ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THANH THẢO Công trình hoàn thành tại: ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM, TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Cát Đông GS.TS Nguyễn Văn Thanh Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh chất chống oxi hóa khảo sát khả ứng dụng y học Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Ngọc Vinh Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số chuyên ngành: 62424001 Phản biện 3: TS Đái Thị Xuân Trang Phản biện độc lập 1: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Phản biện độc lập 2: TS Đái Thị Xuân Trang TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp ……………………………………………………………… ……………………………………………………………… vào lúc ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh năm 2016 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Phân lập sàng lọc chủng vi khuẩn có khả sinh chất chống oxi hóa khu vực phía Nam Mở đầu Chất chống oxi hóa (COXH) có vai trò quan trọng việc làm giảm Khảo sát đặc điểm sinh chất chống oxi hóa chủng vi khuẩn nguy mắc ung thư bệnh tim mạch Các chất tác động thông qua Đánh giá đặc điểm để ứng dụng làm probiotic độc tính việc trung hòa hay dập tắt công tác nhân oxi hóa lên đại chủng phân tử quan trọng ADN, protein, màng lipid Hàng năm có nhiều Đánh giá khả ứng dụng probiotic nguồn cung cấp chất công trình nghiên cứu đối tượng chất COXH để hiểu rõ chống oxi hóa chế hoạt động, tạo sản phẩm tìm kiếm nguồn cung cấp Khảo sát quy trình lên men để sản xuất sinh khối làm nguyên liệu Tuy nhiên, hầu hết nghiên cứu tiến hành với nguồn cung cấp probiotic cung cấp chất COXH chất COXH từ thực vật Các nguồn hiển nhiên phong phú khả cung cấp chất COXH, chúng dạng sản phẩm nông nghiệp, ảnh hưởng đến quỹ đất chịu nhiều ảnh hưởng yếu tố thời tiết, khí hậu Việc sử dụng nguồn cung cấp chất COXH vi khuẩn có số ưu so với từ thực vật Vi khuẩn lên men qui mô lớn với Tính cấp thiết đề tài Chất COXH cung cấp từ thực vật, động vật, vi sinh vật tổng hợp Trong đó, vi sinh vật nguồn cung cấp chất COXH tiềm thu lượng sinh khối lớn thời gian ngắn, không cần nhiều quỹ đất, không chịu ảnh hưởng điều kiện thời tiết… Bên cạnh đó, việc sử dụng vi khuẩn dạng probiotic nhằm cung cấp chất rẻ tiền mà không sử dụng nhiều quỹ đất, không phụ thuộc hiệu ứng có lợi cho sức khỏe có từ lâu, gần với phát thời tiết, khí hậu Vi khuẩn sản xuất chất COXH sử dụng qua triển công nghệ sinh học, nhiều nghiên cứu sản phẩm đường tiêu hóa dạng sinh khối sống, không qua chiết xuất, vào probiotic đời, mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội Nhưng đến thể sản xuất hoạt chất chỗ qui trình sản xuất chế phẩm đơn nước chưa có nhiều công trình nghiên cứu vi khuẩn sinh chất giản hơn, thân thiện với môi trường tránh vấn đề liên quan đến COXH việc sử dụng chúng nguồn cung cấp chất COXH Vì bảo quản, hấp thu đường tiêu hóa Nhưng đến chưa có nhiều công vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn sinh chất COXH khả ứng dụng trình