BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VŨ THANH TRÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 70 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Chu Hoàng Mậu TS Trần Thị Phƣơng Liên Thái Nguyên - 2012 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng hướng dẫn PGS.TS Chu Hoàng Mậu TS Trần Thị Phương Liên Các số liệu trình bày luận án trung thực Một số kết công bố riêng đồng tác giả, phần lại chưa công bố công trình khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận án Tác giả Vũ Thanh Trà ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Mậu TS Trần Thị Phương Liên tận tình hướng dẫn giúp đỡ học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nông Văn Hải cán Phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học, TS Nguyễn Thị Bình, ThS.NCVC Nguyễn Thị Thanh Tuyết cán Bộ môn Miễn dịch Thực vật - Viện Bảo vệ Thực vật, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên bạn đồng nghiệp ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi giúp hoàn thành luận án Tôi xin cảm ơn gia đình người thân động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình học tập làm nghiên cứu sinh Công trình thực hoàn thành với việc sử dụng trang thiết bị Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng Hóa sinh protein, Phòng Công nghệ tế bào thực vật (Viện Công nghệ Sinh học); Phòng thí nghiệm Di truyền học, Phòng thí nghiệm Công nghệ gen (Bộ môn Di truyền Sinh học đại - Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên) Tác giả luận án Vũ Thanh Trà iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt v Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây đậu tương đặc điểm hóa sinh của đậu tương 1.1.1 Cây đậu tương 1.1.2 Đặc điểm hóa sinh đậu tương 1.2 Bệnh gỉ sắt tính kháng bệnh gỉ sắt đậu tương 1.2.1 Bệnh gỉ sắt ở đậu tương 1.2.2 Tính kháng bệnh gỉ sắt đậu tương 13 1.3 Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền đậu tương 17 1.3.1 Phương pháp sử dụng thị hình thái 17 1.3.2 Phương pháp sử dụng thị hoá sinh học 18 1.3.3 Phương pháp sử dụng thị phân tử DNA 20 1.4 Các nghiên cứu bệnh gỉ sắt đậu tương 26 1.5 Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương 29 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 33 2.1 Vật liệu 33 2.1.1 Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh 33 2.1.2 Hóa chất 37 2.1.3 Máy móc thiết bị 37 2.1.4 Mồi của phản ứng RAPD và SSR 38 2.2 Phương pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo 40 iv 2.2.2 Các phương pháp phân tích hóa sinh 43 2.2.3 Các phương pháp phân tích đa hình di truyền DNA 44 2.2.4 Các phương pháp phân tích đa hình protein 48 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 Đánh giá khả kháng bệnh gỉ sắt giống đậu tương nghiên cứu 53 3.2 Phân tí ch đặc điể̉m hóa sinh hạt của các giống đậu tương ên nghi cứu 58 3.2.1 Kết quả phân tích hàm lượng protein và lipid các hạt của giống đậu tương nghiên cứu 58 3.2.2 Phân tích tính hàm lượng và thành phần amino acid hạt một số giống đậu tương 61 3.3 Đánh giá đa dạng di truyền giống đậu tương phản ứng khác với bệnh gỉ sắt 64 3.3.1 Phân tí ch tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng thị phân tử RAPD 64 3.3.2 Phân tí ch tính đa hình DNA các giống đậu tương thị phân tử SSR 3.4 70 Phân tích tính đa hình protein số giống đậu tương phản ứng khác vớ́i bệnh gỉ sắt 76 3.4.1 Kết phân tích đa hình protein số giống đậu tương kỹ thuật điện di SDS-PAGE 77 3.4.2 Phân tích protein đậu tương kỹ thuật điện di hai chiều 79 3.4.3 Nghiên cứu tí nh đa hì nh protein của các giống đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều 90 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99 Kết luận .99 Đề nghị 100 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT µl 2DE AFLP Microliter Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài phân đoạn nhân APS Ammonium persulfate AUDPC Area Under Disease Progress Curve Avr protein Avirulence protein – Protein không nhiễm bệnh từ mầm bệnh AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center -Trung tâm phát triển rau màu Châu Á, Đài Loan bp Base pair - cặp bazơ CHAPS 3-[(3- Cholamidoppropyl)dimethylammonio] cm Centimeter CTAB Cetylmethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid - ADN dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamine tetra acetic acid ESI-Q Elecspray ionization Q Trap- Phương pháp khối phổ sử dụng tí nh TRAP bẫy ion kết hợp nguồn ion hóa bằng cách phun chùm điện tử EtBr Ethidium bromide HPLC High-performance liquid chromatography -Sắc ký lỏng hiệu cao IAA Indole-3-acetamide IEF Isoelectric Focusing – Phương pháp điện di theo điểm đẳng điện IMA Institute of Tropical Agriculture -Viện Nông nghiệp nhiệt đới, Nigeria INTSOY International Soybean Program -Chương trình nghiên cứu đậu tương Quốc tế, Hoa Kỳ IPG Immobile pH gradient - Dải gradient pH cố định IRRI International Rice Research Institute- Viện