Header Page of 126 TIỂU LUẬN CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT CÁC TYPE VIRUS CÙNG HỌ VỚI VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN Footer Page of 126 Header Page of 126 GIỚI THIỆU CHUNG Virus viêm náo nhật virus thuộc giống flavivirus nằm họ Flaviviridae Giới thiệu Flaviviridae Arboviruses (arthropod-borne virus) virus truyền qua vết cắn tác nhân truyền bệnh động vật chân khớp Các loại vi-rút có xu hướng nhân quan động vật chân khớp Alphaviruses Flaviviruses hai loại phổ biến Arboviruses Alphaviruses thuộc gia đình, đặt tên Togaviridae, Flaviviruses thuộc gia đình, đặt tên Flavivridae Flaviviridae tên họ tên đến từ loại vi rút Flaviviridae, gọi vi rút Sốt vàng Họ Flaviviridae có giống (genus, genera): Pestivirus (ví dụ, virus gây bệnh ỉa chảy bò), Flavivirus (ví dụ, virus gây viêm não Nhật Bản, virus gây bệnh sốt xuất huyết), Hepacivirus (ví dụ, virus gây viêm gan C) Rất nhiều loại vi-rút gây bệnh người tìm thấy Flaviviridae Tổng cộng có 69 tác nhân gây bệnh tìm thấy Flaviviridae Các chi Flavivirus bao gồm nhiều loài sinh vật nguy hiểm, điều bao gồm vi-rút sốt vàng da, virus sốt xuất huyết ,virus West Nile Cấu trúc gen Flaviviridae Các gen Flaviviridae bao gồm sợi RNA đơn dương, gen không phân đoạn Footer Page of 126 Header Page of 126 Gen có 5'-end mang cặp nucleotide methyl hóa gene-protein liên kết Nó có đuôi polyadenyl cuối 3', polyprotein từ gen RNA tách thành protein có cấu trúc số protein không cấu trúc Bộ gen phải trải qua trình nhân tế bào chất Cấu trúc virions Flaviviridae: Các virions Flaviviridae hình cầu, đa hình bao bọc Các hạt virions có đường kính từ 40nm đến 50nm Vỏ bọc nucleosapsid diện virions Flaviviridae Vỏ capsid cấu tạo từ polymer glycoprotein Bề mặt vỏ capsid tạo thành từ gai nhỏ bao quanh viền nhấp nhô Vỏ capsid môt khối đa diện đối xứng có chứa lõi protein bên trong, lõi có đường kính từ 20nm đến 30nm chúng kích cỡ • Các virus thuộc họ Flaviviridae Flavivirus: Dengue fever virus Footer Page of 126 Header Page of 126 Figure “Structure of Dengue Virus” Figure “Arrangement Dengue (Flavivirus) Viral Genome sequence and gene products” (Rice, 1996) giống tất flavivirus, dengue fever virus( DFV) có cấu trúc sợi RNA đơn dương ,lớp vỏ phức hệ cấu trúc protein: protein lõi(C),protein màng tế bào(M) protein vỏ(E) Cấu trúc protein virus gen dengue virus tồn RNA đa gen , dịch mã tạo 10 protein hoạt động Khoảng ¼ gen mã hóa cho protein có cấu trúc, phần lại mã hóa cho protein ko cấu trúc Protein c: 11 kD Protein đóng vai trò rắp láp virion Nó chứa vùng C-terminal tác động chuỗi tín hiệu cho chuyển đoạn protein M vào khoang ER Protein M: N-terminal prM khoảng 26 k D tạo peptidase tín hiệu từ máy chủ suốt trình giải phóng virus từ tế bào chủ thông qua đường phân tiết Footer Page of 126 Header Page of 126 E protein: thường glycosylate E protein protein cần thiết cho độc tính Đột biến từ vùng khác protein tạo nên chủng nhỏ virus Vỏ glycoprotein tham gia vào trình tế bào chủ NS1 protein: tồn bề mặt tế bào , hình thức non-virion ngoại bào Nó góp phần trách nhiệm việc chép RNA NS2A protein: mộtt proteoin kỵ nước chức chưa rõ Một số tài liệu cho thấy có chức việc lôi kéo RNA lam khuôn mẫu cho việc chép màng NS2B protein: protein màng kỵ nước, loại phức hợp với NS3 nhu cầu co-factor cho chức serine NS3 NS3 protein: protein lớn (97kDa), có