nghiên cứu việc sử dụng vi khuẩn làm nguồn cung cấp chất hướng tiếp cận nguồn phương phức cung cấp chất COXH so với COXH cách thức truyền thống chiết xuất từ thực vật hay tổng hợp Do mục tiêu luận án phân lập tuyển chọn vi khuẩn sinh chất COXH khảo sát tiềm ứng dụng probiotic cung cấp chất COXH Các nội dung thực cụ thể sau: Những đóng góp luận án Đây nghiên cứu việc phân lập vi khuẩn sinh chất COXH sử dụng bào tử vi khuẩn làm nguồn cung cấp chất COXH Việt Nam Nghiên cứu mở hướng tiếp cận nguồn phương thức cung cấp chất COXH với đóng góp cụ thể sau - CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phân lập định danh chủng vi khuẩn sinh chất COXH giúp 2.1 Đối tượng cung cấp vật liệu sinh học cho tương lai Vi khuẩn (VK) phân lập từ mẫu đất, cát nước 13 tỉnh Trung Nam Chứng minh khả sinh chất COXH triển vọng ứng dụng Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Gia Lai, Khánh Hoà, Ninh y học sáu chủng Bacillus Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, Tp Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Tiền Giang, Khảo sát quy trình lên men thu sinh khối bào tử ổn định với Đồng Tháp, An Giang thông số lên men phù hợp, sử dụng nguyên liệu có giá thành thấp, sẵn 2.2 Vật liệu có Việt Nam Vi sinh vật động vật thử nghiệm: chủng chuẩn ATCC PTN Vi sinh Công nghệ Dược cung cấp, B indicus HU36 sinh carotenoid dự án Bố cục luận án Luận án gồm 149 trang, mở đầu trang, tổng quan tài liệu 28 trang, vật Colorspore cung cấp, chuột nhắt trắng Swiss albino viện Pasteur Nha liệt phương pháp 28 trang, kết bàn luận 76 trang, kết luận kiến Trang cung cấp nghị trang Luận án có 54 bảng, 14 hình, sơ đồ, đồ thị, 156 tài liệu Hóa chất: Sigma, Merck cung cấp tham khảo, gồm 10 tài liệu tiếng Việt, 146 tài liệu tiếng Anh, 20 phụ lục thể Môi trường: TSA, TSB Himedia cung cấp, MHA Merck cung cấp kết thực nghiệm Thiết bị: kính hiển vi BX41 (Olympus), máy luân nhiệt TCX3000 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các dạng oxi hoạt động: tạo thành dạng oxi hoạt động, tác động dạng oxi hoạt động bệnh liên quan 1.2 Chất COXH: khái niệm, phân loại, vai trò chất chống oxi hoá sức khoẻ, nguồn thu nhận chất COXH, thực phẩm chức chứa chất COXH Việt Nam (Techne), máy quang phổ UV-Vis GeneQuant 1300 (GE HealthCare), bể tán siêu âm Vibra cell (Sonic), nồi lên men 10 L Biostat B Plus (Sartorius) 2.3 Phân lập sàng lọc vi khuẩn sinh chất COXH 2.3.1 Phân lập chủng vi khuẩn Thu thập mẫu đất, cát nước: 13 tỉnh từ Đà Nẵng đến Đồng Tháp Phân lập: phân lập chủng vi khuẩn môi trường TSA, lưu lại 1.3 Vi khuẩn sinh chất COXH: nghiên cứu nước giới, chủng có hình thái khuẩn lạc màu sắc khác số chất chống oxi hoá từ vi khuẩn 2.3.2 Sàng lọc vi khuẩn sinh chất chống oxi hoá 1.4 Lên men sản xuất sinh khối: yếu tố liên quan đến việc chọn Chủng sinh chất COXH ngoại bào nội bào sàng lọc phương chất môi trường lên men, yếu tố ảnh hưởng tạo sinh khối vi sinh vật pháp mỏng DPPH (Huang, 2006) 1.5 Probiotic ứng dụng y học: khái niệm, tiêu chí probiotic, 2.4 