Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su LỜI CAM ĐOAN Tôi Đỗ Công Thịnh xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su thiên nhiên” công trình nghiên cứu sáng tạo thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Lan Hương Số liệu, kết trình bày luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình khoa học khác Đỗ Công Thịnh CNSH2013B i Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su LỜI CẢM ƠN Tôi Đỗ Công Thịnh xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS.Nguyễn Lan Hương – Bộ môn Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội hướng dẫn bảo tận tình suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, cán phòng thí nghiệm công nghệ sinh học C10 giúp đỡ dạy bảo thời gian làm việc phòng thí nghiệm Bên cạnh người thân bạn bè động lực, nguồn động viên đặc biệt anh chị bạn làm việc Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học C10 giúp đỡ nhiều suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Chân thành! Đỗ Công Thịnh Đỗ Công Thịnh CNSH2013B ii Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu cao su thiên nhiên 1.1.1 Cây cao su 1.1.2 Mủ cao su thiên nhiên a Thành phần hóa học b Cấu trúc tính chất .4 1.1.3 Tình hình sản xuất cao su a Tình hình sản xuất cao su giới b Tình hình sản xuất cao su Việt Nam 1.2 Vi sinh vật phân hủy cao su thiên nhiên 1.2.1 Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su giới .6 1.2.2 Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su Việt Nam .11 1.2.3 Sự phân hủy cao su tập hợp vi sinh vật 12 1.3 Con đường phân hủy cao su 13 1.4 Một số phương pháp đánh giá KNPH cao su vi sinh vật 14 1.5 Một số phương pháp xác định biến động hệ vi sinh vật kỹ thuật sinh học phân tử 16 Đỗ Công Thịnh CNSH2013B iii Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su 1.5.1 Kỹ thuật DGGE .18 1.5.2 Metagenomics 19 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu .21 2.1.1 Nguồn vi sinh vật 21 2.1.2 Cơ chất thử KNPH cao su vi sinh vật 21 2.1.3 Thiết bị .21 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 22 2.1.5 Hóa chất 23 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu .23 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 23 2.2.2 Nội dung nghiên cứu .24 2.2.2.1 Làm giàu tập hợp vi sinh vật 24 2.2.2.2 Sự giảm khối lượng miếng cao su 24 2.2.2.3 Quan sát phát triển vi sinh vật bề mặt miếng cao su kỹ thuật SEM .25 2.2.2.4 Phân tích sản phẩm phân hủy cao su tổng hợp kỹ thuật GPC 25 2.2.2.5 Xác định biến động thành phần vi sinh vật mẫu làm giàu theo thời gian .26 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Làm giàu tập hợp vi sinh vật bể làm giàu 29 3.2 Đánh giá phân hủy cao su canh trường làm giàu 29 3.2.1 Sự giảm khối lượng miếng cao su 29 3.2.3 Đánh giá khả phân hủy cao su tổng hợp 33 Đỗ Công Thịnh CNSH2013B iv Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su 3.3.1 Nghiên cứu biến động thành phần vi sinh vật theo thời gian kỹ thuật DGGE 35 3.3.2 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật phương pháp metagenomics 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 54 Đỗ Công Thịnh CNSH2013B v Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT KNPH Khả phân hủy GPC Sắc ký lọc gel (Gel permeation chromatography) SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) TLC Sắc ký mỏng (Thin-Layer chromatography) HPLC Sắc lý lỏng cao áp (High-pressure liquid chromatography) MSM Môi trường muối khoáng (mineral salt medium) LB Luria – Bertani Broth DGGE Điện di biến tính Gradient nồng độ (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) HPLC-MS Sắc