Đang tải... (xem toàn văn)
CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT, CÁC PHƯƠNG PHÁP THU, BẢO QUẢN MẪU NƯỚC VÀ THỰC PHẨM, ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (TPC) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA, ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA, ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP CẤY TRANG, XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA E.COLI TRONG THỰC PHẨM, XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM
Page Bài : CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Sau học xong học viên có thể: - Biết quy tắc an toàn làm việc với vi sinh vật Đảm bảo an toàn thân người xung quanh làm việc với vi sinh vật đặc biệt nhóm vi khuẩn gây bệnh Thao tác an toàn yêu cầu quan trọng kiểm nghiệm vi sinh vật Khi làm việc với vi sinh vật, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật ( mức tế bào/ml) Nhiều chủng vi sinh vật tác nhân gây bệnh nên cần luôn cẩn thận với tất chủng thao tác Mặt khác, nhân viên kiểm nghiệm phải sử dụng nhiều loại hóa chất, có acid hóa chất có độc tính Do vậy, cần tuân thủ số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho thân cho người khác phòng thí nghiệm sau: - Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật Không ăn uống, hút thuốc phòng kiểm nghiệm Mang trang thao tác với - vi sinh vật Mặc áo blouse thời gian làm việc Trước bắt đầu làm cần xác trùng mặt bàn giấy lau tẩm cồn dung dịch chất diệt khuẩn khác ( Lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô Thực tương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn tay chưa khô cồn Lặp lại việc sát trùng sau - hoàn thành công việc Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất đĩa petri, ống nghiệm môi - trường, bình nuôi cấy Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệt - khuẩn lau kỹ, sau thực khử trùng lại làm việc Cẩn thận thao tác với đèn cồn Tắt lửa chưa có nhu cầu sử dụng sau thực xong hoàn tác Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua lửa Cần có cách - bảo vệ tóc thích hợp trường hợp tóc dài Sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút bằngmiệng Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất mảnh vỡ vào túi rác riêng Page - Tách riêng chất thải rắn chất thải lỏng Tất chất thải rắn, môi trường chứa nhiễm vi sinh vật cần hấp khử trùng trước thải bỏ vào bãi rác Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần - ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn ( nước javel) trước rữa tái sử dụng Cần gói ràng băng keo đặt chồng đĩa peptri lên Không mở đĩa petri dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật, cần đặt vòng đầu - que cấy vào chân lửa để tránh văng nhiễm vi sinh vật vào không khí Sát trùng rửa tay trước rời phòng thí nghiệm Page Bài : CÁC PHƯƠNG PHÁP THU, BẢO QUẢN MẪU NƯỚC VÀ THỰC PHẨM MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU : - Công đoạn lấy, vận chuyển bảo quản mẫu công đoạn quan trọng Mọi sai sót công đoạn ( lượng mẫu không đủ, mẫu bị nhiễm bẩn từ bên ngoài, nhiễm bẩn từ dụng cụ, mẫu bị biến đổi tác nhân lý, hoá, sinh học…) dẫn tới sai lệch nghiêm trọng kết thử nghiệm - Việc lấy mẫu cần phải đảm bảo hai điều kiện : • Mẫu lấy phải