Khảo sát khả sinh chất chống oxi hóa chủng vi khuẩn ứng dụng Xác định hoạt tính COXH: xác định phương pháp đánh bắt gốc tự 1.6 Các vấn đề cần nghiên cứu DPPH, chọn chủng có hoạt tính đánh bắt DPPH >50% bắt DPPH, tạo phức với ion sắt II, bảo vệ carotenoid hệ nhũ tương - với acid linoleic (Brand-Williams, 1995; Antolovich, 2002) 2.7 Đánh giá khả ứng dụng cung cấp chất COXH Xác định khả sinh chất COXH: xác định IC50 chất COXH ngoại bào phân đoạn chất COXH nội bào phương pháp đánh - Định danh: Dựa giải trình tự 16S rADN (Frank, 2008) 2.5 Khảo sát đặc điểm probiotic chủng Bacillus Khả sinh enzym ngoại bào VK: khả sinh enzym caseinase, - Theo dõi: biểu bất thường Xét nghiệm: bất thường thông số sinh hóa/ công thức máu Vi phẫu: bất thường mô học nội tạng Thời gian: 30 ngày Đối tượng: BT2.4, DQ11, DQ40, GL4.5, HR04 KP3 Đối chứng: PBS, vitamin E Liều: 106 bào tử/g thể trọng Sau 30 ngày: nhóm sinh lý: chuột lô tiêm phúc mô dầu; gelatinase, amylase, lipase (Kumar, 2012) nhóm gây hoại tử gan với CCl4: chuột tiêm phúc mô CCl4/dầu Khả đối kháng với VK gây bệnh (chủng ATCC): E coli, P liều 1ml/kg thể trọng 24 sau tiêm, chuột giải phẫu aeruginosa, P vulgaris, S aureus, S feacalis, S marcescens, S dysenteria, - Quan sát đại thể nội tạng chuột: biểu bất thường  S paratyphi A (CLSI, 2012) Chỉ số COXH: thay đổi, bất thường số COXH tổng (FRAP), Khả chịu acid dịch vị muối mật: Khả sống sót VK sau SOD, catalase, GSH-Px, MDA (Ohkawa, 1979; Flohe, 1984; 30 phút, 90 phút pH pH 3; sau giờ, muối mật 0,3% 0,5% Marklund, 1974; Goth, 1991; Benzie, 1999) (Barbosa, 2005)  Xét nghiệm: thay đổi, bất thường enzym gan AST ALT Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh: phương pháp pha loãng kháng  Vi phẫu: bất thường mô gan sinh thạch theo M7-A9 M45-A (CLSI) Sử dụng 14 kháng sinh đại 2.8 Khảo sát quy trình lên men để sản xuất sinh khối diện cho nhóm penicilin, cephem, glycopeptid, aminoglycosid, 2.8.1 Khảo sát điều kiện nhiệt độ pH: nhiệt độ: 30C, 37C, 42C, macrolid, tetracyclin, quinolon, phenicol, ansamycin pH: 5, 6, 7, 8, Khảo sát diện gen mã hóa độc tố: Hbl (A, B, C, D) gây 2.8.2 Tối ưu môi trường tạo sinh khối sinh chất COXH tiêu huyết; Nhe (A, B, C) gây tiêu chảy, Ces mã hóa cereulid synthetase, Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng: ảnh hưởng 11 yếu tố gồm nguồn bceT thuộc nhóm enterotoxin T, cytK, độc tố tương tự β-toxin C carbon, nitơ khoáng chất theo ma trận Plackett-Burman perfringens (Phelps, 2002; Lindback, 2004; Stenfors, 2010) Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men: yếu tố ảnh hưởng 2.6 Thử nghiệm tính an toàn chủng đến sinh khối lượng chất COXH tối ưu theo RSM Độc tính cấp: theo dõi 72 đầu đến 14 ngày Đối tượng: BT2.4, DQ11, DQ40, GL2.1, GL4.5, HR04 KP3 Đối chứng: PBS Liều: 5.10 5.109 bào tử/g thể trọng (Dược Điển Việt Nam IV, 2009) Xác định liều LD50 Giải phẫu đại thể: tìm bất thường nội tạng Độc tính bán cấp: 60 ngày Đối tượng: BT2.4, DQ11, DQ40, GL2.1, GL4.5, HR04 KP3 Đối chứng: PBS Liều: 106 107 