1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐỖ BÍCH DUỆ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI TRÊN THỊT LỢN BÁN TẠI THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày nay, đời sống xã hội ngày nâng cao, chất lƣợng sống ngày cải thiện, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm trở thành vấn đề đƣợc quan tâm ngành, cấp toàn thể ngƣời tiêu dùng Thực phẩm phải đảm bảo tiêu chuẩn: tƣơi, sạch, giàu dinh dƣỡng an toàn cho ngƣời sử dụng Trong đó, thịt tƣơi loại thực phẩm thông dụng thực đơn hàng ngày gia đình Tuy nhiên, trình vận chuyển, tiêu thụ ngƣời thƣờng quan tâm tới lợi nhuận trƣớc mắt mà sẵn sàng bỏ qua quy chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP), nguồn thực phẩm tƣơi sống nói chung, nguồn thịt nói riêng bị ô nhiễm ngày lớn đe dọa sức khỏe ngƣời Thực phẩm ô nhiễm nhiều nguyên nhân, chủ yếu vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt ô nhiễm vi khuẩn Escherichia coli thực phẩm trở thành đề tài nghiên cứu nhiều tác giả năm gần E coli gây bệnh nhiều yếu tố khác nhƣ nhiễm trùng huyết, sinh tổng hợp độc tố gây ngộ độc thực phẩm (NĐTP), rối loạn tiêu hóa hấp thu Nếu bệnh xảy không đƣợc điều trị kịp thời dẫn đến tử vong Điều đáng ngại hơn, ngƣời ta lo ngại nguy biến chủng loài vi khuẩn Nếu không đƣợc kiểm soát xử lý kịp thời, gây ngộ độc hàng loạt nhƣ Đức số nƣớc Châu Âu thời gian vừa qua Với vị trí địa lý trung tâm vùng khu vực trung du miền núi phía bắc, thành phố Thái Nguyên có nhiều quan, xí nghiệp, nhà máy, công ty đặc biệt có nhiều trƣờng Đại học, Cao đẳng nằm địa bàn nên nhu cầu tiêu thụ thực phẩm thịt lợn lớn Mặt khác, việc giết mổ lợn bán thịt chủ yếu tƣ nhân thực hiện, phƣơng tiện vận chuyển, dụng cụ bán thịt chƣa đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y Việc kiểm tra vệ sinh thú y cán kiểm dịch gặp nhiều khó khăn, dừng lại mức độ kiểm tra cảm quan thịt đƣợc bày bán chợ Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Escherichia coli thịt lợn bán thành phố Thái Nguyên” Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá tình trạng nhiễm E coli thịt lợn tƣơi - Tìm hiểu số đặc điểm sinh học, hóa học đặc điểm di truyền phân tử số chủng E coli phân lập đƣợc, xác định gen gây ngộ độc thực phẩm, từ có biện pháp hạn chế, giảm thiểu thiệt hại cho ngƣời dân Nội dung nghiên cứu - Lấy mẫu phân lập vi khuẩn E coli gram thịt lợn tƣơi - Tìm hiểu đặc điểm sinh hóa, khả mẫn cảm kháng sinh, type huyết chủng vi khuẩn E coli phân lập đƣợc Tìm gen gây ngộ độc thực phẩm (VT1; VT2 ) kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR, polymerase chain reaction) - Nghiên cứu đặc điểm di truyền việc đọc trình tự gen mã hóa riboxom 16S + Nuôi cấy chủng vi khuẩn phân lập + Tách chiết DNA tổng số, nhân đoạn gen mã hóa riboxom 16S kỹ thuật PCR, thiết kế plasmid tái tổ hợp, tạo tế bào E coli DH 5α khả biến, biến nạp plasmid vào E coli DH 5α, tách tinh plasmid + Đọc trình tự đoạn gen mã hóa riboxom 16S Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỊT 1.1.1 Đặc tính chung thịt Thịt loại thực phẩm giàu dinh dƣỡng dễ tiêu hóa, cung cấp nhiều loại axit amin không thay thế, cần thiết cho hoạt động sống thể, giúp ngƣời phát triển tốt thể lực Thịt loại thực phẩm giàu khoáng chất, đặc biệt khoáng chất dễ hấp thu [23] Thịt tƣơi thịt chƣa bị biến chất trình tự phân hủy, chƣa có thay đổi cảm quan độc chất có hại 1.1.2 Thành phần hóa học thịt Thành phần hóa học thịt khác nhau, phụ thuộc vào yếu tố giống, loài, lứa tuổi, độ béo gầy điều kiện chăm sóc, nuôi dƣỡng Nhƣng nhìn chung thành phần hóa học thịt bao gồm: + Nƣớc : 50 - 75% + Protein : 14 - 21% + Lipit : 3,5 - 21,5 % + pH thịt tƣơi thông thƣờng mức - 6,5% Ngoài thành phần thớ thịt có khoáng chất, loại vitamin, loại men chất dinh dƣỡng khác cần thiết cho ngƣời Đánh giá cảm quan thịt tƣơi theo phƣơng pháp Nguyễn Vĩnh Phƣớc [13] trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y Trung ƣơng I - Cục thú y [19] đƣa số đánh giá cảm quan thông qua bảng 1.1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 1.1 Đánh giá cảm quan thịt Chỉ tiêu Trạng thái bên Vết cắt Thịt tƣơi Hơi khô, màu nhạt Hơi ƣớt, màu hồng Rắn chắc, đàn hồi cao, ấn ngón tay vào Độ đàn hồi thịt tạo vết lõm, nhấc tay không để lại vết Mỡ Gân Tuỷ Nƣớc luộc Thịt tƣơi, thịt ôi Khô, có ƣớt nhớt, màu sẫm Ƣớt nhớt, màu thẫm Hơi nhão, nhão, ấn ngón tay vào để lại vết nhẹ (thịt tƣơi), vết hằn sâu, không (thịt ôi) Màu sáng, độ rắn mùi vị tự nhiên Màu tối, độ rắn giảm, có vị thịt tƣơi, mùi lạ ôi Gân trong, bám chặt vào thành ống Kém trong, độ đàn hồi xƣơng Tuỷ trong, bám chặt vào thành ống Đục, co lại, không đầy ống xƣơng xƣơng Trong, mùi vị thơm ngon, mặt có Đục, mùi vị ôi, bề mặt giọt mỡ to có giọt mỡ nhỏ Theo phƣơng pháp sinh hóa học, thịt tƣơi đƣợc đánh giá phản ứng sinh hóa học dựa theo tiêu chuẩn nhƣ bảng 1.2 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 1.2 Tiêu chuẩn đánh giá thịt tƣơi phản ứng sinh hóa học Tiêu chuẩn Thịt tƣơi Thịt tƣơi Thịt ôi pH nƣớc thịt ngâm 5,4 - 6,4 6,5 - 6,7 > 6,7 Hàm lƣợng NH3 (mg) < 1,26 1,27 - 1,68 > 1,68 Phản ứng CuSO4 làm sa Nƣớc thịt Nƣớc thịt vẩn đục Nƣớc thịt đục có lắng protein đục có hạt cặn sánh nhƣ keo Nƣớc thịt ngâm, Nƣớc thịt ngâm, Phản ứng tìm peroxydaza (thử benzidin) lọc có màu xanh lọc mạ, sau phút lâu có màu chuyển màu nâu xanh mạ Nƣớc thịt ngâm, lọc không biến đổi màu sắc Nƣớc thịt ngâm, Nƣớc thịt ngâm, lọc có màu vàng lọc có màu vàng nhạt vỏ chanh Giấy lọc giữ Giấy lọc có màu Giấy lọc có màu nguyên màu nâu nhạt nâu sẫm đen Phản ứng Nestler tìm Nƣớc thịt ngâm, NH3 lọc không màu Phản ứng tìm H2S (dùng axetat chì) 1.1.3 Các nguyên nhân gây hƣ hỏng thịt * Quá trình tự phân giải thịt Trong mô bào có chứa loại enzym, chúng sản phẩm trình sống, giúp cho phản ứng hóa học mô bào diễn nhanh hay chậm [31] Thịt trình bảo quản bị biến chất hƣ hỏng Sau giết mổ, thịt chƣa bị biến chất Nhƣng nếu, thịt để lâu chƣa kịp tiêu thụ cất giữ dùng dần điều kiện không thích hợp bị biến chất enzyme có sẵn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn thịt vi sinh vật tạp nhiễm dẫn đến ôi, thiu, hỏng trạng thái cảm quan, hình thành độc chất có hại Những tƣợng hƣ hỏng thịt thƣờng gặp là: Thịt nhớt, thối rữa, lên men chua, có chấm màu bề mặt thịt, thịt mốc [10] * Vi khuẩn gây hƣ hỏng thịt Mặc dù nhiều biện pháp vệ sinh kỹ thuật chống nhiễm khuẩn đƣợc áp dụng vật trƣớc giết mổ trình giết mổ, nhƣng tƣợng nhiễm khuẩn vào thân thịt xảy [26] Vi khuẩn nhiễm vào thịt gồm có số loài vi khuẩn gây hƣ hỏng thịt nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời [46] - Một số vi khuẩn gây hư hỏng thịt tươi Dựa vào khả phân hủy thịt vi khuẩn ngƣời ta chia chúng theo nhóm [35] + Nhóm Proteolytic có men phân giải protein thành chất