LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập hoàn thành luận văn này, nhận hướng dẫn, giúp đỡ quý báu thầy cô, anh chị, em bạn Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới : Ban Lãnh Đạo, Phòng sau đại học, Bộ môn – Công nghệ sinh học – Viện đại học Mở Hà Nội, khoa Vi Sinh - Bệnh viện Việt Đức, Bệnh viện Đa Khoa Đức Giang TS Trịnh Thị Thu Hằng Viện đại học Mở Hà nội, cô trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt hoàn thành luận văn PGS TS Trương Quốc Phong – Trưởng phòng Thí nghiệm Proteomics– Trung tâm nghiên cứu phát triển CNSH,Viện Công Nghệ sinh học, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội, thầy dậy bảo, giúp đỡ nhiều để hoàn thành luận văn Trưởng khoa Ths.Nguyễn Thị Vân toàn thể anh chị em khoa Vi Sinh Bệnh viện Việt Đức Bệnh viện Đức Giang Các anh chị tạo điều kiện tốt cho trình làm việc, học tập thu thập số liệu để hoàn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn GS, PGS, TS hội đồng chấm luận văn cho nhiều ý kiến xác đáng quý báu để hoàn thành luận văn Cuối cho gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè cạnh tôi, giúp đỡ động viên trình thực hoàn thành luận văn Hà nội, Ngày… tháng… năm 2016 Nguyễn Thị Thủy MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẲT ADN Acid deoxyribonucleic CLSI .8 Clinical & Laboratory Standards Institute .8 Viện chuẩn thức Hoa Kỳ lâm sàng xét nghiệm .8 MALDI-TOF MS .8 Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry MIC .8 The minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu rARN .8 Ribosomal Acid ribonucleic ARN Riboxom PCR .8 Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase VKKK .8 Vi khuẩn kỵ khí TZP Piperacillin tazobactam CHL .8 Cloramphenicol DOX .8 Doxycyclin .8 IPM .8 Imipenem .8 MTR Metronidazole bfr Bacteroides fragilis .8 gm+ .8 Gram positive bacteria cpe Clostridium perfringens pro Propionibacterium acnes pin Prevotella intermedia gmo Gemella morbillorum bur Bacteroides ureolyticus pmg Finegoldia magna pol Prevotella oralis ame .8 Actinomyces meyeri .8 clo Clostridium sp .8 mib .8 Microbacterium sp .8 DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH 10 ĐẶT VẤN ĐỀ 10 CHƯƠNG TỔNG QUAN 12 1.1 Lịch sử phát triển ngành vi khuẩn học kị khí 12 1.2 Đặc điểm chung vi khuẩn kị khí .13 1.2.1 Khái niệm vi khuẩn kị khí 13 1.2.2 Phân loại vi khuẩn kị khí theo mức độ nhạy cảm với oxy 14 1.2.3 Vị trí tồn vi khuẩn kị khí 14 1.2.4 Một số đặc điểm vi khuẩn kị khí gây bệnh ở người 16 1.3 Tình hình nhiễm khuẩn vi khuẩn kị khí ở người 17 1.4 Một số bệnh cảnh vi khuẩn kị khí gây nên ở người 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 Là vi sinh vật kị khí phân lập mẫu bệnh phẩm dịch (dịch mật, dịch ổ bụng, dịch não tủy, ), mủ loại, phân, máu, thu thập bệnh nhân nằm viện bệnh viện: Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức, Bệnh viện Đa khoa Đức Giang từ tháng 01 đến tháng 07/2016 28 2.2 Vật liệu 28 2.2.1 Môi trường .28 2.3.1 Phương pháp lấy lưu trữ mẫu 29 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 Sau thu mẫu bệnh phẩm tiến hành xác định mẫu bệnh phẩm dương tính với VKKK kết thu bảng 3.1 39 Qua bảng 3.1 chủng nhận thấy từ 1795 mẫu bệnh phẩm thu 372 mẫu cho kết dương tính với VKKK chiếm 20,72% Các mẫu bệnh phẩm không đồng nhất, bệnh phẩm gặp nhiều theo thứ tự dịch mật, mủ loại, dịch ổ bụng 39 