bào tử/g thể trọng Kích thích tạo bào tử Thành phần khoáng bổ sung kích thích tạo bào tử: khoáng ảnh hưởng đến việc tạo bào tử xác định dựa vào ma trận Plackett-Burman Thời điểm bổ sung khoáng kích thích tạo bào tử: đầu pha lũy thừa, pha lũy thừa, đầu pha ổn định, pha ổn định 2.8.3 Khảo sát điều kiện thu nhận bào tử nồi lên men 10 lít Khảo sát thông số lên men: tỷ lệ cấy truyền: 1, 5, 10% thể tích môi Chất COXH nội bào: Phân đoạn ethylacetat: hoạt tính COXH thấp Phân trường lên men; tốc độ khuấy: 250, 400, 600 vòng/phút; lượng oxi cung đoạn chloroform: BD5.1, BD6.8, BD8.2, BT2.4, CR3, DN1.1, DN4.1, cấp: 50, 75, 100% DQ11, DQ15.2, DQ32, DQ35.1, DQ35.3, DQ8.2, DT11.3, DT15.1, DT5.1, Khảo sát trình lên men mẻ - bổ sung chất: thông số lên men DT6.1, GL7, GL2.1, GL4.5, HR04, KP3, NT3.2, NT7.1, PT3.7, QN7.2, mẻ bổ sung chất tính toán từ thí nghiệm lên men mẻ TG3.1, TG4.1, TN1.1, TN1.3, TN12.3, TN2.4 có hoạt tính cao với IC50 khoảng 0,43-0,82 mg/ml Phân đoạn ethanol: BD1.1, DN5.2, DQ11, DQ40, CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phân lập sàng lọc vi khuẩn sinh chất COXH 3.1.1 Thu thập phân lập vi khuẩn sinh chất COXH Số mẫu thu thập 204 mẫu Các mẫu phân lập môi trường TSA thu 367 chủng vi khuẩn DQ8.2, DT11.3, DT14.1, DT5.1, GL6, GL2.3, KP3, PT6.1, QN1.1, QN2.2, TG6.1, TN1.1, TN13.1, TN2.4 có hoạt tính cao với IC50 khoảng 0,21-0,99 mg/ml Các phân đoạn chất COXH nội bào chất COXH ngoại bào có khả COXH theo chế khác 3.2.2 Định danh vi khuẩn sinh chất COXH tốt 47 chủng: 10 chủng VK Gram âm, chủng Staphylococcus, chủng Các chủng vi khuẩn phân lập có nhiều màu sắc khác nhau, Micrococcus luteus, chủng Lysinibacillus macroides, 30 chủng Bacillus màu trắng chủ yếu Trong số chủng vi khuẩn phân lập có 30 cầu Trong 30 chủng Bacillus có chủng Bacillus cereus bị loại bỏ khuẩn, 252 trực khuẩn Gram dương 85 trực khuẩn Gram âm nghiên cứu tiếp theo, 21 chủng Bacillus lại gồm B subtilis, B 3.1.2 Sàng lọc vi khuẩn sinh chất COXH marisflavi, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B megaterium, B Trong số 367 chủng phân lập, 139 chủng có khả sinh chất COXH, fusiformis, B pumilus loài Bacillus an toàn chọn cho 15 chủng có khả sinh chất COXH ngoại bào nội bào: nghiên cứu đặc tính probiotic chủng BT2.4, BD1.1, DT5.3, DT6.1, QN1.1, QN1.2, DQ11, HR04, PT6.1, 3.3 Khảo sát đặc điểm probiotic chủng Bacillus TN12.2, TN13.1, HM2.7, GL7, CR5.2, KP3 Khả sinh enzym ngoại bào: 16/21 chủng có khả sinh enzym 3.2 Khảo sát khả sinh chất COXH chủng amylase protease, chủng sinh enzym lipase Khả đối kháng với VK gây bệnh: BT2.4 HR04 có khả đối 3.2.1 Định lượng hoạt tính COXH Xác định hoạt tính COXH chủng: 47/139 chủng có khả đánh bắt DPPH  50% Khả COXH phân đoạn: Chất COXH ngoại bào: BD1.1, BT2.4, DN5.2, DQ11, DQ40, DT6.1, GL7, HR04, KP3, PT6.1, QN1.1, QN1.2, TN13.1 có hoạt tính cao với IC50 kháng với E coli, Salmonella Shigella Hầu hết chủng có khả đối kháng với S marcescens, S aureus Khả chịu acid dịch vị muối mật: BD6.8, BT2.4, DQ11, DQ40, GL2.1, GL4.5, HR04 