ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN MẠNH QUỲNH ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÒNG LÚA CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẶN (NaCl) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 CÂY LÚA 1.1.1 Nguồn gốc phân loại lúa 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Đặc tính sinh thái 1.1.4 Giá trị kinh tế 1.1.5 Tình hình sản xuất lúa giới Việt Nam 1.2 MẶN VÀ CƠ CHẾ CHỊU MẶN 1.2.1 Các kiểu đất mặn 1.2.2 Tác hại mặn 1.2.3 Các phản ứng thích nghi thực vật môi trường mặn 1.3 MỘT SỐ THÀNH TỰU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VÀ CHỌN DÒNG TẾ BÀO SOMA BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO 12 1.4 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) TRONG PHÂN TÍCH HỆ GEN CỦA CÂY TRỒNG 13 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .17 2.1 Nguyên liệu .17 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 17 2.1.2 Hóa chất thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp phân tích hoá sinh 18 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.2 Phương pháp phân tích sinh lí 21 2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử .23 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng 24 2.2.5 Phương pháp xử lý kết tính toán số liệu .24 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Đặc điểm nông học dòng lúa chọn lọc hệ R2, R3 có nguồn gốc từ mô sẹo qua xử lí chịu mặn .25 3.1.1.Đặc điểm nông học dòng lúa chọn lọc hệ R2 25 3.1.2.Đặc điểm nông học dòng chọn lọc hệ R3 .29 3.1.3 Nhận xét số đặc điểm nông học dòng chọn lọc 31 3.2 Phân tích hóa sinh dòng chọn lọc 31 3.2.1 Đánh giá khả chịu mặn giai đoạn hạt nảy mầm .32 3.2.1.1 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hàm lượng đường khử giai đoạn hạt nảy mầm 32 3.2.1.2 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hoạt độ α - amylase giai đoạn hạt nảy mầm 35 3.2.1.3 Mối tương quan hoạt độ  - amylase hàm lượng đường khử 37 3.2.1.4 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hàm lượng protein tan giai đoạn hạt nảy mầm 38 3.2.1.5 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hoạt độ protease giai đoạn hạt nảy mầm 40 3.2.1.6 Tương quan hoạt độ protease hàm lượng protein tan 42 3.2.1.7 Nhận xét khả chịu mặn dòng chọn lọc giai đoạn hạt nảy mầm 43 3.3 Đánh giá khả chịu mặn dòng chọn lọc giai đoạn mạ 43 3.3.1 Đánh giá khả chịu hạn thông qua xác định hàm lượng proline .43 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.2 Đánh giá khả chịu mặn dòng chọn lọc qua gây hạn nhân tạo xử lí NaCl 0,1M 46 3.3.3 Xác định số chịu mặn tương đối mức độ mạ .47 3.3.4 Nhận xét khả chịu mặn dòng chọn lọc giai đoạn mạ .48 3.4 Đánh giá thay đổi ADN hệ gen số dòng lúa chọn lọc qua xử lí chịu mặn .49 3.4.1 Kết tách chiết ADN tổng số 49 3.4.2 Phân tích đa hình ADN kỹ thuật RAPD 51 3.4.2.1 Số phân đoạn ADN xuất đa hình phân đoạn ADN nhân 51 3.4.2.2 Sự khác dòng chọn lọc so với giống gốc mức độ phân tử 59 3.4.3 Nhận xét thay đổi ADN hệ gen dòng lúa chọn lọc giống gốc 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .64 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Hạt dòng chọn lọc hệ R1 giống gốc 17 Bảng 2.2 Trình tự nucleotit 10 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.1 Đặc điểm nông học mức độ biến dị dòng lúa chọn lọc hệ R2 27 Bảng 3.2 Đặc điểm nông học dòng chọn lọc từ giống CR203 30 Bảng 3.3 Hàm lượng protein, đường khử hạt dòng chọn lọc giống gốc 32 Bảng 3.4 Hàm lượng đường khử dòng chọn lọc giai đoạn hạt nảy mầm xử lí dùng dịch NaCl 0,1M 33 Bảng 3.5 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hoạt độ α - amylase giai đoạn hạt nảy mầm 35 Bảng 3.6 Tương quan hoạt độ  - amylase hàm lượng đường khử giai đoạn hạt nảy mầm 37 Bảng 3.7 Hàm lượng protein tan giai đoạn hạt nảy mầm dòng chọn lọc xử lí NaCl 0,1M 38 Bảng 3.8 Ảnh hưởng NaCl 0,1 M đến hoạt độ protease giai đoạn hạt nảy mầm 41 Bảng 3.9 Tương quan hoạt độ protease hàm lượng protein tan giai đoạn hạt nảy mầm 43 Bảng 3.10 Hàm lượng proline dòng lúa chọn lọc xử lí NaCl 0,1M giai đoạn mạ 44 Bảng 3.11 Một số tiêu chịu ảnh hưởng mặn giai đoạn mạ 46 Bảng 3.12 Chỉ số chịu mặn tương đối dòng chọn lọc giai đoạn mạ 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.13 Độ tinh hàm lượng ADN dòng lúa chọn lọc 50 Bảng 3.14 Tổng số phân đoạn ADN nhân từ hệ gen dòng lúa chọn lọc phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 51 Bảng 3.15 Phân tích đa hình phân đoạn ADN nhân với 10 mồi ngẫu nhiên 52 Bảng 3.16 Hệ số sai khác di truyền dòng chọn lọc giống gốc 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 18 Hình 3.1 Hàm lượng đường khử dòng chọn lọc giai đoạn hạt nảy mầm xử lí dùng dịch NaCl 0,1M 34 Hình 3.2 Ảnh hưởng NaCl 0,1M đến hoạt độ α - amylase giai đoạn hạt nảy mầm 36 Hình 3.3 Hàm lượng protein tan giai đoạn hạt nảy mầm dòng chọn lọc xử lí NaCl 0,1M 39 Hình 3.4 Ảnh hưởng NaCl 0,1 M đến hoạt độ protease giai đoạn hạt nảy mầm 42 Hình 3.5 Hàm lượng proline dòng lúa chọn lọc xử lí NaCl 0,1M giai đoạn mạ 45 Hình 3.6 Khả chịu mặn dòng lúa chọn lọc 48 Hình 3.7 Kết điện di ADN tổng số tách từ dòng lúa chọn lọc 50 Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M1 53 Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M2 54 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M3 54 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M4 55 Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M6 55 Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M7 56 Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M8 57 Hình 3.15 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M10 57 Hình 3.16 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M11 58 Hình 3.17 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M14 58 Hình 18 Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền dòng chọn lọc giống gốc 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa gạo nguồn lương thực chủ yếu nửa dân số giới Ở Việt Nam, lúa nông nghiệp có vị trí quan trọng kinh tế quốc dân Theo số liệu thống kê năm 2008, nước ta có 7,4 triệu đất trồng lúa, sản lượng thóc đạt 38,6 triệu tấn, bình quân suất đạt 6,2- 6,3 tấn/ha Việt Nam hai nước xuất gạo hàng đầu giới [50] Cây lúa (Oryza sativa L.) loại trồng mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh [9] Nhiều yếu tố sinh thái bất lợi tác động lên trình sinh trưởng phát triển lúa nhiệt độ cực đoan, ánh sáng bất lợi, lượng mưa không phù hợp [7], [8] Đối với lúa nước, vùng ven biển nguyên nhân quan trọng làm giảm suất mặn Đứng trước diễn biến ngày nghiêm trọng biến đổi khí hậu, Việt Nam số nước chịu ảnh hưởng nước biển dâng, đặc biệt vùng đồng sông Hồng đồng sông Cửu Long Theo đánh giá ngân hàng giới, nước biển dâng 1m, Việt Nam có 10% dân số chịu ảnh hưởng trực tiếp làm tổn thất khoảng 10% GDP [16] Theo “Nghiên cứu điển hình phục vụ báo cáo phát triển người 2007-2008” UNDP, đồng sông Cửu Long có 1,77 triệu đất nhiễm mặn (chiếm 45% diện tích) Một số địa phương khác Nam Định Thanh Hoá diện tích nhiễm mặn 7600 [16] Lúa nước loại chịu mặn [3] Vì vậy, nghiên cứu khả chịu mặn tăng cường khả chịu NaCl giống lúa nhằm nâng cao ổn định sản lượng lúa điều kiện nhiễm mặn đòi hỏi thực tiễn sản suất nông nghiệp Trong năm gần đây, công nghệ sinh học phát triển đóng góp nhiều ứng dụng quan trọng công tác chọn tạo giống Bằng kỹ thuật chọn dòng biến dị soma kỹ thuật gen tạo trồng có khả chống chịu cao [13] Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật mở Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn hướng công tác cải tạo giống trồng góp phần làm phong phú thêm nguồn vật liệu khởi đầu công tác chọn giống [1], [12], [14], [15], [17] Từ nguồn nguyên liệu thực vật tạo nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô đến tạo thành dòng, giống đòi hỏi trải qua trình đánh giá, thử nghiệm đồng ruộng phòng thí nghiệm qua nhiều hệ Xuất phát từ sở trên, lựa chọn đề tài: “Đánh giá số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn (NaCl)” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tuyển chọn dòng lúa ưu việt đặc điểm nông học, chất lượng hạt khả chịu mặn - Xác định sai khác hệ gen dòng lúa chịu mặn NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1 Phân tích đặc điểm nông học dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn (NaCl) hệ R2, R3 3.2 Đánh giá chất lượng hạt thông qua phân tích số tiêu hoá sinh: protein, đường tan 3.3 Đánh giá khả chịu mặn (NaCl) số dòng chọn lọc hệ R3 - Đánh giá giai đoạn hạt nảy mầm thông qua xác định ảnh hưởng NaCl đến hàm lượng đường tan, hoạt độ  - amylase, hàm lượng protein tan hoạt độ protease - Đánh giá nhanh khả chịu mặn (NaCl) giống nghiên cứu giai đoạn mạ ba phương pháp gây mặn nhân tạo Xác định hàm lượng proline sau xử lý mặn mạ ba dung dịch NaCl 3.4 Xác định sai khác ADN genome số dòng lúa chịu mặn kỹ thuật RAPD Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY LÚA 1.1.1 Nguồn gốc phân loại lúa Cây lúa (Oryza Sativa L.) trồng có từ lâu đời, phân bố từ 30 vĩ Bắc đến 400 vĩ Nam gắn liền với lịch sử phát triển loài người Tổ tiên loài lúa lúa dại Oryza Fatua, Oryza Zaoffcinacis, Oryza Minuta [8] Khoảng năm 2800 – 2700 TCN, Trung Quốc có nghề trồng lúa [8] Vavilov (1926) cho nguồn gốc lúa trồng Ấn Độ [6] Nhiều tài liệu cho rằng, nguồn gốc lúa trồng miền nam Việt Nam Campuchia [7], [8] Có giả thuyết lại cho rằng, tổ tiên chi lúa Oryza loại hoang dại siêu lục địa Gondwana cách 130 triệu năm phát tán khắp châu lục qúa trình trôi dạt lục địa Khi phát có nhiều loài lúa dại thuộc nhóm Euoryza châu Phi, Chang (1976) cho nguồn gốc loài lúa trồng châu Phi Sampath Rao (1951) cho nôi nghề trồng lúa chân dãy Himalaya đổ xuống vùng đồng Bengale Assam, Thái Lan vùng có nhiều loại lúa hoang dại giống lúa trồng phong phú [8] Tuy chưa thống có nhiều tài liệu , di tích khảo cổ học chứng minh nguồn gốc lúa ở vùng đầm lầy Đông Nam Á , thuộc nhiều quốc gia khác từ vùng nhiệt đới nóng ẩm lúa lan rộng khắp nơi [7], [8], [9] Theo hệ thống phân loại học thực vật, lúa thuộc ngành thực vật có hoa (Angios Permes), lớp mầm (Mono Cotyledones), hoà thảo (Graminales), họ hoà thảo (Graminae), chi lúa (Oryza) loài Oryza Sativa [8] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... phát từ sở trên, lựa chọn đề tài: Đánh giá số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn (NaCl) MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tuyển chọn dòng lúa ưu việt đặc điểm nông học, chất lượng hạt khả chịu mặn. .. hệ gen dòng lúa chịu mặn NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1 Phân tích đặc điểm nông học dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn (NaCl) hệ R2, R3 3.2 Đánh giá chất lượng hạt thông qua phân tích số tiêu... chịu mặn tương đối mức độ mạ .47 3.3.4 Nhận xét khả chịu mặn dòng chọn lọc giai đoạn mạ .48 3.4 Đánh giá thay đổi ADN hệ gen số dòng lúa chọn lọc qua xử lí chịu mặn