năm 2015 (2015), Bộ Y tế, Cục an toàn thực phẩm Nguyễn Vân Trang (2013), "TÁC NHÂN TIÊU CHẢY DO VI RÚT Ở TRẺ EM: SỰ PHÂN BỐ VÀ TÍNH ĐA DẠNG Ở VIỆT NAM", Tạp chí Y học dự phòng Tập XXIII(số (144)), tr 10-23 Tiếng Anh 10 11 12 AMV Reverse Transcriptase Usage information, Promega Barreira DM, Ferreira MS, Fumian TM, Checon R, de Sadovsky AD, et al (2010), "Viral load and genotypes of noroviruses in symptomatic and asymptomatic children in Southeastern Brazil", J Clin Virol 47, tr 60-64 Bo-Yun Yang, Xiao-Lu Liu, Yu-Mei Wei, Jing-Qi Wang, Xiao-Qing He, Yi Jin and Zi-Jian Wang (2014), "Rapid and sensitive detection of human astrovirus in water samples by loop-mediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye", BMC Microbiology 14:38 De-Guo Wang, Jeffrey D Brewster, Moushumi Paul and Peggy M Tomasula (2015), "Two Methods for Increased Specificity and Sensitivity in Loop-Mediated Isothermal Amplification", Molecules 20, tr 6048-6059 Goodfellow, Lucy G Thorne and Ian G (2014), "Norovirus gene expression and replication", Journal of General Virology 95, tr 278-291 Hansman GS, Doan LT, Kguyen TA, Okitsu S, Katayama K, Ogawa S, et al (2004), "Detection of norovirus and sapovirus infection among children with gastroenteritis in Ho Chi Minh City, Vietnam", Arch Virol 149(1673-88) Hardy, Michele E (2005), "Norovirus protein structure and function", FEMS Microbiology Letters 253, tr 1-8 55 Luận văn thạc sĩ khoa học 13 14 15 16 17 18 19 20 Phan Thị Thanh Hà Hoonmo L Koo1, 2, Nadim Ajami1,2, Robert L Atmar1, and Herbert L DuPont (2010 July), "Noroviruses: The Principal Cause of Foodborne Disease Worldwide", Discov Med 10(50), tr 61-70 Hung-Yueh YehT, Craig A Shoemaker, Phillip H Klesius (2005), "Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri", Journal of Microbiological Methods 63, tr 36-44 Konstantin B Ignatov, Ekaterina V Barsova, Arkady F Fradkov, Konstantin A.Blagodatskikh, Tatiana V Kramarova, and Vladimir M Kramarov (2014), A strong strand displacement activity of thermostable DNA polymerase markedly improves the results of DNA amplification, truy cập ngày 2-57, trang Le Guyader, F.S., Krol, J., Ambert-Balay, K., Ruvoen-Clouet, N., Desaubliaux, B., Parnaudeau, S., Le Saux, J.-C., Ponge, A., Pothier, P., Atmar, R.L., Le Pendu, J (2010), "Comprehensive analysis of a norovirusassociated gastroenteritis outbreak, from the environment to the consumer", Journal of Clinical Microbiology 48, tr 915–920 Lees, D (2010), "International Standardisation of a Method for Detection of Human Pathogenic Viruses in Molluscan Shellfish", Food and Environmental Virology 2, tr 146-155 Leo L.M Poon, Bonnie W.Y Wong, Edmund H.T Ma, Kwok H Chan1, Larry M.C Chow, Wimal Abeyewickreme, Noppadon Tangpukdee, Kwok Y Yuen, Yi Guan, Sornchai Looareesuwan and J.S Malik Peiris (February 2006), "Sensitive and Inexpensive Molecular Test for Falciparum Malaria: Detecting Plasmodium falciparum DNA Directly from Heat-Treated Blood by Loop-Mediated Isothermal Amplification", Clinical Chemistry 52(2), tr 303-306 Loisy, F., Atmar, R , Guillon, P., Le Cann, P., Pommepuy, M., Le Guyager, F (2005), " Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish", Journal of Virological Methods 123, tr 1-7 Luo JM, Wu XY, Xu ZQ, Luo L, Nie K, Yang MJ, Zeng YL, Duan ZJ, Ma XJ ( 2012 Mar), "Colorimetric detection of norovirus genotype GII by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification]", Bing Du Xue Bao.;28(2):165-71 28(2):165-71 56 Luận văn thạc sĩ khoa học 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phan Thị Thanh Hà M.Sc., Paulina Zuzanna Rajko-Nenow (May 2014), Molecular characterisation of norovirus contamination in wastewater and oysters, School of Natural Sciences, College of Science, National University of Ireland, Galway Manmohan Parida, Guillermo Posadas, Shingo Inoue, Futoshi Hasebe, and Kouichi Morita ( January 2004), "Real-Time Reverse Transcription LoopMediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of West Nile Virus", J Clin Microbiol 42(1), tr 257-263 Nagamine K1, Hase T, Notomi T ( 2002 Jun), "Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers", Mol Cell Probes 16(3) Norovirus Detection Kit (2006), Co., Eiken Chemical Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T (2000 Jun 15), "Loop-mediated isothermal amplification of DNA", Nucleic Acids Res 28(12): E63 Novel DNA Polymerase Increases Efficiency of Multiple PCR, Isothermal Amplification Methods (August 15, 2014), Ben Butkus, genomeweb.com O'Ryan ML, Lucero Y, Prado V, Santolaya ME, Rabello M, et al (2009), "Symptomatic and asymptomatic rotavirus and norovirus infections during infancy in a Chilean birth cohort", Pediatr Infect Dis 28, tr 879-884 Olesen B, Neimann J, Bottiger B, Ethelberg S, Schiellerup P, et al (2005), " Etiology of diarrhea in young children in Denmark: a case-control study", J Clin Microbiol 43, tr 3636-3641 Patel MM, Widdowson M-A, Glass RI, Akazawa K, Vinjé J, Parashar UD (2008), " Systematic Literature Review of Role of Noroviruses in Sporadic Gastroenteritis", Emerging Infectious Diseases 14(8), tr 1224-1231 Phan Vu Tra My, Corinne Thompson cộng ( June 2013), "Endemic Norovirus Infections in Children, Ho Chi Minh City, Vietnam, 2009–2010", Emerging Infectious Diseases 19(6), tr 977-980 R BOOM, C J A SOL, M M M SALIMANS, C L JANSEN, P M E WERTHEIM-vAN DILLEN, NOORDAA, AND J VAN DER (Mar 1990), "Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY 28(3), tr 495-503 Rio DC, Ares M Jr, Hannon GJ, Nilsen TW (2010 Jun), "Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent)", Cold Spring Harb Protoc 2010(6) 57 Luận văn thạc sĩ khoa học 33 34 35 36 37 38 39 Phan Thị Thanh Hà Shinji Fukuda, Shinichi Takao, Masaru Kuwayama, Yukie Shimazu, and Kazuo Miyazaki (Apr 2006), "Rapid Detection of Norovirus from Fecal Specimens by Real-Time Reverse Transcription–Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY 44(4), tr 1376–1381 Simone Guadagnucci Morillo, Maria Carmo Sampaio Tavares Timenetsky (2011), "Norovirus: an overview", Rev Assoc Med Bras 57(4) Site, Eiken Genome The principle of LAMP method, truy cập ngày, trang Tomoko Yoda, Yasuhiko Suzuki, Kenji Yamazaki, Naomi Sakon, Masashi Kanki, Ikuko Aoyama, Teizo Tsukamoto (2007), "Evaluation and Application of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection of Noroviruses", Journal of Medical Virology 79, tr 326-334 William L Roper, MD, MPH, Chapel Hill, NC, Chairman (March 4, 2011), "Updated Norovirus Outbreak Management and Disease Prevention Guidelines", Morbility and Mortality Weekly Report Vol 60 / No YangLi (2011), Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) for Detection of Three Enteric Viruses and Its Application in Water Samples, http://ysidata.com/ Zhang S, Chen TH, Wang J, Dong C, Pan J, et al (2011), "Symptomatic and asymptomatic infections of rotavirus, norovirus, and adenovirus among hospitalized children in Xi'an, China", J