ký lỏng cao áp- khối phổ (High-pressure liquid chromatography- mass spectrometry) UV Tia tử ngoại (Ultra violet) GC Sắc ký khí (Gas Chromatography) MS Khối phổ (Mass spectrometry) Đỗ Công Thịnh CNSH2013B vi Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su DANH MỤC BẢNG Bảng 1 : Thành phần hóa học mủ nước Bảng 1: Thành phần môi trường MSM 22 Bảng 2: Thành phần môi trường LB .22 Bảng 3: Trình tự mồi 806Ri sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 1: Sự đa dạng vi sinh vật trình phân hủy sinh học cao su thiên nhiên mẫu làm giàu theo thời gian .37 Bảng 2: Tỷ lệ số chi vi sinh vật mẫu làm giàu theo thời gian nuôi cấy .42 Bảng 3: Các chủng vi sinh vật phân lập 45 Đỗ Công Thịnh CNSH2013B vii Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su DANH MỤC HÌNH Hình 1: Công thức hóa học cao su thiên nhiên Hình 2: Sản lượng cao su toàn cầu hàng năm .5 Hình 3: Thị phần sản xuất cao su thiên nhiên Việt Nam .6 Hình Con đường phân hủy mủ cao su .13 Hình 5: Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng để nghiên cứu tính đa dạng cấu trúc chức vi sinh vật môi trường 17 Hình 1: Sơ đồ nghiên cứu 23 Hình 2: Quá trình tiến hành giải trình tự metagenomics .27 Hình 1: Sự biến đổi sinh khối vi sinh vật bể làm giàu theo thời gian nuôi cấy .29 Hình 2: Sự giảm khối lượng miếng cao su theo thời gian 30 Hình 3: Ảnh chụp SEM bề mặt miếng cao su theo thời gian nuôi cấy mẫu làm giàu 32 Hình 4: Sản phẩm phân hủy cao su tổng hợp mẫu làm giàu theo thời gian nuôi cấy phân tích GPC 34 Hình 5: Phổ DGGE mẫu làm giàu theo thời gian .36 Hình 6: Một số ngành mẫu làm giàu theo thời gian 39 Hình 7: Một số vi sinh vật mẫu làm giàu theo thời gian 40 Hình 8: Tỷ lệ loài N facinica mẫu làm giàu theo thời gian 43 Hình 9: Sự giảm khối lượng miếng cao su sau 30 ngày nuôi cấy chủng phân lập chủng chuẩn (NVL3, E2) 46 Hình 10: Kết chạy GPC nuôi cấy chủng đơn MSM với nguồn cacbon cao su tổng hợp sau 30 ngày 47 Đỗ Công Thịnh CNSH2013B viii Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su MỞ ĐẦU Cao su thành phần nhiều loại sản phẩm: lốp xe, găng tay cao su, ủng… đặc tính vượt trội độ đàn hồi cao, tính chống rách chống mài mòn Sản lượng cao su toàn cầu năm 2014 đạt khoảng 27,5 triệu bao gồm cao su thiên nhiên cao su tổng hợp Dự kiến năm 2015 nhu cầu tiêu thụ cao su thiên nhiên toàn giới khoảng 12,3 triệu Các nước Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Việt Nam nước sản xuất cao su thiên nhiên hàng đầu khu vực Đông Nam Á Năm 2014, Việt Nam vươn lên trở thành nước đứng thứ giới sản xuất cao su thiên nhiên giữ vị trí thứ xuất cao su Tại Việt Nam ngành công nghiệp sản xuất cao su thiên nhiên mang lại hiệu kinh tế cao Từ năm 2006 đến xuất cao su thiên nhiên đạt tỷ USD chiếm trung bình khoảng - % tổng kim ngạch xuất nước tạo công ăn việc làm cho nhiều lao động Cùng với lợi ích từ ngành công nghiệp chất thải cao su vấn đề đáng lo ngại Chất thải từ ngành công nghiệp sản xuất cao su sản phẩm có chứa cao su phân hủy, dẫn đến nguy ô nhiễm nghiêm trọng Các biện pháp xử lý cao su thải sử dụng rộng rãi chôn lấp nhiệt phân Tuy nhiên, biện pháp nhiều bất cập, việc chôn lấp gây tốn diện tích bãi chôn lấp, đốt cao su phế liệu để làm nhiên liệu nhà máy gây ô nhiễm môi trường không hiệu kinh tế Phân hủy sinh học cao su nhận quan tâm lớn nhà khoa học không gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm lượng Ngoài phân hủy sinh học cao su tận dụng nguồn cao su phế thải để tái tạo nguồn nguyên liệu thay cho cao su thiên nhiên Các nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su tiến hành gần 100 năm qua tìm nhiều loài