đại diện cho lô hàng nơi lấy mẫu ( kiện tra vệ sinh công nghiệp) nhận dạng rõ ràng • Hàm lượng chất hay vi sinh vật cần xác địng không biến đổi kể từ lấy mẫu đến phân tích THU VÀ BẢO QUẢN MẪU NƯỚC : Thu mẫu : dựa theo tiêu chí mẫu phải đại diện mức cao nước cần phân thể tích Dụng cụ lấy mẫu : dụng cụ phải súc rửa cẩn thận, tráng lại lần cuối nước cất khử trùng trước sử dụng Có thể sử dụng túi nhựa vô trùng để lấy mẫu Quy trình lấy mẫu : - Lấy mẫu từ nguồn sông, suối, hồ : cầm chai vị trí gần đáy, đưa cổ chai lên hướng xuống đưa sâu vào mặt nước Xoay nhẹ để cổ chai nghiêng lên bề mặt nước miệng chai hướng phía dòng chảy Trong trường hợp dòng chảy phải tạo dòng chảy nhân tạo cách xoay chai theo hướng nằm ngang đẩy chai theo hướng miệng chai Nếu lấy mẫu thuyền phải lấy mẫu trước mũi thuyền Có thể buộc vật nặng vào đáy chai từ từ đưa nước vào Trong tất trường hợp tránh không cho dụng cụ lấy mẫu tiếp xúc với bờ hay suối hay bồn chứa Page - Lấy mẫu từ vòi hệ thống cấp nước dịch vụ, chọn vòi cấp nước trực tiếp từ đường ống Mở vòi thật lớn, để chảy khoảng – phút sau giảm vòi để lấy vào - dụng cụ chứa mẫu Lấy nước từ giếng bơm tay : bơm nước khoảng phút để rửa vòi, mẫu lấy trực tiếp cách buộc vật nặng vào chai lấy mẫu Phải tránh nhiễm bẩn từ vật nặng - thành giếng Lấy mẫu nước uống : lấy giai đoạn cuối trình sản xuất Thể tích mẫu phải đủ để phân tích, không nhỏ 100ml Mẫu sau lấy phải ghi đầy đủ xác ký hiệu liệu mô tả Bảo quản vận chuyển : - Nhiệt độ bảo quản mẫu nước 10°C thời gian vận chuyển không 6h Bảo quản tủ lạnh phòng thí nghiệm không 2h Không chấp nhận gửi mẫu phân tích đường bưu điện không bảo quản theo yêu cầu THU VÀ BẢO QUẢN MẪU THỰC PHẨM : Lấy mẫu theo lô hàng : Thông thường vị trí lấy mẫu sau: lô hàng mẫu chung mẫu trung bình mẫu phân tích( cảm quan, kháng sinh, vi sinh) Lấy mẫu theo dây chuyền sản xuất : Khi tiến hành thu mẫu công đoạn nguyên liệu thành phẩm bắt buộc, giai đoạn bán thành phẩm tuỳ từng loại mặt hàng sản phẩm mà có công đoạn khác số lượng công đoạn nhiều khác Không thể thu hết tất công đoạn giai đoạn bán thành phẩm mà chỉ thu công đoạn liên tiếp lần thu mẫu Thu mẫu vệ sinh công nghiệp : Là thu mẫu trình sản xuất chế biến công nhân, dụng cụ sản xuất vệ sinh, đồ bảo hộ lao động công nhân găng tay, yếm, ủng, … máy móc trực tiếp sản xuất nhằm xác định có lây nhiễm hay không Thu mẫu ở cửa hàng hoặc chợ : Chủ yếu dựa vào kinh nghiệm quan sát người thu mẫu Khi thu mẫu cần mang tính đại diện đảm bảo không bị tạp nhiễm Dụng cụ lấy mẫu Page Thường thùng nhựa, sử dụng bao nylon để chứa mẫu Không dùng bình thuỷ tinh dễ vỡ làm nhiễm mẫu hay gây tai nạn cho người thu mẫu Các dụng cụ thu mẫu dao, kéo, … khử trùng Bảo quản vận chuyển : - Các mẫu sau lấy bảo quản tách biệt thùng chứa mẫu, giữ lạnh bao nước đá Tại phòng kiểm nghiệm , mẫu chuyển tủ đông phân - tích thời gian Nếu không phân tích được, mẫu phải bảo quản -20°C phân tích Nếu mẫu bảo quản đông, bảo quản 4°C không 36h Các loại đồ hợp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay khó hư bảo quản nhiệt độ phòng Chuẩn bị mẫu thực phẩm : - Rã đông điều kiện vô trùng, nhiệt độ – 5°C 18h, cần nhanh có - thể nhiệt độ phòng 2h 45°C 15p Cân lượng mẫu xác định để phân tích tuỳ theo từng chỉ tiêu yêu cầu, sai số cho phép ± 0,1g Lượng mẫu phân tích cho vào bình nhựa bao nylon vô - trùng Sau cân mẫu cho dung dịch pha loãng vào mẫu, tiến hành đồng mẫu để đảm bảo phân phối vi sinh vật vào dịch pha loãng thật đồng CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Lấy mẫu từ nguồn sông, suối, hồ : cầm chai vị trí gần đáy, đưa cổ chai lên hướng xuống đưa sâu vào mặt nước Xoay nhẹ để cổ chai nghiêng lên bề mặt nước miệng chai hướng phía dòng chảy Trong trường hợp dòng chảy phải tạo dòng chảy nhân tạo cách xoay chai theo hướng nằm ngang đẩy chai theo hướng miệng chai Nếu lấy mẫu thuyền phải lấy mẫu trước mũi thuyền Có thể buộc vật nặng vào đáy chai từ từ đưa nước vào Trong tất trường hợp tránh không cho dụng cụ lấy mẫu tiếp xúc với bờ hay suối hay bồn chứa Câu 2: Lấy mẫu theo dây chuyền sản xuất : Page Khi tiến hành thu mẫu công đoạn nguyên liệu thành phẩm bắt buộc, giai đoạn bán thành phẩm tuỳ từng loại mặt hàng sản phẩm mà có công đoạn khác số lượng công đoạn nhiều khác Không thể thu hết tất công đoạn giai đoạn bán thành phẩm mà chỉ thu công đoạn liên tiếp lần thu mẫu Câu 3: - Rã đông điều kiện vô trùng, nhiệt độ – 5°C 18h, cần nhanh có - thể nhiệt độ phòng 2h 45°C 15p Cân lượng mẫu xác định để phân tích tuỳ theo từng chỉ tiêu yêu cầu, sai số cho phép ± 0,1g Lượng mẫu phân tích cho vào bình nhựa bao nylon vô - trùng Sau cân mẫu cho dung dịch pha loãng vào mẫu, tiến hành đồng mẫu để đảm bảo phân phối vi sinh vật vào dịch pha loãng thật đồng Page Bài 3: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (TPC) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA Khái niệm nguyên tắc 1.1 Khái niệm VSV hiếu khí VSV tăng trưởng hình thành khuẩn lạc điều kiện có diện oxy phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khí diện mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh thực phẩm 1.2 Nguyên tắc (TCVN:5165-90) Sử dụng kỹ thuật đỗ đĩa, đếm khuẩn lạc môi trường thạch sau ủ điều kiện hiếu khí 300/72h ± 6h Số lượng vi khuẩn hiếu khí 1g 1ml mẫu thực phẩm kiểm nghiệm tính theo số khuẩn lạc đếm đĩa nuôi cấy theo nồng độ pha loãng Môi trường dụng cụ 2.1 Môi trường sử dụng - Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water (SPW) Buffer Pepton Water (BPW) - Môi trường nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA) 2.2 Dụng cụ - Đĩa petri - Ống nghiệm - Tủ ấm 300C Quy trình phân tích 25g mẫu +225ml BPW → đồng 30s → độ pha loãng 10-1 Pha loãng nước muối sinh lý → độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 Page Từ độ pha loãng hút 1ml cho vào đĩa petri vô trùng Sau đổ môitrường PCA làm nguội đến 45oC Lắc chờ đĩa thạch nguội → úp ngược → đem ủ nhiệt độ 30oC/72h Đọc kết từ 25-250 khuẩn lạc Thuyết minh quy trình 4.1 Chuẩn bị mẫu Cân xác 10g ( 25g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau thêm vào 90ml ( 225ml) dung dịch pha loãng mẫu Tiến hành đồng mẫu máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu không 2,5 phút Tất thao tác phải thực điều kiện vô trùng Khi đó, ta có dung dịch pha loãng 10-1 Dịch pha loãng pha loãng theo dãy thập phân cách dùng micropipette (pipetman) vô trùng chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng → đồng nhất, ta có dịch pha