nghiên cứu lúa quốc tế, Philippin Kb Kilo base vi kDa mA MAS ml MS/MS NST OD PCR PEG PIC Kilo Dalton MiliAmpe Marker Assisted Selection -Chọn lọc nhờ trợ giúp thị phân tử Mililiter Mass spectrometry/ Mass spectrometry - Khối phổ liên tục Nhiễm sắc thể Optical Density- Mật độ quang học Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase Polyethylene glycol Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình PMSF PR protein QTL R gen R protein RAPD Phenylmethanesulphonylfluoride Pathogenesis-related protein - Protein liên quan đến mầm gây bệnh Quantitative Trait Loci- Các locus tính trạng số lượng Resistant gen – Gen kháng bệnh Resistant protein - Protein khángbệnh Random amplified polymorphism DNA - DNA đa hình nhân ngẫu nhiên Restriction fragment length polymorphism - Đa hình chiều dài phân đoạn cắt hạn chế Ribonucleic acid Systemic acquired resistance – Sự kháng bệnh có hệ thống Sodium dodecyl sulfate SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis - Điện di biến tính gel polyacrylamide có SDS Simple Sequence Repeat - Trình tự lặp lại đơn giản Tris acetate EDTA Trichloracetic acid N,N,N‟,N‟ Tetramethylethylenediamine Phương pháp phân nhóm Volt – Vôn Weight/volume - Khối lượng/thể tích RFLP RNA SAR SDS SDSPAGE SSR TAE TCA TEMED UPGMA V w/v vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Danh sách giống đậu tương nghiên cứu 33 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide 20 mồi RAPD 38 Bảng 2.3 Trình tự nucleotide cặp mồi SSR 39 Bảng 2.4 Thành phần gel sơ đồ nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến 46 Bảng 2.5 Thành phần gel polyacrylamide 49 Bảng 3.1 Phản ứng giống đậu tương bệnh gỉ sắt 53 Bảng 3.2 Hàm lượng protein lipid hạt 50 giống đậu tương 59 Bảng 3.3 Thành phần amino acid 20 giống đậu tương 63 Bảng 3.4 Tỷ lệ phân đoạn đa hình giá trị PIC mẫu nghiên cứu 67 Bảng 3.5 Kết quả phân tí ch sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR 72 Bảng 3.6 Danh sách protein đậu tương giống ĐT 2000 được nhận diện bằng phương pháp khối phổ 84 Bảng 3.7 Đa dạng mức độ biểu hiện của các protein giữa mẫu thí nghiệm đối chứng hai giống nhiễm bệnh(ĐT12 VMK) 92 Bảng 3.8 Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện khác giữa thí nghiệm và đối chứng ở hai giống nhiễm bệnh ĐT12 VMK 93 Bảng 3.9 Mức độ protein biểu khác giống nhiễm bệnh gỉ sắt mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (ĐT12, VMK) giống kháng (ĐT2000, CBU8325) 96 Bảng 3.10 Nhận diện protein có mức độ thay đổi giống nhiễm với giống kháng bệnh gỉ sắt 97 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Trang Mặt sau đậu tương bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) hình ảnh bào tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (B) 10 Hình 1.2 Hình ảnh nấm P pachyrhizi gây bệnh gỉ sắt đậu tương chụp kính hiển vi điện tử 12 Hình 1.3 Mô hình hoạt động protein kháng bệnh nấm 14 Hình 1.4 Sơ đồ phân tách protein bằng diện di 2-DE 19 Hình 2.1 Hình ảnh thí nghiệm nhiễm bệnh nhân tạo phòng thí nghiệm 42 Hình 2.2 Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry 43 Hình 3.1 Hình ảnh giống đậu tương mức độ phản ứng với bệnh gỉ sắt 57 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14 65 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18 66 Hình 3.4 Sơ đồ hình 50 giống đậu tương dựa hệ số tương đồng di truyền xác định thị RAPD kiểu phân nhóm UPGMA 69 Hình 3.5 Các alen locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C), Satt 005 (D) 50 giống đậu tương 71 Hình 3.6 Sơ đồ hình mối quan hệ 50 giống đậu tương có phản ứng khác với bệnh gỉ sắt dựa thị phân tử SSR 74 Hình 3.7 Hình ảnh điện di SDS-PAGE 12,5% protein chiết từ đậu tương VMK, CBU8325, ĐT12 ĐT 2000 78 Hình 3.8 Hình ảnh điện di 2-DE so sánh mức độ biểu protein đậu tương giống ĐT2000 thời điểm (A) ngày ngày (B) 79 ix Hình 3.9 So sánh đa dạng protein đậu tương giống ĐT12, ĐT2000, CBU8325 VMK 81 Hình 3.10 Kết phân tích nhận diện protein catalase sắc ký khối phổ 83 Hình 3.11 Sơ đồ phân nhóm chức protein đậu tương giống ĐT2000 89 Hình 3.12 So sánh đa dạng protein lá đậu tượng đối chứng và thí nghiệm giống sau gây nhiễm bệnh9 ngày (ĐT12 VMK) 91 Hình 3.13 So sánh đa dạng protein đậu tương sau gây nhiễm ngày giống nhiễm bệnh gỉ sắt (ĐT12, VMK) giống kháng bệnh gỉ sắt (ĐT2000 CBU8325) 95 data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... 1.1 Cây đậu tương đặc điểm hóa sinh của đậu tương 1.1.1 Cây đậu tương 1.1.2 Đặc điểm hóa sinh đậu tương 1.2 Bệnh gỉ sắt tính kháng bệnh gỉ sắt đậu tương 1.2.1... giống đậu tương 61 3.3 Đánh giá đa dạng di truyền giống đậu tương phản ứng khác với bệnh gỉ sắt 64 3.3.1 Phân tí ch tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng thị... thị phân tử DNA 20 1.4 Các nghiên cứu bệnh gỉ sắt đậu tương 26 1.5 Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương 29 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 33 2.1 Vật liệu