Med Virol 58 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà PHỤ LỤC Phụ lục Bộ mồi RT-LAMP xác định Norovirus Yoda năm 2007 Phân nhóm GII phổ biến GII gặp GI Tên mồi Trình tự F3-1 GAAGGTGGCATGGAYTTTTA F3-2 AGTGGTGGTCTGGARTTTTA B3-1 TCHAGWGCCATBRYCTCRTT B3-2 ACSGGYTCAAGAGCCATG FIP AGATTGCGATCGCCCTCCCATTTTGCCCAGACAAGARSCMATGTT BIP-1 TGDGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTTGRCCTCTGGKACGAGGTT BIP-2 TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTYYTCTGGGACGAGRCMGGC BIP-3 TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGACCTCATTATTACTTTCTGGC FLP ATCHGAGAAYCTCATCCA BLP-1 GATGGGTCCGCAGCCAA BLP-2 ATSACGCCGCTCCATC BLP-3 TSACGCCGCTCCATCTAA F3-1 ACWGARYTSAARGARGGTGG F3-2 GGCATGGTWATCAAAGAAG F3-3 GAGATYAAGAGTGGTGGTC B3-1 AGCCCCMRCCACRGGYTC B3-2 AGCGCCYGCAACKGGG FIP-1 CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTTGGATTTTTACGTGCCMAGRCA FIPN-2 CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTCATGAGTTTTATGTGCCAAAGT BIPN-1 TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTCWTTKTKRMYCTCTGGKACGA BIPN-2 TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGYCTCAKTATTRCTYTCTGGC FLP-1 ATCTCATCCAYCTRAACAT FLP-2 CATCCAYCTGAACATGGC FLP-3 CTCATCCACCTGAACATAG BLP-1 RTGACGCMGCTCCATC BLP-2 ATGACGCTACTCCATCAA BLP-3 TGACGCCGCTCCATCTAA F3-1 GGTTTRGARATGTATGTSCCA 59 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà F3-2 AAGGGGGSYTTGARATSTAC B3-1 CATTGRWATWGGSTCAGCT B3-2 TGCAAGAGGGTCAGAAG B3-3 GWGGCAGTGGTTCAGCA FIP GAGATYGCGRTCYCCTGTCCATTTTGVTGGCAGGCCATGTTCCG BIP-1 TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTRCCTCYGGTACYAGCTGGC BIP-2 TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTTAACCTCCGGYACSAGYTGA FLP GAGRTCATGGAASCGCATC BLP-1 CCAAGCGYRGATGGCG BLP-2 ACGCCCCAMCAAACATG BLP-3 ACGCCCCAMCATCSCCT 60 Luận văn thạc sĩ khoa học Phan Thị Thanh Hà Phụ lục Bộ mồi RT-LAMP xác định Norovirus Fukuda năm 2006 Phân nhóm GI GII Tên mồi Trình tự F3 CCRGGNTGGCARGCNATGTT B3 CCAACCCARCCATTRTACA FIP1 F1C, CATTTACGAATTCGGGCAGG;F2,CGCTGGATGCGNTTCCATGA FIP2 F1C, CATTTACAAAATCGGGCAGG;F2,CGCTGGATGCGNTTCCATGA BIP1 B1C, GATGGCGTCTAAGGACGC;B2,AGCTGTRTTTGCCTCTGGWAC BIP2 B1C, GATGGCGTCTAAGGACGC;B2,AGCWGTATTAACCTCCGGYAC LF1 AGATYGCGATCYCCTGTCCA LF2 AGATTGCGATCTCCTGCCCA LF3 AGCTCGCGGTCTCCTGTCCA F3 GGNMTGGANTTTTAYGTGCCMAG B3 CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT FIP1 F1C, GGGAGCMAGATTGCGATCGC;F2,GAGBCNATGTTYAGRTGGAT FIP2 F1C,GGGAGCMAGATTGCGATCGC;F2,GAGCCCATGTTCAGRTGGAT FIP3 F1C,GGGAGCGAGATTGCGATCGC;F2, GAGTCAATGTTYAGGTGGAT BIP1 B1C,TGTGAATGAAGATGGCGTCG;B2,CTCATTRTTRVTCTCTGGBACGAG BIP2 B1C,TGTGAATGAAGATGGCGTCG;B2,CTCATTRTTGCYCTCTGGYACGAG BIP3 B1C,TGTGAATGAAGATGGCGTCG;B2,CTCATTGTTGAYCTCTGGKACGAG BIP4 B1C,TGTGAATGAAGATGGCGTCG;B2,CTCATTRTTACTTTCTGGCACGAG LF1 GTGCTCARATCWGARAACCTC LF2 GTGCTGAGGTCWGARAATCTC LF3 GTGCTCAAATCTGAGAATCTC LF4 GTGCTCAAGTCTGAGAAYCTC 61 ... phƣơng pháp phát nhanh, xác mức độ nhiễm Norovirus thực phẩm với giá thành hợp lý yêu cầu cấp thiết Do vậy, đề tài Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát nhanh Norovirus thực phẩm dựa kỹ thuật. .. gen chủng Norovirus Tuy nhiên, nghiên cứu nhƣ số nghiên cứu Norovirus phƣơng pháp LAMP khác giới tính đến thời điểm đƣợc thực mẫu bệnh phẩm với lƣợng vi rút lớn Do đó, việc nghiên cứu cập nhật... phƣơng pháp truyền thống để phát Norovirus mẫu bệnh phẩm Tuy nhiên phƣơng pháp cho phép phát với lƣợng vi rút tối thiểu 106 hạt vi rút/g mẫu bệnh phẩm; phù hợp với việc phát Norovirus mẫu bệnh phẩm