vài hoạt đông enzym liên quan đến trình hình thành protein chép màng NS4A NS4B protein protein nhỏ liên quan tới màng NS4A có chức việc chép RNA NS4B chế chưa xác định NS5 protein : protin lớn nhất( 103kDa) ,có flavirus Nó với enzym methyl transferase tham gia vào việc hình thành RNA, chịu trách nhiệm tính ổn định RNA việc tạo cấu trúc 5’ RNA Hepacivirus: Protein lõi virus gây viêm gan C, NS3, NS4B NS5A kháng nguyên miễn dịch dịch thể chống lại HCV Mô hình virus HCV Footer Page of 126 Header Page of 126 Hepatitis C virus (HCV) phân loại vào giống Hepacivirus thuộc họ Flaviviridae Bộ gen HCV RNA chuỗi đơn chứa 9.6 kb gồm vùng không mã hóa 5’-3’ khung đọc mở dài mã hóa cho chuỗi nhiều protein khoảng 3000 axit amin Chuỗi protein protease tế bào virus cắt thành 11 protein virus khác Các protein cấu trúc HCV bao gồm protein lõi glycoprotein xuyên màng, E1 E2 Vùng lõi mã hóa cho protein F với chức chưa rõ Vùng nằm gen cấu trúc vùng không mã hóa cho protein cấu trúc mã hóa cho protein kênh màng cation p7, quan trọng cho sinh sản virus Ngoài ra, HCV có protein khác protein cấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A NS5B) NS2 cystein protease NS3 protein đa chức (serine protease RNA helicase) NS4A đồng yếu tố (cofactor) quan cho NS3 protease Hiện có thông tin chức protein NS4B việc chúng tham gia vào hình thành mạng lưới màng nơi mà RNA HCV tiến hành chép NS5A phosphoprotein tham gia vào việc hình thành hạt virus kháng lại interferon NS5B mã hóa cho RNA polymerase phụ thuộc vào RNA (RdRp) nhóm nghiên cứu Maarit Sillanpää xác định kháng nguyên HCV gồm protein lõi, protein NS4B, NS3, NS5A Để có kết này, nhóm tổng hợp protein cấu trúc (protein lõi, E1 E2) protein NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A NS5B tế bào côn trùng Sf9 hệ thống biểu baculovirus Các protein tinh xác định khả nhận biết 68 mẫu huyết bệnh nhân có chứa kháng thể chống lại HCV Footer Page of 126 Header Page of 126 Pestivirus: bovine viral diarrhoea virus (BVDV) Cấu trúc gen BVDV Footer Page of 126 Header Page of 126 Pestivirus có hệ gen RNA đơn dương bao bọc capsid bao gồm protein capsid Vỏ capsid bao gồm glycoprotein E1 E2 Bộ gen RNA xấp xỉ 12300 nucleotit chứa khung đọc mở mã hóa polyprotein khoảng 4000 aminoacid Khung đọc mở hai đầu 5’ 3’ Nhửng khu vực chứa chuỗi tín hiệu quan trọng cho việc chép dịch mả ORF dịch mã polyprotein, tế bào bị nhiễm bệnh tạo thành cấu trúc siêu vi C, ERNS, E1, E2 protein phi cấu trúc P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A NS5B Tác nhân gây bệnh pestivirus sản xuất nhiều NS3, E2 chất sinh miễn dịch chủ yếu pestivirus Sau lây nhiễm pestivirus kháng thể chống lại ERNS, E2 NS3 sản xuất Nhưng có E2 có kháng thể trung hòa NS3 NS4A quan trọng miễn dịch tế bào Chẩn đoán phân biệt I Chẩn đoán phân biệt dựa vào biểu bệnh lâm sàng • Hepatitis C virus (HCV): virus gây bệnh viêm gan C người Thông thường từ đến tuần sau bị bệnh , người bệnh thường thấy khó chịu cảm cúm, nhức đầu, mệt mỏi, buồn nôn ,đau bụng,tiêu chảy,xuống cân , da mắt trở nên vàng Các triệu chứng thường kéo dài từ đến tuần từ từ thuyên giảm, hoàn toàn biến sau thời gian ngắn • Dengue fever virus(DFV): virus gây bệnh sốt xuất huyết thông qua tác nhân muỗi Gây bệnh người động vật Khi virus xâm nhập vào thể gây bệnh, người bệnh có triệu chứng như: sốt cao đột ngột liên tục từ đến ngày Xuất huyết