vi khuẩn có khả phân hủy cao su mạnh như: Streptomyces, Micromonosopora, Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium, Gordonia… Các vi sinh vật chia làm nhóm theo đặc tính sinh trưởng khác cao su Nhóm thứ xạ khuẩn với vòng sáng xung quanh khuẩn Đỗ Công Thịnh CNSH2013B Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su lạc phân lập môi trường thạch mủ cao su Nhóm thứ vòng sáng không phát triển môi trường thạch mủ cao su, chúng phát triển cao su chất kết dính bắt buộc Tuy nhiên, việc phân hủy đặc biệt chất khó phân hủy thiên nhiên cần tham gia đồng thời tập hợp chủng vi sinh vật với tập hợp enzyme trình, tác động đơn lẻ chủng hay enzyme Bức tranh này, chưa sáng tỏ Để góp phần tìm hiểu khả phân hủy cao su vai trò tập hợp vi sinh vật phân hủy cao su thực đề tài: “Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su thiên nhiên” Các vấn đề cần giải bao gồm: Làm giàu tập hợp vi sinh vật có khả phân hủy cao su Đánh giá khả phát triển phân hủy cao su canh trường làm giàu Nghiên cứu biến động thành phần vi sinh vật canh trường làm giàu theo thời gian kỹ thuật điện di gel biến tính gradient nồng độ (DGGE) metagenomics Phân lập vi sinh vật từ mẫu làm giàu Đỗ Công Thịnh CNSH2013B Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su Bảng 2: Tỷ lệ số chi vi sinh vật mẫu làm giàu theo thời gian nuôi cấy Tỷ lệ (%) TT Chi ngày 28 ngày 45 ngày Nocardia 9,3 14,5 35,9 Truepera 2,2 6,2 4,3 Planctomyces 0,8 0,5 3,3 Clostridium 0,4 3,1 3,3 Pseudaminobacter 0,5 2,2 2,3 Shinella 2,3 1,5 1,7 Terrimonas 0,2 2,4 1,5 Thauera 1,8 0,1 0,04 Hydrogenophaga 4,6 0,7 0,2 10 Levilinea 1,1 4,4 0,5 11 Desulfotomaculum 0,4 2,4 0,5 12 Ochrobactrum 0,2 1,8 0,9 13 Ferruginibacter 2,1 0,1 0,0 14 Lacibacter 0,3 1,7 0,1 15 Rhodococcus 0,4 0,6 0,8 16 Parvibaculum 3,5 1,4 0,1 17 Niastella 0,6 0,9 1,1 18 Mesorhizobium 0,3 1,0 1,0 Bảng 3.2 cho thấy rõ biến đổi chi vi sinh vật mẫu làm giàu theo thời gian Hầu hết chi vi sinh vật có biến đổi nhiên chi Nocardia Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 42 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su có biến đổi mạnh thành phần chi có tỷ lệ tăng dần theo thời gian Nocardia mẫu làm giàu theo thời gian có tỷ lệ 9,3, 14,5 35,9% tương ứng với mẫu làm giàu sau 7, 28 45 ngày Kết phân tích biến đổi chi Nocardia tập hợp theo thời gian gần tương ứng với suy giảm khối lượng miếng cao su (hình 3.2) Trong nghiên cứu Tsuchii cộng (1985) chứng minh KNPH cao su chủng Nocardia sp.835A qua kết giảm khối lượng GPC Trong nghiên cứu tác giả nhận thấy phân hủy cao su chủng 835A tốt sau tuần miếng găng tay cao su bị phân hủy gần hoàn toàn [37] Nocardia sp MBR chứng minh có khả phân hủy cao su ảnh chụp SEM sau ủ chủng Nocardia sp MBR với miếng găng tay sau tuần Kết cho thấy hình thành lớp màng vi sinh vật bề mặt miếng găng tay [29] Tương tự có nhiều chủng vi sinh vật thuộc chi Nocardia có khả phân hủy cao su thiên nhiên phát công bố giới như: Nocardia farcinia E1 [19], Norcadia takedensis WE30, N nova L1b, N farcinia [39] Khi phân tích sâu chi Nocardia nhận thấy loài N farcinica chiếm ưu có gia tăng số lượng theo thời gian nuôi cấy, kết thể hình sau: 40 Tỷ lệ (%) 35 30 25 20 15 10 28 Thời gian (ngày) 45 Hình 8: Tỷ lệ loài N facinica mẫu làm giàu theo thời gian Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 43 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su Nhận thấy loài Nocardia facinica có tỷ lệ tương đối lớn mẫu làm giàu vào thời điểm khác như: 8,8 – 14,5 – 35,9% 7, 28 45 ngày Tỷ lệ loài tăng nhanh theo thời gian nuôi cấy mẫu làm giàu Trong nghiên cứu Ibrahim cộng sư (2006) tiến hành khảo sát khả phân hủy cao su chủng N farcinica Tác giả chứng minh khẳng định khả phân hủy cao su thiên nhiên cao su tổng hợp chủng [19] Linh (2013) phân lập thành công chủng N farcinica NVL3 từ mẫu nước thải, bùn thải nhà máy sơ chế cao su Cẩm Thủy Thanh Hóa Bên cạnh tác giả khẳng định vai trò phân hủy cao su thiên nhiên cao su tổng hợp chủng nghiên cứu [25] Như biến động Nocardia facinica tập hợp vi sinh vật mẫu làm giàu diễn mạnh mẽ chủng chiếm ưu mẫu 3.4 Phân lập vi sinh vật từ mẫu làm giàu Từ mẫu làm giàu 45 ngày, phân lập khuẩn lạc có hình thái tương đối khác (tạm gọi chủng) từ mẫu làm giàu ngày 45 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc khả bắt màu thuốc nhuộm Schiff’s đượ thể bảng sau: Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 44 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su Bảng 3: Các chủng vi sinh vật phân lập Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Nhuộm Schiff’s T1 Tròn, vành mép, bề mặt trơn bóng, có màu vàng, - T2 Tròn, bề mặt trơn nhầy, có màu trắng sữa, - T3 Vàng nhat, tròn, kích thước nhỏ, bề mặt trơn nhẵn, - T4 Kích thước nhỏ, có viền xung quanh mép, màu trắng sữa - T5 Màu hồng nhạt, tròn, kích thước nhỏ, bề mặt trơn nhẫn + T6 Trắng đục, tròn , lồi lê giữa, dẹt, vành mép - T7 Kích thước nhỏ, dẹt, có màu vàng đất, không đồng - No Tên (-) không bắt màu thuốc nhuộm Schiff’s (+) bắt màu thuốc nhuộm Schiff’s  Đánh giá KNPH cao su chủng đơn Các chủng phân lập đánh giá KNPH cách ủ với miếng cao su thiên nhiên 30 ngày, sau kiểm tra suy giảm khối lượng Kết phân hủy chủng đơn thể qua hình sau: Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 45 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su Sự giảm khối lượng miếng cao su ( % ) 40 34.5 35 30 26.9 25 20.1 20 15 10 1.5 2.3 1.8 1.9 T2 T3 T4 2.9 3.1 1.3 T1 T5 T6 T7 NVL3 E2 KC Các chủng đơn Hình 9: Sự giảm khối lượng miếng cao su sau 30 ngày nuôi cấy chủng phân lập chủng chuẩn (NVL3, E2) Nhìn hình 3.9 thấy chủng T5 chủng có khả làm giảm khối lượng cao su thiên nhiên dạng màng Sau 30 ngày giảm khối lượng chủng T5 đạt khoảng 20%, mức giảm khối lượng chủng chưa tốt chủng chuẩn (NVL3: 26,9% E2: 34,5%) Các chủng T1, T2, T3, T4, T6, T7 không làm giảm khối lượng miếng cao su Tiến hành khảo sát khả phân hủy cao su tổng hợp chủng đơn phân lập Kết phân hủy cao su tổng hợp khảo sát cách phân tích GPC thể qua hình 3.10 Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 46 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su KC KC T5 T3 T2 T1 T4 T7 T6 Hình 10: Kết chạy GPC nuôi cấy chủng đơn MSM với nguồn cacbon cao su tổng hợp sau 30 ngày Nhận thấy chủng T5 có pic thứ xuất phổ GPC Như thấy T5 chủng có khả phân hủy cao su tổng hợp sau 30 ngày nuôi Đã tiến hành tách chiết DNA tổng số chủng T5 tiến hành giải trình tự 16S rDNA Kết giải trình tự cho thấy chủng T5 có độ tương đồng 100% với chủng Rhodococcus rhodochrous [JX535360] Chủng N farcinica chứng minh chiếm phần lớn tập hợp vi sinh vật mẫu làm giàu ngày 45 Tuy nhiên phân lập vi sinh vật từ mẫu làm Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 47 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su giàu chưa phân lập N farcinica mà phân lập chủng Rhodococcus rhodochrous T5 có khả phân hủy cao su Chi Rhodococcus chi xuất mẫu làm giàu 45 ngày có tỷ lệ khiêm tốn, chiếm 0,8% tổng số vi khuẩn mẫu Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 48 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Đã tiến hành làm giàu tập hợp vi sinh vật có khả phân hủy cao su Khả phân hủy cao su tập hợp vi sinh vật mẫu làm giàu nghiên