ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––– NGUYỄN THỊ HẢI NGHIÊN CỨU TÍNH NHẠY CẢM KHÁNG SINH CỦA TRỰC KHUẨN MỦ XANH (PSEUDOMONAS AERUGINOSA) Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.BS LƯU THỊ KIM THANH THÁI NGUYÊN - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Xã hội phát triển nhu cầu chăm sóc bảo vệ sức khoẻ người ngày cao; có sức khoẻ người làm nhiều cải vật chất, nâng cao chất lượng sống Vì việc tìm hiểu, nghiên cứu tác nhân gây bệnh cách chữa trị cho người việc làm thiết thực có ý nghĩa quan trọng, góp phần vào phát triển chung nhân loại Tồn xung quanh có biết tác nhân gây bệnh mà mắt thường không nhận biết được, có vi sinh vật Khi thể suy yếu, sức đề kháng giảm, bị công Hiện nay, nhờ phát triển mạnh mẽ khoa học y học, người ta phân lập, phát nhiều loại vi khuẩn có khả gây bệnh; đặc biệt loại vi khuẩn gây nhiễm trùng hội Trực khuẩn mủ xanh (tên khoa học Pseudomonas aeruginosa) - tác nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện Trực khuẩn mủ xanh trực khuẩn Gram âm, chúng phân bố rộng rãi môi trường ngoại cảnh đất, nước, không khí, môi trường ẩm ướt chúng có nhiều hội xâm nhập gây bệnh Nhiễm trùng Trực khuẩn mủ xanh gây điển hình nhiễm trùng da (nhiễm trùng vết thương, vết bỏng…), nhiễm trùng đường hô hấp (viêm phổi, viêm phế quản…), nhiễm trùng đường tiểu nặng gây nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào quan thiết yếu thể phổi, đường tiết niệu, thận, gây hậu chết người vi khuẩn phát triển tốt bề mặt bên thể Trực khuẩn mủ xanh loại vi khuẩn có khả kháng lại nhiều loại kháng sinh, việc sử dụng kháng sinh không cách cộng đồng chưa hợp lý bệnh viện đưa tới mức độ đề kháng kháng sinh vi khuẩn nói chung Trực khuẩn mủ xanh nói riêng ngày tăng Sử dụng kháng sinh an toàn hợp lý sở hiểu biết chế tác dụng kháng sinh đặc tính vi khuẩn mức độ nhạy cảm với kháng sinh chúng đóng vai trò góp phần quan trọng việc điều trị bệnh cho bệnh nhân Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Trước yêu cầu thực tiễn, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính nhạy cảm kháng sinh Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)” nhằm mục tiêu nghiên cứu sau: Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tỷ lệ nhiễm trùng Trực khuẩn mủ xanh bệnh nhân tỉ lệ ô nhiễm Trực khuẩn mủ xanh môi trường bệnh viện - Định loại Trực khuẩn mủ xanh - Xác định mức độ đơn kháng đa kháng kháng sinh Trực khuẩn mủ xanh Nội dung nghiên cứu - Phân lập P.aeruginosa từ số bệnh phẩm (mủ vết thương, dịch mũi họng, nước tiểu), từ môi trường (nước, không khí, bề mặt dụng cụ y tế sử dụng) bệnh viện - Nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh P.aeruginosa dựa kết kháng sinh đồ chủng P.aeruginosa phân lập Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những nghiên cứu Pseudomonas aeruginosa 1.1.1 Lược sử nghiên cứu P.aeruginosa Năm 1872, P.aeruginosa Schroeter mô tả lần với tên gọi Bacterium aeruginosa [8] Ngay từ trước phân lập, có nhiều nhận xét cho số trường hợp vết thương sinh loại mủ đặc biệt có màu xanh màu