KP3 có khả sống sót lớn 50% pH 90 phút muối mật 0,5% trong khoảng 0,17-0,78 mg/ml Thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh: 18 chủng nhạy cảm nhạy cảm trung gian với 14 kháng sinh thử nghiệm có chủng tiềm chọn thử nghiệm khả chịu acid dịch vị muối mật Ở điểu kiện bình thường: Lô uống bào tử lô VitE: vi phẫu mô gan không khác biệt so với lô PBS Khi bị stress CCl4: Lô PBS/CCl4: phần lớn tế bào gan to bất Xác định diện gen mã hóa độc tố: 21 chủng vi khuẩn thử thường có nhân không điển hình bị hoại tử, bị viêm nặng khoang cửa nghiệm âm tính với gen mã hóa độc tố tiểu thùy gan Lô BT2.4/CCl4, DQ11/CCl4 DQ40/CCl4: tế bào gan có Tổng hợp đặc tính probiotic, 7/21 chủng có đặc tính tốt nhân không điển hình tế bào bị hoại tử xuất hiện, nhiên chọn để tiếp tục nghiên cứu gồm BT2.4, DQ11, DQ40, GL2.1, GL4.5, mức độ tổn thương gan thấp nhiều so với lô PBS Lô GL4.5/CCl4, HR04 KP3 HR04/CCl4, KP3/CCl4 VitE/CCl4 xuất số tế bào gan bị tổn 3.4 Thử nghiệm tính an toàn thương, hầu hết tế gan bình thường, chứng tỏ việc sử dụng bào tử VK Độc tính cấp: liều LD50 qua đường uống bảy chủng BT2.4, DQ11, 12 DQ40, GL2.1, GL4.5, HR04 KP3 cao 5.10 bào tử/kg thể trọng Độc tính bán cấp: lô uống bào tử BT2.4, DQ11, DQ40, GL4.5, HR04, KP3: liều 10 bào tử/g thể trọng tương đương 5.10 11 CFU/người 50 kg biểu độc tính chuột thử nghiệm Lô GL2.1: liều 107 bào tử/g thể trọng có tượng lách to, tăng hoạt động tạo huyết lách, chủng bị loại thử nghiệm 3.5 Đánh giá khả cung cấp chất COXH Khả cung cấp chất COXH xác định thông qua khả hạn chế stress OXH gây độc gan CCl4 sáu chủng Bacillus: BT2.4, DQ11, DQ40, GL4.5, HR04 vitamin E có tác dụng hạn chế tổn thương gan CCl4 Enzym gan Ở điều kiện bình thường: hoạt tính enzym AST ALT khác biệt sử dụng bào tử VK vitamin E so với lô PBS Khi bị stress CCl4: Lô PBS/CCl4: hoạt tính AST ALT lô tăng lên 3,4 lần 5,0 lần so với lô PBS Điều chứng tỏ tiêm CCl4 gan bị tổn thương Lô BT2.4/CCl4, DQ11/CCl4, DQ40/CCl4 GL4.5/CCl4, VitE/CCl4: hoạt tính AST ALT giảm có ý nghĩa thống kê so với lô PBS/CCl4 Lô HR04/CCl4 KP3/CCl4: hoạt tính AST giữ ổn định so với lô sinh lý PBS, hoạt tính enzym ALT giảm có ý nghĩa thống kê so với lô PBS/CCl4, kết hợp với kết vi phẫu mô gan cho thấy Quan sát đại thể: lô tế bào gan bị hoại tử tổn thương hạn chế tốt gia tăng Lô PBS: gan chuột có màu đỏ hồng tự nhiên, điểm xuất huyết, gan không xơ cứng Lô PBS/CCl4: gan có màu thâm đen, gan bị xơ cứng Lô BT2.4/CCl4, DQ11/CCl4, DQ40/CCl4: mức độ xơ cứng gan giảm so với lô PBS Lô GL4.5/CCl4, HR04/CCl4, KP3/CCl4 VitE/CCl4: gan chuột có thay đổi màu sắc, nhiên có màu hồng, điểm màu trắng giảm, gan không bị xơ cứng enzym gan Các dấu COXH Chỉ số COXH tổng: giúp xác định khả COXH hệ thống thể thông qua giá trị FRAP Ở điều kiện bình thường: bào tử vi khuẩn vitE có tác dụng làm tăng mức COXH tổng có ý nghĩa so sánh với lô PBS Quan sát vi thể 10 Khi bị stress CCl4 gây ra: số COXH tổng lô PBS/CCl4 giảm có ý nghĩa thống kê so với lô PBS; lô sử dụng