Kết cao so với nghiên cứu Yang Y cộng [45] Trên 92 mẫu bệnh phẩm viêm tai mạn tính thì tỉ lệ mọc vi khuẩn kị khí 10 mẫu tổng số 92 mẫu chiếm 10,9 % Có khác biệt mẫu lấy tất loại bệnh phẩm mủ, dịch lấy người bệnh có dấu hiệu nhiễm trùng ổ áp xe, nghiên cứu Yang Y cộng loại bệnh phẩm dịch viêm tai mạn tính Một nghiên cứu khác Ceylon Med [14] cho thấy tỉ lệ vi khuẩn kị khí phân lập 41 mẫu mủ áp xe não 23% .39 3.1.2 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn kị khí theo loại bệnh phẩm 39 3.2.1.Kết định danh kiểu hình .40 Các chủng VKKK phân lập tiến hành định danh dựa vào tính chất sinh lý, sinh hóa kít định danh ID 32A hãng Bio Merieux Kết thể hình 3.1 40 41 Qua hình 3.1 thấy tỷ lệ vi khuẩn kị khí phân lập cao Bacteroides fragilis 17,9%, nhóm trực khuẩn Gram dương (chưa định xác tên) có tỷ lệ tương tự 17,9%, sau đến Clostridium perfringens 7,61%, Propionibacterium acnes 6,79%, Prevotella intermedia 6,38% đến nhóm vi khuẩn khác 41 Kết nghiên cứu tương đồng với số nghiên cứu tác giả giới Theo nghiên cứu tác giả Bao ZYvà cộng tỷ lệ nhiễm vi khuẩn kị khí thì vi khuẩn kị khí Gram dương hay gặp sau đến Peptostreptococcus, Bifidobacterium Pemphigus Propionibacterium đến chủng vi khuẩn kị khí gram âm Porphyromonas Prevotella [8] 41 Tương tự với nghiên cứu tác giả: Handal N cộng năm 2015 nghiên cứu 197 mẫu máu phân lập vi khuẩn kỵ khí phân lập bao gồm Bacteroides spp., Clostridium spp., Prevotella spp., Fusobacterium sp cầu khuẩn kị khí gram dương[17] .41 Tỷ lệ chủng vi khuẩn định danh hoàn toàn hợp lý với đặc thù Bệnh viện Việt Đức nơi nghiên cứu Đây tuyến cuối Bệnh viện đứng đầu ngoại khoa nên bệnh phẩm dịch, mủ, chất tiết apxe chiếm tỷ lệ cao Các nhiễm trùng vi khuẩn kị khí thường xuất ở bệnh nhân: Viêm phúc mạc, sau phẫu thuật, nhiễm trùng đường mật, loại abces 41 B fragilis thuộc vi hệ đường ruột thường có mặt nhiễm trùng hỗn hợp ổ bụng, khung chậu chí gây nhiễm khuẩn máu Nhóm trực khuẩn Gram dương nguyên chủ đạo nhiễm trùng vết thương mô mềm Propionibacterium gây bệnh xâm nhập sâu xuống da phẫu thuật tạo hình Prevotella intermedia gặp apxe não phổi Ngoài thấy nhiễm trùng khung chậu, apxe vòi trứng.Trong bệnh phẩm ổ apxe hay gặp nhiều loại, đơn phối hợp: cầu khuẩn Gram - dương, trực khuẩn Gram – âm, tuỳ vị trí có vi khuẩn kị khí amip 41 3.2.2 Kết phương pháp định danh kiểu gen 42 Kết định danh kiểu hình thông qua tính chất sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn bởi kít định ID 32 A hãng Bio Merieux định nhóm vi sinh vật, nhiên có số vi sinh vật có đặc điểm sinh lý sinh hóa tương đồng nên phải đưa vào nhóm chưa định tên vì nhiều hạn chế Vì lựa chọn số chủng vi khuẩn điển hình để tiến hành định danh kiểu gen Từ nhóm vi khuẩn nhặt chủng (3 chủng Gram dương chủng Gram âm) với thứ tự sau: 4111 Micro thuộc nhóm Micromonas, 4183 Prev thuộc nhóm Prevotella intermedia, 4111 Clos thuộc nhóm Clostridium perfringens, 4134 Actino thuộc nhóm Actinobacteria 4205 Bacte thuộc nhóm Bacteroides để tiến hành giải trình tự gen mã hóa 16S – rARN 42 > 4111 Micro .43 >4183 Pre 44 >4134 Acti 46 > 4205 Bact 46 51 Prevotella intermedia nhạy cảm 100% với Piperacillin-tazobactam, Chloramphenil Imipenem.Tỷ lệ nhạy cảm với kháng sinh Doxycyclin 96,77%, độ nhạy thấp gặp ở nhóm kháng sinh metronidazole 64,52% 52 3.3.3 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng VKKK gram dương 52 52 Vi khuẩn kị khí Gram dương nhạy cảm cao với Imipenem 92.96%, đứng thứ hai Piperacillintazobactam 89,74%, Doxycyclin có độ nhạy 87,91% Chloramphenicol 75,36%, đề kháng cao gặp ở nhóm kháng sinh Metronidazole 16,6% Các VKKK gram dương có 80% số chủng cho kết nhạy cảm với kháng sinh cefoxitin kết tương tự với nghiên cứu Trung Quốc tác giả Bao Zy cộng Theo nghiên cứu chủng VKKK gram dương phổ biến Peptostreptococcus, Bifidobacterium Pemphigus Propionibacterium chủng cho kết nhạy cảm với kháng sinh Cefoxitin, Amoxicillin .53 54 Qua hình 3.9 nhận thấy Propionibacterium acnes nhạy cảm tuyệt Piperacillintazobactam 100%, nhạy cảm cao với Imipenem 96,97%, Doxycyclin 96,97%, Chloramphenicol 93,55%, đề kháng cao gặp ở nhóm kháng sinh Metronidazole 6,06% Theo Wilson JR cộng cho nguyên nhân Propionibacterium acnes gây nhiễm khuẩn huyết 0% vì vi khuẩn tồn da gây bệnh chủ yếu da, đặc biệt trứng cá Tuy nhiên, nhiễm trùng ổ bụng vi khuẩn kị khí thường gặp có vai trò Propionibacterium spp[43] 54 Từ kết nói bác sỹ lâm sàng đưa hướng điều trị xác sau xác định vi sinh vật kị khí mẫu bệnh phẩm 54 KẾT LUẬN 55 1.Từ 1795 mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nằm điều trị Bệnh viện Việt Đức bệnh viện Đa khoa Đức Giang xác định 372 mẫu cho kết nuôi cấy dương tính với VKKK chiếm 20,72% Trong 372 mẫu dương tính phân lập 486 chủng vi khuẩn kị khí Tỷ lệ mọc vi khuẩn kị khí cao bệnh phẩm mủ chiếm 36,83%, dịch ổ bụng 28,19%, thứ ba dịch mật 14,61% 55 2.Đã định danh 486 chủng vi khuẩn kít định danh ID 32 A hãng Bio Merieux Tỷ lệ vi khuẩn kị khí phân lập cao Bacteroides fragilis 17,9%, trực khuẩn gram dương chưa xác định tên xác có tỷ lệ 17,9%, sau đến Clostridium perfringens 7,61%, Propionibacterium acnes 6,79%, Prevotella intermedia 6,38% 55 3.Đã tiến hành định danh phương pháp giải trình tự gen mã hóa 16S-rARN chủng vi khuẩn kị khí 4111 Micro, 4183 Prev, 4111 Clos, 4134 Actino 4205 Bacte thu kết tương đồng 100% tương ứng chủng Eggerthella lenta (Peptostreptococcus micros or Micromonas micros), Prevotella intermedia, Clostridium perfringens, Parvimonas micra (Actinobacteria), Bacteroides fragilis 55 4.Đã xác định độ nhạy cảm kháng sinh chủng VKKK gram âm gram dương Kết VKKK Gram âm nhạy cảm cao với Imipenem 87,44%, đứng thứ hai piperacillin-tazobactam 85,44%, chloramphenicol 80,88%, doxycyclin có độ nhạy tương tự 79,71%, đề kháng cao gặp ở nhóm kháng sinh metronidazole 34,95% Các VKKK gram dương nhạy cảm cao với Imipenem 92.96%, đứng thứ hai piperacillin-tazobactam 89,74%, doxycyclin có độ nhạy 87,91% chloramphenicol 75,36%, đề kháng cao gặp ở nhóm kháng sinh metronidazole 16,6% 55 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẲT ADN CLSI Acid deoxyribonucleic Clinical & Laboratory Standards Institute Viện chuẩn thức Hoa Kỳ lâm sàng xét nghiệm MALDI-TOF MS Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight MIC Mass Spectrometry The minimum inhibitory concentration rARN Nồng độ ức chế tối thiểu Ribosomal Acid ribonucleic PCR ARN Riboxom Polymerase Chain Reaction VKKK TZP CHL DOX IPM MTR bfr gm+ cpe pro pin gmo bur pmg pol ame clo mib Phản ứng chuỗi polymerase Vi khuẩn kỵ khí Piperacillin tazobactam Cloramphenicol Doxycyclin Imipenem Metronidazole Bacteroides fragilis Gram positive bacteria Clostridium perfringens Propionibacterium acnes