rỉ đồng Hiện tượng giải thích theo nhiều ý kiến khác nhau, lời giải thích thỏa đáng người ta phân lập vi khuẩn từ ổ mủ khiết Năm 1882, nhà khoa học nghiên cứu Bacterium aeruginosa dược sĩ Carle Gessard Ông phân lập vi khuẩn mủ vết thương kết nghiên cứu tìm thấy đặc trưng Bacterium aeruginosa sinh sắc tố có màu xanh, tan nước Từ người ta gọi vi khuẩn trực khuẩn mủ xanh [32] Năm 1900, Migula nghiên cứu phân loại vi khuẩn vào chi Pseudomonas; từ vi khuẩn mang tên P.aeruginosa [8] Năm 2000, nhóm nhà khoa học đại học Washington khoa sinh trường đại học California, San Diego nghiên cứu giải trình tự genome P.aeruginosa PA01 [33] Năm năm sau đó, trình tự genome PA14 tìm nhà khoa học thuộc trường Đại học Y Harvard [33] Trong năm gần đây, P.aeruginosa nguyên gây bệnh phổ biến kháng lại hầu hết kháng sinh dùng Vì vậy, thu hút nhiều đề tài nghiên cứu nhà khoa học y bác sĩ nước Nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết bỏng P.aeruginosa gây Viện Bỏng Quốc gia (6/1996 - 12/1998) cho thấy P.aeruginosa vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết bỏng hàng đầu (chiếm khoảng 66,7%) [10] Năm 2002, Chu Anh Tuấn, Nguyễn Văn Huệ, Lê Đức Mẫn nghiên cứu nguyên gây nhiễm khuẩn huyết yếu tố bệnh lý liên quan Viện Bỏng Quốc Gia cho thấy P.aeruginosa nguyên gây nhiễm hàng đầu (74,3%) [24] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Năm 2003, theo kết giám sát Bộ y tế vi khuẩn gây bệnh thường gặp Việt Nam P.aeruginosa vi khuẩn đứng đầu số vi khuẩn chiếm tỷ lệ 22,3% [11] Hoàng Kim Tuyến cộng nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh phân lập bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005) chứng minh P.aeruginosa nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi bệnh viện với tỷ lệ kháng thuốc cao (>60%) [25] Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện (bộ môn vi sinh - Học viện quân y) nghiên cứu chế tạo huyết kháng P.aeruginosa đa giá, tinh chế đánh giá hiệu điều trị chỗ chế phẩm động vật bệnh nhân bỏng [12] Theo nguồn tin đây, loại vaccine đường uống bảo vệ thể người kháng lại P.aeruginosa mang tên Pseudostat - công bố nhà khoa học Anh Úc vào tháng 6/2006 Đây loại vaccine sử dụng P.aeruginosa tinh chế bất hoạt [26] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác nước giới đánh giá tình trạng nhiễm trùng mức độ kháng thuốc loài vi khuẩn 1.1.2 Đặc điểm sinh vật học P.aeruginosa 1.1.2.1 Hình thái, cấu tạo Là trực khuẩn gram âm, hình que, thẳng cong không xoắn, hai đầu tròn, chiều dài - 1,5μm, rộng 0,5 - 1μm, đứng hay thành đôi kết hợp thành chuỗi ngắn Trực khuẩn mủ xanh không sinh bào tử, có khả di động nhờ tiêm mao đơn cực [32] Hình 1.1: P.aeruginosa soi kính hiển vi quang học Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.2.2 Cấu trúc tế bào  Vỏ polysaccaride: P aeruginosa tiết chất nhầy có cấu tạo polysaccharide gồm nhiều tiểu phần mannuronic acid glucuronic acid hay gọi alginate Các dạng alginate kết hợp với tạo thành dạng cấu trúc biofilm giúp bảo vệ che chở vi khuẩn tồn môi trường tự nhiên tránh hệ miễn