SẮC KÝ LỌC GEL GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TRẦN THANH TUẤN GIỚI THIỆU Sắc kí gel dùng để tách phân tử dựa khác kích thước phân tử Những phân tử không bị giữ lại liên kết hóa học nên thành phần dung môi giải li (buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li (resolution) Sắc kí gel phù hợp với phân tử sinh học nhạy cảm với pH, nồng độ ion kim loại, môi trường khắc nghiệt Quá trình phân tách phương pháp sắc kí gel (gel filtration) Gel nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed) Đệm mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu đặc tính bền vật lý, bền hóa học trơ Lớp gel cân với dung dịch qua (buffer) Dung dịch điền đầy vào mạng lưới lỗ xốp khoảng không hạt Chất lỏng bên lỗ xốp xem pha tĩnh chất lỏng bên xem pha động LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL Đặc điểm trình Kết trình sắc kí gel thường biểu diễn giản đổ giải li hay phổ đồ sắc kí cho thấy khác nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thụ tia UV vùng 280 nm) thành phần mẫu chúng giải li khỏi cột dựa trật tự kích thước phân tử Trạng thái cấu tử biểu diễn liên quan đến thể tích giải li chúng, Ve (elution volume) đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí Có cách để xác định Ve: Sephadex Sephadex dùng để tách nhanh nhóm có khối lượng phân tử nhỏ , khử muối, đổi dạng dung môi làm mẫu Sephadex tạo thành liên kết ngang dextran với epichlorohydrin Những loại khác Sephadex mức độ khác liên kết ngang có mức độ trương nở độ chọn lọc khác cho kích thước phân tử đăc trưng Sephadex LH-20 Sephadex LH-20 sản xuất dành riêng cho việc phân tách tinh chế hợp chất tự nhiên mà đòi hỏi có mặt dung môi hữu để trì độ bền chúng Nó sư dụng phân tích qui mô công nghiệp để phân tách nhóm chất có tính chất tương tự Sephadex LH-20 phù hợp cho giai đoạn tinh chế ban đầu trước tinh chế với độ tinh khiết cao sắc kí tao đổi ion hay sắc kí pha đảo hay dùng cho giai đoạn tinh chế với độ tinh khiết cao đồng phân không đối quang (diastereoisomers) ỨNG DỤNG Khử muối – đổi dung môi – làm tang nồng độ protein Quá trình khử muối protein nóng chảy (His)6 Quá trình khử muối ghép nhiều cột để tăng thể tích mẫu Sắc kí gel chiến lược tinh chế Để tinh chế mức độ cao hay không tìm phối tử phù hợp cho phương pháp tinh chế giai đoạn cột lực, phương pháp nhiều giai đoạn hiệu phát triển để sử dụng cho trình tinh chế, phương pháp gọi tắc CIPP CIPP sử dụng cho công nghệ dược nghiên cứu phòng thí nghiệm để đảm bảo phát triển phương pháp nhanh, hiệu chất lượng cao Xác định khối lượng phân tử phân tích phân bố khối lượng phân tử Không giống kỹ thuật điện di, sắc kí gel cung cấp phương pháp để xác định khối lượng phân tử hay kích thước protein tự nhiên hay protein biến tính điều kiện khác pH,nhiệt độ, lực ion Việc xác định khối lượng phân tử phương pháp sắc kí gel thực cách so sánh thông số thể tích giải li (Vc) hay Kav chất quan tâm với giá trị thu từ chất chuẩn biết trước Đường cong chuẩn xây dựng cách đo tích giải li vài chất chuẩn, tính giá trị Kav tương ứng vẽ giá trị Kav tương ứng với logarit khối lương phân tử chúng Khối lượng phân tử chất chưa biết xác định từ đường cong chuẩn đo giá trị Vc tính giá trị Kav chúng Thông số giải li khác V0, Vc/Vo, Kd sử dụng để xây dựng đường cong chuẩn giá trị Kav thường sử dụng bị ảnh hưởng sai số khác thông số chuẩn bị cột; không đòi hỏi xác định xác giá trị Vi Kd CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE THE END ... li (resolution) Sắc kí gel phù hợp với phân tử sinh học nhạy cảm với pH, nồng độ ion kim loại, môi trường khắc nghiệt Quá trình phân tách phương pháp sắc kí gel (gel filtration) Gel nhồi vào cột... Nhưng đối với mỗi loại gel riêng có tỉ lệ giữa Kav:Kd, tỉ lệ này không phụ thuộc chất nồng độ của mẫu Kav = Đường cong chọn lọc lựa chọn phương pháp Chọn lựa phương pháp sắc kí gel chỉ phụ thuộc hoàn... lỗ xốp mô tả đường cong chọn lọc.  Bằng cách vẽ đường cong qua điểm giá trị Kav ứng với log Mr của protein chuẩn có thể xây dựng đường cong chọn lọc Phương pháp lọc gel chọn lựa cho khối lượng