cứu dựa vào giảm khối lượng miếng cao su, SEM GPC: - Sự giảm khối lượng miếng cao su đạt 79,4% sau tháng - Vi sinh vật sinh trưởng phát triển bề mặt miếng cao su đồng thời ăn sâu vào kéo dài thời gian làm giàu - Tập hợp vi sinh vật mẫu làm giàu có khả phân hủy cao su tổng hợp Sự biến động tập hợp vi sinh vật theo thời gian khảo sát kỹ thuật điện di gel biến tính (DGGE) kỹ thuật metagenomics - Sự đa dạng tập hợp vi sinh vật trình làm giàu minh chứng kết phổ điện di DGGE - Chi Nocardia khẳng định chiếm ưu tập hợp vi sinh vật metagenomics Đã phân lập chủng Rhodococcus rhodochrous T5 có khả phân hủy cao su Kiến nghị: Cần có thử nghiệm phân hủy cao su tập hợp quy mô lớn hơn, thời gian dài Cần nghiên cứu sâu ảnh hưởng T5 tới trình phân hủy mẫu làm giàu Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 49 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Đ.T.C Hà, Xác định đa dạng vi khuẩn bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin sân bay Đà Nẵng kỹ thuật PCR - DGGE Tạp chí Khoa học công nghệ, 2008 46 ( ): p 59- 65 Nguyễn Hữu Trí, Công nghệ cao su thiên nhiên., 2000 : NXB trẻ Sacombank - SBS, Báo cáo cập nhật ngành cao su thiên nhiên 2014 Arenskotter M., et al., Taxonomic characterization of two rubber degrading bacteria belong to the spieces Gordonia polyisoprenivorants and analysis of hapervariable regions of 16S rDNA sequence FEMS Microbiol.Lett, 2001 205: p 277-282 Arenskotter M., Broker D., and Steinbuchel A, Biology of metabolically diverse genus Gordonia A E Microbiol, 2004 70: p 3195-3204 Bode HB., P.K Zeeck, and Jendrossek K, Physiological and chemical investtigation into microbial degradation of synthetic poly(cis-1,4-isoprene) A E Microbiol, 2000 66: p 3680-3685 Braaz R., and Jendrossek D., Heme-dependent rubber oxygenase RoxA of Xanthomonas sp cleaves the carbon backbone of poly(cis-1,4-isoprene) by a dioxygenase mechanism'', A E Microbiol, 2005 71: p 2473-2478 Breitbart, M., et al., Genomic analysis of uncultured marine viral communities Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99 2002 22: p 14250-14255 Broker D., et al., Characterization of the 101-kilobase-pair megaplasmid pKB1, isolated from the rubber - degrading bacterium Gordonia westfalica Kb1 J.Bacteriol, 2004 186): p 212-225 10 Broker D., et al., The genomes of the non-clearing- zone- forming and natural rubber degrading species Godornia polyisopreneivorans and Gordonia westfalica harbor genes expressing lcp activity in Streptomyces strains A E Microbiol, 2008 74: p 2288-2297 11 Bui Thi Trang, et al., Screening of Natural Rubber-Degrading Microorganisms from Rubber Processing Factory Waste in Vietnam International Journal of Waste Resources (IJWR), 2013 3( 1): p 9-12 12 Chen, K and Pachter, Bioinformatics for Whole-Genome Shotgun Sequencing of Microbial Communities PLoS Computational Biology, 2005 (2): p 24 Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 50 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su 13 Claudia Gallert, Degradation of latex and of natural rubber by Streptomyces strain La Syst Appl Microbiol, 2000 23: p 433-41 14 Eisen, Environmental Shotgun Sequencing: Its Potential and Challenges for Studying the Hidden World of Microbes PLoS Biology, 2007 (3): p 82 15 Gurdeep Rastogi and Rajesh K Sani, Molecular Techniques to Assess Microbial Community Structure, Function, and Dynamics in the Environment Vol 2011: Microbes and Microbial Technology 16 Han J , W.L., Bacterial diversity in antibiotic wastewater treatment Water Sci Technol, 2013, 68(12): p 2676-82 17 Handelsman J, et