bào tử, mức COXH tổng lô thử nghiệm cao có ý nghĩa so với lô PBS/CCl4, so sánh lô thử nghiệm với nhau, lô uống bào tử Bacillus có tác dụng bảo vệ tương tự vitamin E gan huyết Enzym COXH nội sinh: Điều kiện bình thường: bào tử vitamin E làm tăng mức dự trữ enzym so với lô PBS chọn để nghiên cứu điều kiện nuôi cấy nhằm thu lượng sinh khối lớn để ứng dụng làm probiotic cung cấp chất COXH Bảng So sánh đặc điểm COXH, enzym gan sáu vi khuẩn Chủng BT2.4 Khi bị stress OXH CCl4: hoạt tính SOD, CAT, GSH-Px giảm có ý Khả cung cấp chất COXH enzym gan chất COXH Hoạt tính phân đoạn Cải thiện AST,ALT Cải thiện số Hoạt tính tốt COXH Cải thiện AST, ALT Cải thiện số phân đoạn DQ40 tính enzym cao lô sinh lý PBS khác biệt có ý nghĩa so với lô PBS/CCl4 gan huyết Hoạt tính ethanol thấp DQ11 nghĩa lô PBS/CCl4 so với PBS Ở lô sử dụng bào tử vitamin E: hoạt Khả sinh COXH Hoạt tính phân đoạn Cải thiện AST, ALT Cải thiện số chloroform thấp GL4.5 Lượng MDA: Hoạt tính COXH COXH Cải thiện AST, ALT Hầu không khác ngoại bào thấp Điều kiện bình thường: bào tử vitamin E làm giảm lượng MDA so HR04 với lô PBS Khi bị stress OXH CCl4: lượng MDA lô PBS/CCl4 tăng có ý nghĩa so với lô PBS Ở lô sử dụng bào tử vitamin E: lượng MDA thấp lô PBS khác biệt có ý nghĩa so với lô PBS/CCl4 Như việc sử dụng bào tử chủng vi khuẩn có tác dụng hạn chế stress OXH tăng số COXH tổng FRAP, tăng hoạt tính KP3 biệt so với lô VitE Hoạt tính tốt Giữ AST mức sinh Cải thiện số phân đoạn lý, cải thiện ALT COXH Hoạt tính tốt Giữ AST mức sinh Hầu không khác phân đoạn lý, cải thiện ALT biệt so với lô VitE 3.6 Khảo sát quy trình lên men để sản xuất sinh khối 3.6.1 Khảo sát điều kiện nhiệt độ pH KP3 phát triển tốt pH nhiệt độ 37 oC với mật độ enzym COXH nội sinh động vật thử nghiệm ức chế trình 4,35±0,10.108 CFU/ml peroxid hóa lipid tạo MDA so với lô chứng PBS tiêm CCl4, điều 3.6.2 Tối ưu hóa môi trường thu nhận sinh khối chất COXH chứng tỏ khả cung cấp chất COXH cho vật chủ sử dụng bào tử vi Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối chất COXH: khuẩn Dựa vào khả sinh chất COXH ngoại bào, nội bào, khả cung cấp chất COXH thông qua việc hạn chế stress OXH bảo vệ gan gây độc gan với CCl4 sáu chủng vi khuẩn Bảng 1, chủng KP3 11 Mật rỉ, amoni citrat, MnCl2: ảnh hưởng dương phần trăm đóng góp cao ảnh hưởng có ý nghĩa giá trị thống kê đến việc tạo sinh khối hàm lượng chất COXH 12 Tối ưu hóa công thức môi trường theo RSM:  Khảo sát thời điểm bổ sung khoáng Bảng Nồng độ yếu tố khảo sát mô hình RSM - CCD Yếu tố Phạm vi A Mật rỉ (g/l) – 15 B Amoni citrat (g/l) 0,5 – C MnCl2 (mM) 5– 20 lần đạt 2,22.109 bào tử/ml tỉ lệ bào tử tăng lên 99% Mức -1 +1 10 15 0,5 1,25 12,5 So sánh việc tối ưu hóa môi trường Bảng Kết so sánh thí nghiệm trước sau tối ưu Môi trường TSB Plackett-Burman RSM-CCD Bổ sung khoáng 20 Sinh dưỡng * 0,45 1,65 2,21 2,17 Bào tử * 0,05 0,57 0,74 2,12 Chất COXH ** 16,81 67,72 79,53 71,8 Dữ liệu phân tích thống kê tính toán giá trị p mô hình sinh khối 0,0114, mô hình chất COXH 0,0247