loãng 10-2 Tiếp tục thực tương tự để có độ pha loãng cần thiết 4.2 Đổ đĩa Chọn hay độpha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25-250 tế bào vi sinh vật Dùng micropipette với đầu tip vô trùng để chuyển 1ml dịch pha loãng vào đĩa petri vô trùng Tương ứng với độ pha loãng cấy từ 2-3 đĩa Saukhi cấy, đổ vào đĩa 10-15 ml môi trường PCA nấu chảy để nguội đến 45-50 0C Trộn mẫu vào môitrường Page cách xoay tròn đĩa petri xuôi ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc Ủ 4.3 Các đĩa lật ngược lại nuôi ủ nhiệt độ 300C 72 Đọc tính kết quả 4.4 Đếm tất khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Chọn đĩa có số đếm từ 25 - 250 khuẩn lạc để tính Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí 25g mẫu tính sau: Trong : A: số tế bào vi khuẩn ( khuẩn lạc) 1g mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn n: số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường f: độ pha loãng tương ứng • • Nguồn mẫu phân tích Tên mẫu: Pate (gan heo) Địa điểm thu: Xe bán bánh mì trước cổng trường Hutech (Cô Lan 475A/Điện Biên Phủ, • • - P.25, Bình Thạnh) Thời gian thu: 7h30 Ngày 29/03/2017 Cảm quan: màu sắc nâu đặc trưng, mùi đặc trưng, kết cấu đẹp Chỉ tiêu TPC Nồng độ pha loãng Đĩa Đĩa 10-3 75 36 10-4 Page 10 Bài 2: Bài 3: BÀI : XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA E.COLI TRONG THỰC PHẨM 6.1 KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN TẮC 6.1.1 Khái niệm - Coliforms trực khuẩn, Gram âm/ không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi, có khả - lên men lactose sing acid sinh 370C 24 – 48 Coliforms chịu nhiệt coliforms có khả lên men lactose, sinh acid sinh - nhiệt độ 440C 24 – 48 Coliforms phân (feacal Coliforms) Coliforms nhiệt có thử nghiệm indol môi - trường trypton dương tính E.Coli Coliforms phân có nghiệm pháp IMViC (+) (+) (-) (-) 6.1.2 Nguyên tắc - Phương pháp dùng để định tính kết luận phát hay không phát E.Coli - khối lượng mẫu xác định Tiến hành tăng sinh chọn lọc môi trường thích hợp ( BGBL ) Phân lập môi trường phù hợp (EMB) Khẳng định phương pháp sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC) Kết luận có diện E.Coli 25g mẫu hay không 6.2 MÔI TRƯỜNG VÀ DỤNG CỤ 6.2.1 Môi trường sử dụng - Môi trường Trypticase Soya Agar (TSA) Canh Brilliant Green Bile Lactose (BGBL) Page 27 - Môi trường Eosine Methylene Blue (EMB) Canh Trypton Canh MR-VP Thạch Simmon Citrate Thuốc khử Kovac’s Thuốc khử Methyl Red Thuốc thử a-naphtol 5% KOH 40% 6.2.2 Dụng cụ - Đĩa petri Ống nghiệm - ống Durnham Bể điều nhiệt 440C Tủ ấm 370C 6.3 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Page 28 6.4 THUYẾT MINH QUY TRÌNH 6.4.1 Chuẩn bị mẫu - Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự phần định lượng tổng số vi sinh hiếu khí 6.4.2 Tăng sinh chọn lọc - Cấy 1ml dịch mẫu pha loãng nồng độ 10 -1 vào ống nghiệm chứa canh BGBL, ủ 440C 24 6.4.3 Phân lập - Sau 24 giờ, chọn ống nghiệm cho phản ứng dương tính (môi trường đục có sinh - hơi) cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB.Ủ 370C 24 Nhận dạng khuẩn lạc E.Coli: lạc tròn, dẹp, có tâm đên, có bờ đều, đường kính 0,5 mm, có ánh kim tím 6.4.4 Khẳng định Page 29 - Những khuẩn lạc nghi ngờ thực qua bước thử nghiệm sinh hóa (thực - nghiệm pháp IMViC) Chọn khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường phân lập cấy chuyển sang môi trường - rắn không chọn lọc (môi trường TSA), ủ 370C 24 Các thử nghiệm sinh hóa dùng để khẳng định E.Coli sau : STT Thử nghiệm sinh hóa Indole Methyl Red Voges Proskauer Khả sử dụng Citrate Kết quả + + - 6.5 KẾT QUẢ • • Nguồn mẫu phân tích Tên mẫu: Pate (gan heo) Địa điểm thu: Xe bán bánh mì trước cổng trường Hutech (Cô Lan 475A/Điện Biên Phủ, P.25, Bình Thạnh) • Thời gian thu: 7h30 Ngày 29/03/2017 Kết quả BGBL (+) (+) Kết quả EMB Kết quả sinh hóa Khuẩn lạc dẹt, có ánh Indole MR VP kim, đường kính khoảng (+) (+) (-) 1mm Kết luận: Có E.coli Page 30 Citrate (-) Hình 6.E.coli ống BGBL Hình E.coli môi trường EMB (đục sinh hơi) Hình Kết quả thử nghiệm IMViC xác định E.coli CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: - Phương pháp dùng để định tính kết luận phát hay không phát E.Coli - khối lượng mẫu xác định Tiến hành tăng sinh chọn lọc môi trường thích hợp ( BGBL ) Phân lập môi trường phù hợp (EMB) Khẳng định phương pháp sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC) Kết luận có diện E.Coli 25g mẫu hay không Câu 2:Khuẩn lạc E.Coli: tròn, dẹp, có tâm đen, có bờ đều, đường kính 0,5 mm, có ánh kim tím Câu 3: Page 31 - Indole: VK phân giải tryptophan enzyme tryptophanase để acid indolepyruvic -> khử amine -> indole + acid pyruvic Bản thân indole màu, cho thuốc thử kovac’s vào có vòng đỏ dương tính, không âm tính - Methyl Red: VK sử dụng glucose môi trường để tạo sản phẩm acid pyruvic trì sản phẩm đỏ, không biến đổi thêm, ta cho thuốc thử nghiệm methyl red vào, có tạo acid cho màu đỏ, không tạo acid cho màu vàng - Voges proskauer: VK sử dụng glucose môi trường để tạo sản phẩm acid pyruvic -> 2,3 butanediol -> acetoin Dùng thuốc thử naphtol 5% : KOH 40% (3:1) Phản ứng tạo màu đỏ dương tính, màu vàng âm tính - Citrate: môi trường có citrate, ammonium, bromothymol blue, VK sử dụng citrate, sau dùng hết citrate, dùng muốn ammonium tạo sản phẩm NH , làm pH môi trường tăng, làm cho chất chỉ thị bromothymol blue biến thành màu xanh, không dùng citrate màu bromothymol blue vẫn cũ Câu 4: ∗ Chuẩn bị mẫu: Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự phần định lượng tổng số vi sinh hiếu khí ∗ Tăng sinh chọn lọc: Cấy 1ml dịch mẫu pha loãng nồng độ 10 -1 vào ống nghiệm chứa - canh BGBL, ủ 440C 24 ∗ Phân lập Sau 24 giờ, chọn ống nghiệm cho phản ứng dương tính (môi trường đục có sinh hơi) - cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB.Ủ 370C 24 Nhận dạng khuẩn lạc E.Coli: lạc tròn, dẹp, có tâm đên, có bờ đều, đường kính 0,5 mm, có - ánh kim tím ∗Khẳng định Những khuẩn lạc nghi ngờ thực qua bước thử nghiệm sinh hóa (thực nghiệm - pháp IMViC) Chọn khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường phân lập cấy chuyển sang môi trường rắn không chọn lọc (môi trường TSA), ủ 370C 24 Page 32 - Các thử nghiệm sinh hóa dùng để khẳng định E.Coli sau : STT Thử nghiệm sinh hóa Indole Methyl Red Voges Proskauer Khả sử dụng Citratr Page 33 Kết quả + + - BÀI 7: XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM 7.1 Nguyên tắc - Quy trình phát Salmonella thực phẩm thực qua bước: Tiền tăng sinh: cân lượng mẫu cho vào môi trường BPW, sau ủ nhiệt độ 37 0C - 24h Tăng sinh chọn lọc: dịch mẫu sau tiền tăng sinh, cấy vào môi trường chọn lọc - Rappaport Vassiliadis Soya broth Phân lập: cấy vào loại môi trường phân lập XLD, BPLS, HE, BSA, Khẳng định: khuẩn lạc đặc trưng khẳng định thử nghiệm: TSI, LDC, Mannitol, Urea, Indol VP 7.2 Môi trường dụng cụ 7.2.1 Môi trường sử dụng - Môi trường canh Rappaport Vassiliadis Soya broth (RVS) Môi trường Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) Môi trường Trypticasc Soya Agar (TSA) Môi trường Triple Sugar Iron Agar (TSI) Môi trường Mannitol Phenol Red both Môi trường Urea broth Môi trường Lysin Decarboxylase (LDC) Canh Trypton Canh MR-VP Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử α-naphtol 5% KOH 40% 7.2.2 Dụng cụ - Đĩa petri Ống nghiệm Bể điều nhiệt 420C Tủ ấm 370C 7.3 Quy trình phân tích Page 34 Page 35 7.4 Thuyết minh quy trình 7.4.1 Tiền tăng sinh - Tiền tăng sinh loại mẫu thông thường: cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng Thêm 225ml dung dịch pepton đệm đồng mẫu Thời gian đồng mẫu 15 giây 30 giây tùy theo từng loại mẫu Ủ 370C 24 7.4.2 Tăng sinh chọn lọc - Cấy 0.1 ml dịch mẫu tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10 ml canh RVS, ủ 42 0C 24 7.4.3 Phân lập - Dùng que cầy vòng lấy vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh chọn lọc RV cấy ria lên môi trường chọn lọc cho Salmonella như: XLD, BPLS, BSA, HE….Cường độ chọn lọc, mức độ đặc trưng hình thái biểu khuẩn lạc Salmonella từng môi trường khác sau: Môi trường XLD: khuần lạc có màu hồng suốt, có hay tâm đen Một số dòng có tâm đen lớn bao trùm khuần lạc Môi trường XLD chuyển sang màu hồng 7.4.4 Khẳng định - Khuần lạc nghi ngờ Salmonella phải kiểm tra sinh hóa kháng huyết Từ môi trường phân lập, cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc (môi trường TSA), ủ 37 0C 24 giờ, khuẩn lạc xuất môi trường sử dụng để thử nghiệm sinh hóa STT Thử nghiệm sinh hóa TSI LDC Manitol Page 36 Kết quả Nghiêng đỏ/sâu vàng (+) (+) Urea Indole VP (-) (-) (-) 7.4.5 Báo cáo kết quả - Nguồn mẫu phân tích • Tên mẫu: Pate (gan heo) • Địa điểm thu: Xe bán bánh mì trước cổng trường Hutech (Cô Lan 475A/Điện Biên Phủ, P.25, Bình Thạnh) • Thời gian thu: 7h30 Ngày 29/03/2017 BPW (+/-) (+) RV (+/-) (+) Kết luận: Không phát Salmonella Page 37 XLD (+/-) (+) Kết sinh hóa TSI: Nghiêng đỏ/sâu vàng, sinh hơi, sinh H2S LDC: (+) Mannitol: (+) Urea: (+) Indol: (+) VP: (-) Hình 9.Salmonella môi trường RV Hình 10.Salmonella môi trường XLD CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: - Quy trình phát Salmonella thực phẩm thực qua bước: Tiền tăng sinh: cân lượng mẫu cho vào môi trường BPW, sau ủ nhiệt độ 37 0C - 24h Tăng sinh chọn lọc: dịch mẫu sau tiền tăng sinh, cấy vào môi trường chọn lọc Rappaport Vassiliadis Soya broth Page 38 - Phân lập: cấy vào loại môi trường phân lập XLD, BPLS, HE, BSA, Khẳng định: khuẩn lạc đặc trưng khẳng định thử nghiệm: TSI, LDC, Mannitol, Urea, Indol VP Câu 2: Môi trường XLD: khuần lạc tròn, lồi, tâm đen, môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng Giải thích: tâm đen Vk tiết enzyme phân giải lưu huỳnh-> sinh khí H 2S, kết hợp với Fe có môi trường tạo kết tủa FeS Môi trường XLD sau VK dùng hết xylose, sau dùng tới lysine nhờ enzyme lysine decarboxylase tạo sản phẩm base, làm pH tăng, mà môi trường có chỉ thị phenol red nên môi trường chuyển sang màu hồng Câu 3: - TSI: môi trường có nguồn đường (glucose 0.1%, Sucrose 1%, Lactose 1%) + Trường hợp sử dụng nguồn đường: điều kiện hiếu khí (thạch nghiêng) VSV chỉ sử dụng nguồn đường sau hết đường dùng tiếp muối ammonium, tạo sản phẩm base pH tăng -> đỏ (do chỉ thị phenol red),ở điều kiện kị khí (thạch sâu) VSV lên men đừng tạo acid làm pH giảm-> vàng +Trường hợp dùng nguồn đường tạo acid điều kiện hiếu khí kị khí -> nghiêng vàng sâu vàng +Trường hợp không dùng đường: tạo sản phẩm base hiếu khí kị khí -> nghiêng dỏ sâu vàng - LDC: lysine bị enzyme lysine decarboxylase tạo cadavarine, làm pH tăng, môi trường chuyển sang màu tím - Mannitol: VSV lên men đường mannitol tạo sản phẩm acid, làm pH giảm, môi trường chuyển sang màu vàng Page 39 - Urea: VSV thủy phân Urea tạo sản phẩm base NH 3, làm pH tăng, môi trường chuyển sang màu đỏ - Indole: VK phân giải giải tryptophan enzyme tryptophanase để tạo acid indolepyruvic -> khử amine -> indole + aicd pyruvic Indole không màu, cho thuốc thử kovac’s vào có vong đỏ dương tính, không màu âm tính - Voges proskauer: VK sử dụng glucose môi trường để tạo sản phẩm acid pyruvic -> 2,3 butanediol -> aceton Dùng thuốc thử naphtol 5%: KOH 40% (3:1) Phản ứng tạo màu đỏ dương tính, màu vàng âm tính Câu 4: ∗ Tiền tăng sinh - Tiền tăng sinh loại mẫu thông thường: cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng Thêm 225ml dung dịch pepton đệm đồng mẫu Thời gian đồng mẫu 15 giây 30 giây tùy theo từng loại mẫu Ủ 370C 24 ∗ Tăng sinh chọn lọc - Cấy 0.1 ml dịch mẫu tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10 ml canh RVS, ủ 42 0C 24 ∗ Phân lập - Dùng que cầy vòng lấy vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh chọn lọc RV cấy ria lên môi trường chọn lọc cho Salmonella như: XLD, BPLS, BSA, HE….Cường độ chọn lọc, mức độ đặc trưng hình thái biểu khuẩn lạc Salmonella từng môi trường khác sau: Môi trường XLD: khuần lạc có màu hồng suốt, có hay tâm đen Một số dòng có tâm đen lớn bao trùm khuần lạc Môi trường XLD chuyển sang màu hồng ∗ Khẳng định Page 40 - Khuần lạc nghi ngờ Salmonella phải kiểm tra sinh hóa kháng huyết Từ môi trường phân lập, cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc (môi trường TSA), ủ 37 0C 24 giờ, khuẩn lạc xuất môi trường sử dụng để thử nghiệm sinh hóa STT Thử nghiệm sinh hóa TSI LDC Manitol Urea Indole VP Page 41 Kết quả Đỏ/vàng (+) (+) (-) (-) (-) ... PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Sau học xong học vi n có thể: - Biết quy tắc an toàn làm vi c với vi sinh vật Đảm bảo an toàn thân người xung quanh làm vi c với vi sinh vật đặc biệt nhóm vi khuẩn gây... yêu cầu quan trọng kiểm nghiệm vi sinh vật Khi làm vi c với vi sinh vật, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật ( mức tế bào/ml) Nhiều chủng vi sinh vật tác nhân gây bệnh nên... - Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm vi c với vi sinh vật Không ăn uống, hút thuốc phòng kiểm nghiệm Mang trang thao tác với - vi sinh vật Mặc áo blouse thời gian làm vi c Trước bắt đầu làm