al., Goodman RM Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: A new frontier for natural products Chem Biol, 1998 5(10): p 245-9 18 Hirohito Tsurumaru, et al., Metagenomic Analysis of the Bacterial Community Associated with the Taproot of Sugar Beet Microbes Environ, 2015 30(1): p 63-69 19 Ibrahim E.M., et al., Identification of poly (cis-1,4-isoprene) degradation intermediates during growth of moderately thermophilic actinomycetes on rubber and cloning of a functional lcp homologue from Nocardia farcinia strains E1 A E Microbiol, 2006 72: p 3375-3382 20 Imai S., et al., Isolation and characterization of Streptomyces, Actinoplanes, and Methylibium strains that are involved in degradation of natural rubber and synthetic poly(cis-1,4-isoprene) Enzyme and Microbial Technology,, 2011 49 21 Jendrossek D and Reinhardt S, Sequence analysis of a gene product synthesized by Xanthomonas sp during growth on natural rubber latex FEMS Microbiol Lett, 2003 224: p 61-65 22 Jendrossek D., Tomasi G., and Kroppenstedt R.M, Bacterial degradation of natural rubber: a privilege of actinomycetes FEMS Microbiol Lett, 1997 150: p 179-188 23 K., R and Steinbuchel K, Construction and intergeneric conjugative transfer of a pSG5-based cosmid vector from Escheriachia coli to the polyisoprene rubber degrading strain Micromonospora aurantiaca W2b FEMS Microbiol Lett,, 2002 211: p 129-132 24 Karsten Rose and Alexander Steinbüchel, Biodegradation of Natural Rubber and Related Compounds: Recent Insights into a Hardly Understood Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 51 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su Catabolic Capability of Microorganisms Environ Microbiol, 2005 71(6): p 2803-2812 25 Linh, D.V., Screening and Characteriation of rubber microorganisms, in Nagaoka university of Technology 2013 26 Linos A., et al., Gordonia westfalica sp nov., a novel rubber-degrading actinomycete Int J Syst Evol Microbiol, 2002 52: p 1133-9 27 Linos A., et al., Biodegradation of poly (cis-1,4-polyisoprene) rubbers by distinct actinomycetes: microbial strategies and detailed surface analysis A E Microbiol, 2000 66: p 1639-1645 28 Linos A., et al., A Gram-begative bacterium, identified as Pseudomonas aeruginosa AL98, is a potent degrader ò natural rubber and synthetic cis1,4- polyisoprene FEMS Microbiol Lett, 2000 182: p 155-161 29 Mahmoud M Berekaa, Colonization and Microbial Degradation of Polyisoprene Rubber by Nocardioform Actinomycete Nocardia sp strainMBR Biotechnology Year, 2006 5(3 ): p 234-239 30 Memory Tekere1 *, et al., Bacterial Diversity in Some South African Thermal Springs A Metagenomic Analysis, 2015 31 Muyzer G1 and de Waal EC, Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA Appl Environ Microbiol., 1993 59(3): p 695-700 32 Rose K., Tenberge K.B., and Steinbuchel A, Identification and characterization of genes from Streptomyces sp strain K30 reponsible for clear zone formation on natural rubber latex and poly (cis-1,4-isoprene) rubber degradation Biomacro molecules, 2005 6: p 180-188 33 Sirimaporn Watcharakul, K.U., Brian Hodgson, Wannapa Chumeka, and Varaporn Tanrattanakul Biodegradation of a blended starch/natural rubber foam biopolymer and rubber gloves by Streptomyces coelicolor CH13 Electronic Journal of Biotechnology, 2012 15: p 0717-3458 34 Spence D and Van Niel C.B, Bacteriol decomposition of the rubber in Hevea latex Ind.Eng.Chem, 1936 847-850: p 28 35 Surajit De Mandal, et al., Illumina-based analysis of bacterial community in Khuangcherapuk cave of Mizoram, Northeast India 2015 5: p 