đơn giản cần thiết cho hoạt động sống chúng, đại diện vi khuẩn Pseudomonas + Nhóm vi khuẩn có khả lên men đƣờng phân hủy glucogen dự trữ thành rƣợu, axit + Nhóm vi khuẩn có enzym phân giải lipit phân hủy mỡ thành axit béo glycerol Dựa vào khả làm thay đổi đặc tính sinh học thịt ngƣời ta chia loại vi khuẩn gây hƣ hỏng theo nhóm sau [27]: + Nhóm vi khuẩn làm độ tƣơi thịt: gồm có vi khuẩn thuộc họ Alcaligenes, Chromobacteriaceae loài vi khuẩn Proteus vulgaris Pseudomonas fluorescens + Nhóm làm chua thịt: gồm có vi khuẩn thuộc họ Chromobacteriaceae, vi khuẩn Pseudomonadaceae + Nhóm làm nhớt mặt thịt: vi khuẩn Alcaligenes, Xanthomonas + Nhóm gây mùi khó ngửi thịt với điển hình Pseudomonas Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - Một số vi khuẩn gây hư hỏng thịt bảo quản lạnh Nhiều loài vi khuẩn không phát triển nhiệt độ thấp, nhƣng sống sót trình bảo quản lạnh Theo Bell Gill (1986) [28] tìm thấy số loài giống Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Lactobacillus, Brochothrix, Alteromonas thành viên họ Enterobacteriaceae thịt bảo quản lạnh Nói chung, vi khuẩn dạng sinh dƣỡng tăng lên suốt thời gian bảo quản lạnh [47] Một số vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời phát triển thịt bảo quản lạnh với tốc độ chậm Số lƣợng ban đầu, chủng loại vi khuẩn gây hƣ hại thịt tốc độ sinh trƣởng chúng định thời gian bảo quản thịt [40] Tuy nhiên thịt bảo quản lạnh có vi sinh vật ƣa lạnh nhƣ: Nhóm Pseudomonas, Achrmobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Aerobacterium số loại cầu khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas nhƣ Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluoresceus, Pseudomonas geniculata, có nấm men, nấm mốc phát triển Thịt có mùi đất xạ khuẩn mọc Thịt muối tồn vi sinh vật ƣa mặn làm hỏng thịt [10] 1.2 VI KHUẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 1.2.1 Ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm (NĐTP) trúng độc thức ăn xảy ăn phải thức ăn chứa chất độc Bệnh thƣờng xảy cách đột ngột, hàng loạt (nhƣng dịch), có triệu chứng bệnh cấp tính Biểu bệnh thƣờng nôn mửa, tiêu chảy (riêng trƣờng hợp nhiễm độc tố vi khuẩn độc thịt bị táo bón) triệu chứng khác đặc hiệu cho loại ngộ độc [1] 1.2.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Thực phẩm có nguồn gốc động vật thực vật nguồn thực phẩm thiết yếu ngƣời Việc lựa chọn thực phẩm cách chế biến thực phẩm phù hợp khoa học đem lại cho ngƣời nguồn dinh dƣỡng quan trọng đảm bảo sức khỏe chất Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn lƣợng dân số Tuy nhiên, việc đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng cho ngƣời nguồn thực phẩm chất lƣợng gây nguy hại đến sức khỏe ngƣời Ngộ độc thực phẩm xảy dùng phải thức ăn, thức uống nhiễm bẩn, bảo quản không cách bị nhiễm trùng, virus, ký sinh trùng, nấm mốc hay hóa chất độc hại Ở nƣớc ta năm gần ca NĐTP có chiều hƣớng gia tăng mà nguyên nhân nguồn thực phẩm hay nƣớc uống bị ô nhiễm Các thực phẩm có nguồn gốc động vật có xu hƣớng dễ bị nhiễm khuẩn Nhiễm độc thực phẩm chia làm hai loại: Loại 1, nhiễm độc hóa chất; loại 2, nhiễm độc vi sinh vật gây bệnh Hóa chất độc bao gồm hóa chất sử dụng công nghiệp nông nghiệp Trong sản xuất nông nghiệp nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật độc hại đƣợc sử dụng, đặc biệt nhóm clo hữu nhƣ diclo-diphenyl-tricloetan (DDT), dipteren, lindane, padane… Các hóa chất phần ngấm xuống mạch nƣớc ngầm, phân tán vào môi trƣờng không khí, tồn dƣ sản phẩm nông sản, động vật ăn phải sản phẩm này, tiếp đến ngƣời sử dụng thực phẩm động vật nhiễm hóa chất, rau nhiễm hóa chất, làm gia tăng bệnh rối loạn chuyển hóa, bệnh hiểm nghèo Ngộ độc thực phẩm gây thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật độc tố vi sinh vật tạo Vấn đề NĐTP mối lo ngại đƣợc quan tâm xử lí hầu hết quốc gia giới, chí quốc gia phát triển nhƣ Mỹ (Hoa Kỳ), Anh, Nhật Bản, Trung Quốc… ngoại lệ [1] 1.2.3 Một số vi khuẩn phân lập đƣợc từ thịt gây ngộ độc thực phẩm Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm không gây bệnh cho ngƣời sử dụng nhƣng trình trao đổi chất sản sinh yếu tố gây hại [14], [45] Một số vi sinh vật nhiễm thực phẩm gây ngộ độc, chia làm dạng: i) Ngộ độc thực phẩm xảy trƣờng hợp thức ăn nhiễm vi khuẩn tổng hợp ngoại độc tố nhƣ S aureus, C botulinum, B cereus… Các vi khuẩn sinh trƣởng phát triển thức ăn giải phóng lƣợng độc tố gây ngộ độc cấp tính cho ngƣời ăn thực phẩm bị nhiễm loại vi khuẩn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 ii) Ngộ độc thực phẩm gây số vi khuẩn nhƣ: Listeria, Salmonella, E coli, Shigella, Campylobacter nhiễm thực phẩm, xâm nhập vào thể chúng gây nên triệu chứng ngộ độc mà làm tổn thƣơng nghiêm trọng quan nội tạng * Tổng số vi khuẩn hiếu khí yếm khí tùy tiện Sự phát số lƣợng lớn vi khuẩn thịt, điều chứng tỏ việc giết mổ gia súc gia cầm sở với điều kiện vệ sinh Việc xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí thực phẩm đƣợc sử dụng nhƣ yếu tố đánh dấu (maker) điều kiện vệ sinh, nhiệt độ bảo quản trình sản xuất, vận chuyển thực phẩm Đây phƣơng pháp tốt để đánh giá sơ tình trạng vệ sinh thực phẩm [29] Số lƣợng vi khuẩn hiếu khí yếm khí tùy tiện thịt thay đổi theo thời gian điều kiện bảo quản Hệ vi khuẩn hiếu khí thịt đƣợc chia làm nhóm, dựa vào nhiệt độ thích hợp để chúng phát triển đƣợc Nhìn chung vi khuẩn gây hƣ hỏng thực phẩm phát triển đƣợc từ 12oC đến 42oC Tuy nhiên, số chủng đột biến phát triển khoảng nhiệt độ Trong bảo quản thực phẩm khoảng nhiệt độ vi khuẩn phát triển đƣợc gọi vùng nhiệt độ nguy hiểm * Coliforms Coliforms vi khuẩn hiếu khí kỵ khí không bắt buộc, lên men đƣờng lactose môi trƣờng canh thang lactose (màu mật bò xanh dƣơng) vòng 48 35oC Các Coliforms có nguồn gốc từ rác thải hữu thực vật động vật [36] Sự có mặt thành viên thuộc nhóm Coliforms thực phẩm phản ánh tình trạng vệ sinh thực phẩm, chúng khả có mặt yếu tố gây bệnh khác ẩn thực phẩm Một số nhà nghiên cứu cho mẫu thực phẩm nhiễm Coliforms với số lƣợng lớn khả có mặt vi khuẩn gây bệnh lớn Yếu tố điểm có liên quan tới tác nhân gây bệnh hay không Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... tài: Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Escherichia coli thịt lợn bán thành phố Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Mục tiêu nghiên cứu. .. xảy [26] Vi khuẩn nhiễm vào thịt gồm có số loài vi khuẩn gây hƣ hỏng thịt nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời [46] - Một số vi khuẩn gây hư hỏng thịt tươi Dựa vào khả phân hủy thịt vi khuẩn ngƣời... cho ngƣời dân Nội dung nghiên cứu - Lấy mẫu phân lập vi khuẩn E coli gram thịt lợn tƣơi - Tìm hiểu đặc điểm sinh hóa, khả mẫn cảm kháng sinh, type huyết chủng vi khuẩn E coli phân lập đƣợc Tìm