dịch thể vật chủ [34]  Màng sinh chất: Hầu hết chủng P.aeruginosa có khả tổng hợp loại protein bề mặt màng sinh chất (pr F) Protein F vận chuyển có chọn lọc chất qua lại màng giới hạn khoảng 500Da Vì vậy, làm giảm tính thấm màng, ngăn không cho chất có hại vào bên tế bào giúp cho P.aeruginosa có khả đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh [30]  Tiên mao: P.aeruginosa có tiên mao cực, tiên mao giúp cho vi khuẩn di động Về cấu tạo hoá học, tiên mao cấu tạo protein gọi Flagellin Các Flagellin mang tính chất kháng nguyên gọi kháng nguyên lông H  Tiêm mao: - Là sợi lông mảnh, dài khoảng 6nm, mọc quanh bề mặt tế bào Vai trò: Giúp cho vi khuẩn bám vào môi trường lỏng hay bề mặt biểu mô tế bào vật chủ trình lây nhiễm  Nhân: Vật chất di truyền P.aeruginosa phân tử DNA trần, dạng vòng tồn nguyên sinh chất Kích thước DNA từ 5,2 - triệu cặp base chứa khoảng 65% (Guanine + Cytosine) Ngoài ra, P.aeruginosa có chứa vật chất di truyền nhân plasmid Các plasmid chứa đoạn gen TEM, OXA, PSE mã hóa sinh enzyme betalactamase làm phá huỷ vòng betalactam chất kháng sinh dẫn tới P.aeruginosa kháng lại với hầu hết kháng sinh thuộc nhóm Do mà khó khăn việc lựa chọn thuốc điều trị nhiễm khuẩn P.aeruginosa gây [35] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.2.3 Phân bố Trực khuẩn mủ xanh tìm thấy nhiều nơi môi trường sống như: đất, nước, bể bơi, hồ tắm nước nóng…nhưng phổ biến nơi ẩm thấp Ở người, chúng sống vùng da ẩm nách, háng số sống ruột Ngoài ra, vi khuẩn phát sống bám bên thực vật, động vật, kể bệnh viện [28] Ít có nhiễm trùng P.aeruginosa người khỏe mạnh Chúng nguyên quan trọng nhiễm khuẩn bệnh nhân bị bệnh nặng bệnh tăng bạch cầu, u xơ bàng quang bệnh nhân có bỏng rộng Trong điều kiện ướt, nước thêm yếu tố giàu chất khoáng, giàu dinh dưỡng thuận lợi cho tồn phát triển trực khuẩn P.aeruginosa (như dụng cụ làm ẩm oxy, ống hút, lavabo rửa tay, nước lưu cữu…) Vi khuẩn chứa hạt khí dung hít vào thể tránh chế bảo vệ bình thường đường hô hấp để gây nhiễm khuẩn Có nhiễm khuẩn P.aeruginosa sinh trưởng thuốc dùng cho điều trị Thậm chí vi khuẩn tồn số chất tẩy uế Bồn dụng cụ làm thông khí ô nhiễm nặng nguồn gây nhiễm môt trường Tuy nhiên, nguy bị nhiễm khuẩn P.aeruginosa từ phơi nhiễm, tiếp xúc phận mẫn cảm với dụng cụ, phương tiện… ô nhiễm vi khuẩn [6] Ở bênh viện, trực khuẩn mủ xanh thường tìm thấy đầu ống thông, máy khí dung, máy hô hấp nhân tạo, máy hút ẩm, bình chứa nước, chí số dung dịch sát khuẩn dùng để rửa vết thương 1.1.2.4 Đặc điểm nuôi cấy Trực khuẩn mủ xanh hiếu khí, mọc dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường thạch dinh dưỡng, thạch máu, canh thang thích hợp môi trường SS Nhiệt độ thích hợp từ 30 - 370C, PH = 4,5 - 9,0; tối ưu 370C, pH từ 7,2 - 7,5 [1] Trên môi trường lỏng làm đục đều, bề mặt có váng Trên môi trường đặc có hai loại khuẩn lạc: Khuẩn lạc S (tròn mặt nhẵn, trung tâm lồi) Khuẩn lạc R (nhỏ, xù xì nhầy, lồi) (hình 1.2 phụ lục ảnh) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Tính chất đặc trưng trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố (hình 1.3 phụ lục ảnh) chất thơm Trên môi trường nuôi cấy có pepton, tiết loại sắc tố sau: + Pyocyanin: Là loại sắc tố phenazin có màu xanh lơ, tan nước chlorofoc, khuyếch tán môi trường nuôi cấy làm cho môi trường khuẩn lạc có màu xanh Sắc tố sinh thuận lợi môi trường tiếp xúc nhiều với không khí Chỉ có trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố pyocyanin Đây đặc điểm quan trọng để phân biệt P.aeruginosa với vi khuẩn khác + Pyoverdin: Là loại sắc tố huỳnh quang, phát màu xanh chiếu tia cực tím có bước sóng 400nm, tan nước không tan chlorofoc Ngoài trực khuẩn mủ xanh có số loài Psedomonas tạo sắc tố + Pyorubrin: Sắc tố màu hồng nhạt, 1% trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố + Pyomelanin: Sắc tố màu nâu đen, 1-2% số chủng trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố Pyomelanin Có khoảng 5-10% số chủng trực khuẩn mủ xanh không sinh sắc tố 1.1.3 Một số tính chất sinh hóa - Hiếu khí tuyệt đối, oxidase (+), lên men đường glucoza, không lên men đường lactose, xitrat simmons (+), mannit (+), idol (-), H2S (-), LDC (-), ODC (-), ADH (-) 1.1.4 Sức đề kháng Trực khuẩn mủ xanh có sức đề kháng cao với nhiều yếu tố ngoại cảnh, chúng tồn số chất tẩy uế Trong số vi khuẩn, Trực khuẩn mủ xanh có sức kháng lại mạnh với thuốc kháng sinh Mức độ kháng thuốc cấu trúc lỗ porin màng làm hạn chế thuốc kháng sinh vào khoảng trống màng bào tương so với vi khuẩn Gram âm khác[6] 1.1.5 Cấu trúc kháng nguyên Vi khuẩn có kháng nguyên H kháng nguyên O chịu nhiệt - Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lông vi khuẩn Kháng nguyên có đặc điểm: Không chịu nhiệt, bị cồn 50% men tiêu protein phá hủy, chịu tác động focmol 0,5% Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân, có đến 16 loại dựa vào kháng nguyên O để phân chia P.aeruginosa thành 16 typ huyết ký hiệu từ P1 đến P16 Kháng nguyên O có đặc điểm: Chịu nhiệt, độc, kháng cồn, bị phá hủy focmon 0,5% 1.1.6 Độc tố Trong trình xâm nhập gây bệnh P.aeruginosa tiết số ngoại độc tố sau: [31] + Exoenzyme S: Chủ yếu sinh vi khuẩn có mặt mô bỏng, độc tố tác động lên tế bào bạch cầu trung tính gây độc cho tế bào vật chủ + Exotoxin A: Phần lớn P.aeruginosa sinh độc tố này, độc tố A không bền nhiệt, chúng có vai trò làm kìm hãm tổng hợp protein gây chết tế bào - Heamolysin: P.aeruginosa sinh heamolysins phospholipit C rhamnolipit, chúng có vai trò phân hủy lecithin lipit tạo lỗ thủng màng tế bào làm tăng khả xâm nhiễm vi khuẩn vào tế bào vật chủ Ngoài ra, Paeruginosa tiết số enzym ngoại bào có vai trò tính độc vi khuẩn trình xâm nhiễm Elastase Alkaline protease Các protein enzyme phá hủy phân tử protein vật chủ cách đặc hiệu gây nên đặc tính lâm sàng riêng bệnh + Các elastase (LasB elastase, LasA elastase): Phân cắt protein tế bào nhân chuẩn collagen, elatin hủy hoại cấu trúc protein tế bào Đồng thời phá vỡ hệ thống miễn dịch đặc hiệu thể (IgG, IgA, bổ thể), phân tử ngoại bào làm cho nhiễm trùng lan tỏa đến khu vực xa với biểu lâm sàng viêm màng keratin, hoại tử tổ chức bỏng tạo