13-14 36 Tsuchii A., et al., Colonization and degradation of rubber pieces by Nocardia sp Biodegradation, 1996 7: p 41-48 Đỗ Công Thịnh degrading CNSH2013B 52 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su 37 Tsuchii A., Suzuki T., and Takeda K, Microbial degradation of natural rubber vulcanizates A E Microbiol,, 1985 50: p 965-970 38 Tsuchii A and Takeda K, Rubber- degrading enzyme from a bacterial culture, A E Microbiol, 1990 (56: p 269-274 39 Warneke S., et al., Bacterial degradation of poly(trans-1,4-isoprene) (gutta percha) Microbiology, 2007 153: p 347-56 40 http://www.nature.com/ismej/journal/v6/n8/extref/ismej20128x2.txt 41 https://basespace.illumina.com 42 http://metagenomics.nmpdr.org 43 http://vamps.mbl.edu Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 53 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su PHỤ LỤC Phụ lục Hình ảnh miếng cao su màng Phụ lục Sự biến đổi miếng cao su theo thời gian Phụ lục Trình tự 16S rRNA chủng T5 T5_1-27F.txt GCTTGCTGGG TGGATTAGTG GCGAACGGGT GAGTAACACG TGGGTGATCT GCCCTGCACT CTGGGATAAG CCTGGGAAAC TGGGTCTAAT ACCGGATATG ACCTCGGGAT GCATGTCCT AGTTTTTCGGTG CAGGATGAGC CCGCGGCCTA GGGGTGGAA Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 54 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su TCAGCTTGTT GGTGGGGTAA TGGCCTACCA AGGCGACGAC GGGTAGCCGG CCTGAGAGGG CGACCGGCCA CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA ATGGGCGCAA GCCTGATGCA GCGACGCCGC GTGAGGGATG ACGGCCTTCG GGTTGTAAAC CTCTTTCAGC AGGGACGAAG CGCAAGTGAC GGTACCTGCA GAAGAAGCAC CGGCCAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGGT GCGAGCGTTG TCCGGAATTA CTGGGCGTAA AGAGCTCGTA GGCGGTTTGT CGCGTCGTCT GTGAAATCCC GCAGCTCAAC TGCGGGCTTG CAGGCGATAC GGGCAGACTC GAGTACTGCA GGGGAGACTG GAATTCCTGG TGTAGCGGTG AAATGCGCAG ATATCAGGAG GAACACCGGT GGCGAAGGCG GGTCTCTGGG CAGTAACTGA CGCTGAGGAG CGAAAGCGTG GGTAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGGTGGG CGCTAGGTGT GGGTTTCCTT CCACGGGATC CGTGCCGTAG CCAACGCATT AAGCGCCCCG CCTGGGGAGT ACGGCCGCAA GGCTAAAACT CAAAGGAATT GACGGGGGCC CGCACAAGCG GCGGAGCATG TGGATTAATT CGATGCAACG CGAAGAACCT TACCTGGGTT TGACATGTAC CGGACGACTG CAGAGATGTG GTTTCCCTTG TGGCCGGTAG ACAGGTGGTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTGTCCTGT GTTGCCAGCA CGTNGATGGT GGGGACTCCC AGGAGACTGC CGGGGTCAAC TCCGAGGAAG GTGGGGACGA CGTCAAGTCA TC ATGCCCCT T Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 55 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su Phụ lục Sự giảm khối lượng miếng cao su theo thời gian canh trường làm giàu Thời gian lấy mẫu Khối lượng trước thí nghiệm Khối lượng sau thí nghiệm ( ngày ) (g) (g) (g) (%) 1.1 0.0556 0.0478 0.0087 14 1.2 14 0.0598 0.0477 0.0121 20.2 1.3 21 0.0558 0.04233 0.01347 24.1 1.4 28 0.0567 0.037 0.0197 34.7 1.5 35 0.0574 0.0365 0.0209 36.4 1.6 45 0.0562 0.032 0.0242 43.1 1.7 60 0.0613 0.027 0.0343 56 1.8 75 0.057 0.0211 0.0359 63 1.9 90 0.057 0.016 0.041 71.9 1.10 135 0.0615 0.0127 0.0488 79.35 Mẫu Đỗ Công Thịnh Khối lượng % giảm giảm khối lượng CNSH2013B 56 ... trình nghiên cứu biến động hệ vi sinh vật Nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 17 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su biến động tập hợp vi sinh. .. cao su vai trò tập hợp vi sinh vật phân hủy cao su thực đề tài: Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su thiên nhiên” Các vấn đề cần giải bao gồm: Làm giàu tập hợp vi sinh. .. đến phân hủy cao su tập hợp vi sinh vật gần Đỗ Công Thịnh CNSH2013B 12 Nghiên cứu biến động tập hợp vi sinh vật trình phân hủy cao su 1.3 Con đƣờng phân hủy cao su Hiện nay, nghiên cứu đường phân