da:nốt xuất huyết rải rác chấm xuất huyết thường bụng, đùi, lưng Xuất huyế tở niêm mạc: chảy máu mũi, lợi, xuất huyết niêm mạc, tiểu máu • bovine viral diarrhoea virus (BVDV): virus gây nên bệnh tiêu chảy bò súc vật có thời gian ủ bệnh 2-3 ngày, sau dó thể dấu hiệu lâm sàng đặc trưng: - Chúng uống nước nhiều, ăn bỏ ăn, không nhai lại, thức ăn bị đầy ứ dày, sách bị cứng - Sau vật ỉa lỏng, có phân sệt, sau ỉa chảy nặng, phân dịch màu xám xanh, xám vàng có mùi Bê ỉa chảy nặng, 10-15 lần/ ngày, nước nhanh, làm cho vật trũng mắt, da nhăn nheo chết tình trạng nước, rối loạn chất điện giải máu - Các trường hợp nặng, vật bệnh bị xuất huyết ruột, thể phân có lẫn máu niêm mạc ruột lầy nhầy Bê non thường bị chết sau 3-4 ngày với tỷ lệ cao 30-40% số vật bệnh không điều trị kịp thời Footer Page of 126 Header Page of 126 Sử dụng kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán phân biệt: Chẩn đoán phân biệt chủng virus phương pháp RT-PCR Mỗi loại vi sinh vật có trình tự gen khác Mặc dù type virus thuộc họ nên có cấu trúc phân tử giống nhiên chúng khác trình tự gene Nhờ kỹ thuật giải trình tự gene biết trình tự gen khác type virus , từ xây dưng nên đoạn mồi đặc hiệu cho type virus Vì để chẩn đoán phân biệt chủng virus người ta sử dụng phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi khác tương ứng với loại virus • Đối với Hepatitis C virus : Phản ứng RT-PCR sử dụng phản ứng bước sử dụng cặp mồi tác giả Caudai công bố Mồi xuôi (CC1F): 5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGG-3’, bao gồm 20 nucleotid, vị trí 6988 phần đầu hệ gen HCV Mồi ngược (CC2R): 5’-GAGGTTTAGGATTCGTGCTC-3’, bao gồm 20 nucleotid, vị trí 363-344 phần đầu hệ gen HCV Kết xét nghiệm RT-PCR phát HCV-RNA thực với kit Footer Page of 126 NK HCV-RTPCR Header Page 10 of 126 • Đối với dengue fever virus: Được khuếch đại với cặp mồi cụ thể cho khu vực NS5, cFD2 (GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC) MA (CATGATGGGRAARAGRGARRAG) Kết xét nghiệm RT-PCR phát định type virút Dengue gây sốt Dengue sốt xuất huyết Dengue • Đối với bovine viral diarrhoea virus: Các mồi thiết lập sử dụng PCR Primer-1 (mồi xuôi: - 5'-GCA GAT TTT GAA GAA AGA CAC TA-3’ Primer-2 (Reverse) - 5'-TTG TGT GTG GTA AGC CCA-3’ Nhờ đoạn mồi đặc trưng ta chẩn đoán phân biệt type virus với II Kết luận: Các giống virus thuộc họ Flaviviridae có cấu trúc phân tử giống nên việc sử dụng kỹ thuật RT-PCR hiệu việc chẩn đoán phân biệt loài virus Hiện nay, phương pháp ứng dụng rộng rãi thay cho việc nuôi cấy phân lập Tài liệu tham khảo: Google.com.vn Giáo trình “virus học”- Phạm Văn Ty Journal of microbiology.vn Footer Page 10 of 126 Header Page 11 of 126 Ncbi.nlm.nih.gov Footer Page 11 of 126  ... trưng ta chẩn đoán phân biệt type virus với II Kết luận: Các giống virus thuộc họ Flaviviridae có cấu trúc phân tử giống nên việc sử dụng kỹ thuật RT-PCR hiệu việc chẩn đoán phân biệt loài virus. .. dụng kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán phân biệt: Chẩn đoán phân biệt chủng virus phương pháp RT-PCR Mỗi loại vi sinh vật có trình tự gen khác Mặc dù type virus thuộc họ nên có cấu trúc phân tử giống nhiên... khác type virus , từ xây dưng nên đoạn mồi đặc hiệu cho type virus Vì để chẩn đoán phân biệt chủng virus người ta sử dụng phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi khác tương ứng với loại virus • Đối với