ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - NGUYỄN HIỆP HÒA NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill] LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - NGUYỄN HIỆP HÒA NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU Thái Nguyên - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Vớp lòng biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Hoàng Mậu, người hết lòng giúp đỡ động viên trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô môn Di truyền học – trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, thầy cô bạn Viện khoa học sống – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiên cho học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn bạn, đồng nghiệp người thân gia đình giúp đỡ động viên hoàn thành luận văn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các kết quả, số liệu nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả Nguyễn Hiệp Hòa Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC trang Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOÁ SINH HẠT ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Sơ lƣợc đậu tƣơng 1.1.2 Thành phần hoá sinh hạt đậu tƣơng 1.1.2.1 Protein dự trữ thành phần axit amin 1.1.2.2 Lipit, vitamin số chất khác 1.2 ĐẶC TÍNH CHỊUHẠN CỦA THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.2.1 Cơ sở liên quan đến tính chịu hạn thực vật 1.2.2 Cơ chế sinh lý học di truyền học tƣợng chống chịu hạn thực vật 1.2.3 Nghiên cứu khả phản ứng đậu tƣơng hạn 1.2.3.1 Sự phản ứng đậu tƣơng hạn giai đoạn hạt nảy mầm 1.2.3.2 Sự phản ứng đậu tƣơng hạn giai đoạn non 1.3 NGHIÊN CỨU NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB 1.3.1 Gen DREB 1.3.2 Nghiên cứu DREB5 phƣơng pháp RT-PCR Chƣơng 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Vật liệu thực vật 2.1.2 Các hoá chất thiết bị 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phƣơng pháp sinh lý 2.2.1.1 Đánh giá khả chịu hạn giai đoạn non phƣơng pháp gây hạn nhân tạo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 7 10 10 10 12 12 13 13 14 16 17 http://www.lrc-tnu.edu.vn 19 22 23 23 26 28 28 28 28 29 29 29 2.2.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số 2.2.2.2 Kỹ thuật RT-PCR 2.2.2.3 Phƣơng pháp tinh sản phẩm RT-PCR 2.2.2.4 Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng 2.2.2.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 2.2.2.6 Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR) 2.2.2.7 Tách chiết plasmid 2.2.2.8 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotit 2.3.1 Phƣơng pháp xử lí số liệu 2.3.1.1 Phƣơng pháp thống kê chƣơng trình Excel 2.3.1.2 Phƣơng pháp xử lý trình tự gen Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ PHÂN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, KÍCH THƢỚC, KHỐI LƢỢNG 3.1.1 Đặc điểm hình thái, kích thƣớc, khối lƣợng giống đậu tƣơng 3.1.2 Tỷ lệ thiệt hại 3.1.3 Chỉ số chịu hạn tƣơng đối 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN DREB5 TỪ ĐẬU TƢƠNG 3.2.1 Tách chiết RNA từ mầm giống 3.2.2 Kết RT-PCR tạo DNA 3.2.3 Kết dòng hóa sản phẩm gen DREB5 vector tách dòng 3.2.4 Kết giải trình tự gen mã hóa DREB5 3.2.5 So sánh trình tự nucleotit DREB5 Xanh tiên đài Việt Nam DREB5 EF 583447 ngân hành gen có nguồn gốc từ Trung Quốc phần mềm Bioedit KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 31 30 32 34 35 37 37 37 38 38 38 39 40 40 40 42 43 46 46 47 48 49 53 57 57 67 58 59 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Ribonucleic acid cDNA : Complementary DNA LEA : Late embryogenesis abundant MGPT : Môi giới phân tử PCR : Polymerase chain reaction – Phản ứng chuỗi polimerase RT-PCR : Reverse-transcription PCR – PCR ngƣợc sHSP : Small heat shock protein – protein