xơ nang Ngoài ra, Elastase dung giải fibronectin giúp cho vi khuẩn dễ dàng bám vào màng nhầy phổi Elastase phá vỡ biểu mô cản trở chức lông mao bên đường hô hấp [29] + Alkalinne protease: Can thiệp vào hình thành fibrin phân giải fibrin Đồng thời, elastase alkaline protease phân hủy chất giác mạc cấu trúc bảo vệ khác cấu tạo nên fibrin elastin Hai enzym cho gây bất hoạt hai yếu tố quan trọng hệ miễn dịch interferon gamma (IFN) TNF (Tumor Necrosis Factor) [32] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.7 Khả gây bệnh P.aeruginosa Mặc dù P.aeruginosa vi khuẩn gây bệnh hội vi khuẩn có độc lực đặc biệt Khi tuyến phòng thủ (hàng rào bảo vệ không đặc hiệu da, niêm mạc) bị phá vỡ (như bị vết thương) vi khuẩn đưa vào thể tắt qua hàng rào (như theo dụng cụ nội soi ống thông khí quản…) gây nhiễm khuẩn Đầu tiên vi khuẩn bám dính vào bề mặt tế bào biểu mô giai đoạn cần đến vai trò pili polisaccharide ngoại bào Các chủng nhầy phân lập từ bệnh nhân bị xơ phế nang tạo polisaccharide chứa nhiều vi khuẩn làm tăng kết dính vi khuẩn với biểu mô đường hô hấp giúp chúng kháng lại thực bào Sau xâm nhập, bảo vệ dựa vào thực bào vỏ nhầy polisaccharide có đủ khả đủ thời gian để sản xuất collagenase, elastase, pyocyanin sản phẩm khác để làm lan truyền phá hủy tổ chức cục Ngoại độc tố A nhân tố góp phần quan trọng gây tổn thương tổ chức tác dụng làm lan tỏa nhiễm khuẩn Nghiên cứu in vitro gần cho thấy sắc tố pyocyanin ức chế sản sinh superoxide bạch cầu đa nhân Có thể nhân tố quan trọng làm thuận lợi cho việc hình thành, lan tỏa kéo dài nhiễm khuẩn.[6] Nhiễm trùng thường xảy người mà chế bảo vệ bị tổn thương sử dụng corticoit hay kháng sinh dài ngày, bỏng nặng tiêm tĩnh mạch ma túy…Vị trí nhiễm trùng thông thường đường tiểu vết thương hở (nhất vết bỏng) Tại chỗ xâm nhiễm chúng gây viêm có mủ màu xanh, thể suy giảm sức đề kháng chúng xâm nhập vào sâu bên thể gây viêm phủ tạng nhiễm trùng nung mủ áp xe phần khác thể người Những trường hợp viêm màng tim, viêm phổi, viêm màng não xảy gây bệnh toàn thân nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn trẻ sinh thường gây bệnh trầm trọng Nhiễm khuẩn huyết thường gây chết thể suy nhược [29] P.aeruginosa tác nhân gây viêm tai ngoài, thường người hay bơi Loài vi khuẩn xâm nhập vào mắt (qua chấn thương đưa thuốc bị nhiễm khuẩn vào) gây viêm màng kết mạc mắt, viêm giác mạc mắt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... đề tài: Nghiên cứu tính nhạy cảm kháng sinh Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) nhằm mục tiêu nghiên cứu sau: Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tỷ lệ nhiễm trùng Trực khuẩn mủ xanh bệnh... nhân tỉ lệ ô nhiễm Trực khuẩn mủ xanh môi trường bệnh viện - Định loại Trực khuẩn mủ xanh - Xác định mức độ đơn kháng đa kháng kháng sinh Trực khuẩn mủ xanh Nội dung nghiên cứu - Phân lập P.aeruginosa... đề kháng Trực khuẩn mủ xanh có sức đề kháng cao với nhiều yếu tố ngoại cảnh, chúng tồn số chất tẩy uế Trong số vi khuẩn, Trực khuẩn mủ xanh có sức kháng lại mạnh với thuốc kháng sinh Mức độ kháng