Prevotella intermedia Gemella morbillorum Bacteroides ureolyticus Finegoldia magna Prevotella oralis Actinomyces meyeri Clostridium sp Microbacterium sp DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Số lượng, tỉ lệ vị trí tồn vi khuẩn kị khí 16 Bảng 1.2 Tỉ lệ hình thái nhiễm trùng phân lập vi khuẩn kị khí [15] .18 Bảng 2.1: Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR .33 Bảng 2.2 Tiêu chuẩn diễn giải kết đường kính vùng ức chế B fragilis chủng vi khuẩn kị khí mọc chậm [36] 35 Bảng 2.3: Tiêu chuẩn diễn giải kết đường kính vùng ức chế C perfringen chủng vi khuẩn kị khí mọc chậm[36] 36 Bảng 2.4 Tiêu chuẩn diễn giải kết đường kính vùng ức chế chủng vi khuẩn kị khí mọc nhanh [36] 36 Bảng 3.1: Tỷ lệ phân lập VKKK loại bệnh phẩm .39 Bảng 3.2 Phân lập VKKK theo loại bệnh phẩm .40 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Xác định khả nhạy cảm kháng sinh phương pháp khoanh giấy kháng sinh 35 Hình 2.2 Xác định khả nhạy cảm kháng sinh phương pháp etest .35 Hình 3.1 Kết định danh kiểu hình vi khuẩn kị khí 41 Hình 3.2 Kết tách ADN tổng số chủng VKKK 43 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR .43 Hình 3.4 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng VKKK gram âm 50 Hình 3.5 Mức độ nhạy cảm với số kháng sinh Bacteroides fragilis .51 Hình 3.6 Mức độ nhạy cảm với số kháng sinh Prevotella intermedia 52 Hình 3.7 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng VKKK gram dương 52 Hình 3.8 Mức độ nhạy cảm với số kháng sinh Clostridium perfringens .53 Hình 3.9 Mức độ nhạy cảm với số kháng sinh Propionibacterium acnes .54 Prevotella intermedia nhạy cảm 100% với Piperacillin-tazobactam, Chloramphenil Imipenem.Tỷ lệ nhạy cảm với kháng sinh Doxycyclin 96,77%, độ nhạy thấp gặp ở nhóm kháng sinh metronidazole 64,52% 52 Vi khuẩn kị khí Gram dương nhạy cảm cao với Imipenem 92.96%, đứng thứ hai Piperacillintazobactam 89,74%, Doxycyclin có độ nhạy 87,91% Chloramphenicol 75,36%, đề kháng cao gặp ở nhóm kháng sinh Metronidazole 16,6% Các VKKK gram dương có 80% số chủng cho kết nhạy cảm với kháng sinh cefoxitin kết tương tự với nghiên cứu Trung Quốc tác giả Bao Zy cộng Theo nghiên cứu chủng VKKK gram dương phổ biến Peptostreptococcus, Bifidobacterium Pemphigus Propionibacterium chủng cho kết nhạy cảm với kháng sinh Cefoxitin, Amoxicillin .53 Qua hình 3.9 nhận thấy Propionibacterium acnes nhạy cảm tuyệt Piperacillintazobactam 100%, nhạy cảm cao với Imipenem 96,97%, Doxycyclin 96,97%, Chloramphenicol 93,55%, đề kháng cao gặp ở nhóm kháng sinh Metronidazole 6,06% Theo Wilson JR cộng cho nguyên nhân Propionibacterium acnes gây nhiễm khuẩn huyết 0% vì vi khuẩn tồn da gây bệnh chủ yếu da, đặc biệt trứng cá Tuy nhiên, nhiễm trùng ổ bụng vi khuẩn kị khí thường gặp có vai trò Propionibacterium spp[43] 54 Từ kết nói bác sỹ lâm sàng đưa hướng điều trị xác sau xác định vi sinh vật kị khí mẫu bệnh phẩm 54 ĐẶT VẤN ĐỀ >4134 Acti TGCAAGTCGAACGTGATTTTTGTGGAAAGTCCTTCGGGGACGGAAGCGAAATGAA AGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTACCTTACACAGGGGGATAGCC GTTGGAAACGACGATTAATACCGCATGAGACCACAGAATCGCATGATATAGGGGT CAAAGATTTATCGGTGTAAGAAGGGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGAAGGGTAA AGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGTCTGAGAGGATGAACGGCCACATTG GAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACA ATGGGGGGAACCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGTTTTCGAATCG TAAAGCTCTGTCCTATGAGAAGATAATGACGGTATCATAGGAGGAAGCCCCGGCT AAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGGGCGAGCGTTGTCCGGAATTA TTGGGCGTAAAGGGTACGTAGGCGGTTTTTTAAGTCAGGTGTGAAAGCGTGAGGCT TAACCTCATTAAGCACTTGAAACTGGAAGACTTGAGTGAAGGAGAGGAAAGTGGA ATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAATACCGGTGGCGAAG GCGACTTTCTGGACTTTTACTGACGCTCAGGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGGAGTC AAATCTCGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTGGCA ACACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGT TTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATAGTTGAGTTATT GAGAAATTGATAAGTCCCTCGGGACAACTATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAG CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTCAG TTGCCAGCACGTA > 4205 Bact TGCAGTCGAGGGGCATCAGGAAGAAAGCTTGCTTTCTTTGCTGGCGACCGGCGCAC GGGTGAGTAACACGTATCCAACCTGCCCTTTACTCGGGGATAGCCTTTCGAAAGAA AGATTAATACCCGATGGCATAATGATTCCGCATGGTTTCATTATTAAAGGATTCCG GTAAAGGATGGGGATGCGTTCCATTAGGTTGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAG CCTTCGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACAC GGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGGTAGC CTGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGAAGGCTCTATGGGTCGTAAACTTCTTTT ATATAAGAATAAAGTGCAGTATGTATACTGTTTTGTATGTATTATATGAATAAGGA TCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGG ATTTATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGGTGGACTGGTAAGTCAGTTGTGAAAGTTTG CGGCTCAACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGTCAGTCTTGAGTACAGTAGAGGTGG GCGGAATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCGATTGC GAAGGCAGCTCACTGGACTGCAACTGACACTGATGCTCGAAAGTGTGGGTATCAA ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTTGC GATATACAGTAAGCGGCCAAGCGAAAGCATTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGC CGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACA TGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTGCAGTGGA ATGATGTGGAAACATGTCAGTGAGCAATCACCGCTGTGAAGGTGCTGCATGGTTGT CGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTAT CTTCAGTTACTAACAGGTCATGCTGAGGACTCTGGAGAGACTGCCGTCGTAAGATG TGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACAC ACGTGTTACAATGGGGGGTACAGAAGGCAGCTAGCGGGTGACCGTATGCTAATCC CAAAATCCTCTCTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCAACCCGACTTCGTGAAGCTGGAT TCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCACGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTAC ACACCGCCCGTCAAGCCATGGGAGCCGGGGGTACCTGAAGTACGTAACCGCAAGGATC GTCCTAGG Trình tự đoạn gen 16S rDNA chủng phân tích sử dụng để Blast lên ngân hàng liệu NCBI để nhận diện loài có kết sau: > 4111 Micro- Định tên: Eggerthella lenta (Peptostreptococcus micros or Micromonas micros) >4183 Pre – định tên: Prevotella intermedia >4111 Clos – định tên: Clostridium perfringens >4134 Acti – định tên: Parvimonas micra (Actinobacteria) > 4205 Bact- định tên: Bacteroides fragilis Kết cho thấy chủng 4111 Micro, 4183 Prev, 4111 Clos, 4134 Actino 4205 Bacte định danh kít ID32 tương ứng có tương đồng định danh kiểu gen Eggerthella lenta (Peptostreptococcus micros or Micromonas micros), Prevotella intermedia, Clostridium perfringens, Parvimonas micra (Actinobacteria), Bacteroides fragilis Điều cho thấy phương pháp định danh kiểu hình