sốc nhiệt nhỏ từ 10-30kDa bp : Cặp bazơ dNTP : Nucleotitde EDTA : Ethylendiamin tetraacetic acid IPTG : Isopropyl – β – D – thiogalactopyranoside LB : Laruia Bertani TAE : Tris – Acetate – EDTA X – gal : 5-Bromo-chloro-3-indolyl– β – D –galactoside Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG trang Bảng 2.1 Danh sách giống đậu tƣơng nghiên cứu 28 Bảng 2.2: Thành phần hóa chất phản ứng RT-PCR 26 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 33 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng chu trình nhiệt PCR 34 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pCR®2.1TOPO®…………………………………………………………………… 35 Bảng 3.1 Mầu sắc, khối lƣợng, kích thƣớc hạt đậu tƣơng nghiên cứu 41 Bảng 3.2 Tỷ lệ thiệt hại giống đậu tƣơng giai đoạn non (%) 42 Bảng 3.3 Chỉ số chịu hạn tƣơng đối giống đậu tƣơng 45 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH trang Hình 1.1: Cơ chế biểu DREB1A lúa gặp hạn hán 25 Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp cDNA 26 Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo vector pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen) 36 Hình 3.1 Hình dạng hạt đậu tƣơng nghiên cứu 40 Hình 3.2 Đậu tƣơng trƣớc xử lí hạn 43 Hình 3.3 Đậu tƣơng sau xử lí hạn ngày 44 Hình 3.4 Đậu tƣơng sau xử lí hạn 15 ngày 44 Hình 3.5 Ảnh điện di RNA tổng số gel agarose 1% 46 Hình 3.6 Ảnh điện di DNA sản phẩm RT-PCR 47 Hình 3.7: Đĩa nuôi cấy xuất khuẩn lạc trắng khuẩn lạc xanh 48 Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm tách plasmit cắt Hind III 49 Hình 3.9 Hình ảnh Sequence chuỗi DREB5 51 Hình 3.10 Trình tự gen DREB5 đậu tƣơng Xanh Tiên Đài – Việt Nam 52 Hình 3.11 So sánh trình tự gen DREB5 đậu tƣơng Xanh tiên đài Việt nam EF 583447 có ngân hàng gen quốc tế từ giống đậu tƣơng Trung quốc 55 Hình 3.12 So sánh trình tự axit amin DREB5 giống đậu tƣơng Xanh Tiên Đài Việt Nam giống đậu tƣơng có mã số EF 583447.1 Trung Quốc có ngân hàng gen quốc tế 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tƣơng có tên khoa học (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), lƣơng thực có tầm quan trọng bậc giới nhƣ Việt Nam Để có vị trí nhƣ vậy, nhờ đậu tƣơng có đặc tính ƣu việt giống đậu khác là: Hàm lƣợng protein lipit hạt cao: protein từ 32% đến 40%, lipit từ 12% đến 25%, gluxit (10-15%), chứa nhiều loại vitamin Các sản phẩm quen thuộc đậu tƣơng nhƣ đậu phụ, tƣơng, dầu ăn có vai trò quan trọng đời sống hàng ngày ngƣời Gần nhà khoa học nghiên cứu phát đậu tƣơng có vai trò chữa điều trị bệnh nam y nhƣ ung thƣ, tim mạch Đậu tƣơng giải phần vấn đề nóng bỏng giới lƣợng từ sản phẩm Ngoài đậu tƣơng họ đậu nên có tác dụng cải tạo đất thông qua việc cố định đạm nốt sần rễ, góp phần làm giảm lƣợng phân hóa học bón xuống đất, nguyên nhân gây thoái hóa đất Trên giới đậu tƣơng đƣợc ứng dụng sản xuất quy mô lớn phát triển mạnh mẽ nƣớc Nam Mỹ nhƣ Brazil, Argentina, Canada nhƣng lớn phải kể đến Mỹ gần Trung Quốc Hàng năm họ sản xuất đƣa thị trƣờng giới hàng triệu tấn/năm, điều góp phần giải vấn đề đƣợc coi nóng giới nhƣ lƣợng, ô nhiễm Ở Việt Nam, nƣớc trồng đậu tƣơng lâu đời nhƣng sản lƣợng hàng năm thấp ngành sản xuất đậu tƣơng nƣớc ta mức thấp so với giới Nguyên nhân vấn đề sử dụng giống Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... NGUYỄN HIỆP HÒA NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70... TÍNH CHỊUHẠN CỦA THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.2.1 Cơ sở liên quan đến tính chịu hạn thực vật 1.2.2 Cơ chế sinh lý học di truyền học tƣợng chống chịu hạn thực vật 1.2.3 Nghiên cứu. .. dòng hóa sản phẩm gen DREB5 vector tách dòng 3.2.4 Kết giải trình tự gen mã hóa DREB5 3.2.5 So sánh trình tự nucleotit DREB5 Xanh tiên đài Việt Nam DREB5 EF 583447 ngân hành gen