nhờ kit định danh ID32 đủ độ xác để tiến hành xác định độ nhạy cảm kháng sinh để từ bác sỹ có định hướng dùng thuốc hợp lý cho bệnh nhân 3.3 Kết quả nhạy cảm kháng sinh chủng VKKK phân lập được 3.3.1 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng VKKK gram âm Hình 3.4 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng VKKK gram âm Vi khuẩn kị khí Gram âm nhạy cảm cao với Imipenem 87,44%, đứng thứ hai Piperacillin-tazobactam 85,44%, Chloramphenicol 80,88%, Doxycyclin có độ nhạy tương tự 79,71%, đề kháng cao gặp nhóm kháng sinh Metronidazole 34,95% Tỷ lệ nhạy cảm chủng VKKK gram âm với metronidazole thấp so với nghiên cứu tác giả Bao Zy cộng Theo tác giả Bao Zy: “Các chủng vi khuẩn kỵ khí gram âm hay gặp Porphyromonas Prevotella Các chủng kị khí chưa cho kết kháng với kháng sinh Metronidazole, Cefoxitin, Amoxicillin”.[8] Từ kết nghiên cứu trên, lựa chọn chủng vi khuẩn kị khí gram âm hay gặp Bacteroides fragilis Prevotella intermedia tiến hành nghiên cứu mức độ nhạy cảm kháng sinh với kháng sinh TZP (Piperacillin tazobactam), CHL (Chloramphenicol), DOX (Doxycyclin), IPM (Imipenem) MTR (Metronidazole) kết thể hình 3.5 3.6 Hình 3.5 Mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh Bacteroides fragilis Qua hình 3.5 nhận thấy Bacteroides fragilis nhạy cảm cao với Imipenem 79,31%, Piperacillin-tazobactam 79,31%, Chloramphenicol 72,41%, Doxycyclin có độ nhạy tương tự 72,41%, đề kháng cao gặp nhóm kháng sinh Metronidazole 17,24% So sánh với nghiên cứu Handal cộng với 197 chủng vi khuẩn kị khí phân lập tỉ lệ Bacteroides spp kháng với kháng sinh penicillin đến 99,2%, kháng clindamycin 18,55 % Các chủng nhạy cảm tốt với Meropenem Metronidazole[17] So sánh với kết nhóm Bacteroides mà phân lập nhạy cảm với kháng sinh nhóm Carbapenem kháng cao với Metronidazol Điều giải thích nhóm Bacteroides tiếp xúc thời gian dài với loại kháng sinh khả kháng kháng sinh cao Mà bệnh viện Việt Đức bệnh viện tuyến cuối nên việc sử dụng kháng sinh metronidazole nhiều nên tỷ lệ kháng lại kháng sinh cao Tiếp tục nghiên cứu độ nhạy cảm kháng sinh chủng VKKK gram âm Prevotella intermedia kết thể hình 3.6 Hình 3.6 Mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh Prevotella intermedia Prevotella intermedia nhạy cảm 100% với Piperacillin-tazobactam, Chloramphenil Imipenem.Tỷ lệ nhạy cảm với kháng sinh Doxycyclin 96,77%, độ nhạy thấp gặp nhóm kháng sinh metronidazole 64,52% 3.3.3 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng VKKK gram dương Hình 3.7 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng VKKK gram dương Vi khuẩn kị khí Gram dương nhạy cảm cao với Imipenem 92.96%, đứng thứ hai Piperacillin-tazobactam 89,74%, Doxycyclin có độ nhạy 87,91% Chloramphenicol 75,36%, đề kháng cao gặp nhóm kháng sinh Metronidazole 16,6% Các VKKK gram dương có 80% số chủng cho kết nhạy cảm với kháng sinh cefoxitin kết tương tự với nghiên cứu Trung Quốc tác giả Bao Zy cộng Theo nghiên cứu chủng VKKK gram dương phổ biến Peptostreptococcus, Bifidobacterium Pemphigus Propionibacterium chủng cho kết nhạy cảm với kháng sinh Cefoxitin, Amoxicillin Chúng tiếp tục lựa chọn chủng vi khuẩn kị khí gram dương hay gặp Clostridium perfringens Propionibacterium acnes để xác định độ nhạy cảm kháng sinh chúng, kết thu hình 3.8 3.9 Hình 3.8 Mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh Clostridium perfringens Nhìn hình 3.8 nhận thấy Clostridium perfringens nhạy cảm cao với Imipenem 91,67%, Piperacillin-tazobactam 86,49%, Chloramphenicol 59,46%, Doxycyclin có độ nhạy tương tự 40,54%, đề kháng cao gặp nhóm kháng sinh Metronidazole 10,81% Kết cho gợi ý hạn chế sử dụng kháng sinh metronidazole cho nhiễm khuẩn Clostridium perfringens, với nhiễm khuẩn Piperacillin-tazobactam Imipenem nên sử dụng Theo tác giả Fan YC cộng C perfringens phân lập nhạy cảm với kháng sinh amoxicillin, bacitracin enrofloxacin kháng với Chlortetracycline, Erythromycin, and Lincomycin [47] Hình 3.9 Mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh Propionibacterium acnes Qua hình 3.9 nhận thấy Propionibacterium acnes nhạy cảm tuyệt Piperacillin-tazobactam 100%, nhạy cảm cao với Imipenem 96,97%, Doxycyclin 96,97%, Chloramphenicol 93,55%, đề kháng cao gặp nhóm kháng sinh Metronidazole 6,06% Theo Wilson JR cộng cho nguyên nhân Propionibacterium acnes gây nhiễm khuẩn huyết 0% vi khuẩn tồn da gây bệnh chủ yếu da, đặc biệt trứng cá Tuy nhiên, nhiễm trùng ổ bụng vi khuẩn kị khí thường gặp có vai trò Propionibacterium spp[43] Từ kết nói bác sỹ lâm sàng đưa hướng điều trị xác sau xác định vi sinh vật kị khí mẫu bệnh phẩm KẾT LUẬN Từ 1795 mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nằm điều trị Bệnh viện Việt Đức bệnh viện Đa khoa Đức Giang xác định 372 mẫu cho kết nuôi cấy dương tính với VKKK chiếm 20,72% Trong 372 mẫu dương tính phân lập 486 chủng vi khuẩn kị khí Tỷ lệ mọc vi khuẩn kị khí cao bệnh phẩm mủ chiếm 36,83%, dịch ổ bụng 28,19%, thứ ba dịch mật 14,61% Đã định danh 486 chủng vi khuẩn kít định danh ID 32 A hãng Bio Merieux Tỷ lệ vi khuẩn kị khí phân lập cao Bacteroides fragilis 17,9%, trực khuẩn gram dương chưa xác định tên xác có tỷ lệ 17,9%, sau đến Clostridium perfringens 7,61%, Propionibacterium acnes 6,79%, Prevotella intermedia 6,38% Đã tiến hành định danh phương pháp giải trình tự gen mã hóa 16SrARN chủng vi khuẩn kị khí 4111 Micro, 4183 Prev, 4111 Clos, 4134 Actino 4205 Bacte thu kết tương đồng 100% tương ứng chủng Eggerthella lenta (Peptostreptococcus micros or Micromonas micros), Prevotella intermedia, Clostridium perfringens, Parvimonas micra (Actinobacteria), Bacteroides fragilis Đã xác định độ nhạy cảm kháng sinh chủng VKKK gram âm gram dương Kết VKKK Gram âm nhạy cảm cao với Imipenem 87,44%, đứng thứ hai piperacillin-tazobactam 85,44%, chloramphenicol 80,88%, doxycyclin có độ nhạy tương tự 79,71%, đề kháng cao gặp nhóm kháng sinh metronidazole 34,95% Các VKKK gram dương nhạy cảm cao với Imipenem 92.96%, đứng thứ hai piperacillintazobactam 89,74%, doxycyclin có độ nhạy 87,91% chloramphenicol 75,36%, đề kháng cao gặp nhóm kháng sinh metronidazole 16,6% KIẾN NGHỊ Tiếp tục phân lập tuyển chọn chủng VKKK với quy mô lớn Cần nghiên cứu sâu khả gây bệnh khả kháng thuốc vi khuẩn kị khí để bác sỹ có hướng đắn giải pháp điều trị bệnh vi khuẩn kị khí gây nên Đưa quy trình xác định vi khuẩn kị khí vào quy trình thường quy bệnh viện Đầu tư thêm trang thiết bị xác định vi khuẩn kị khí TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Tiến Hải (2001) Nghiên cứu tình trạng nhiễm khuẩn đường mật bệnh nhân sỏi đường mật Luận án tiến sĩ y học, Hà Nội Lê Thiều Hoa (1988) Phương pháp nuôi cấy phân loại vi khuẩn kị khí cho phòng xét nghiệm không chuyên Luận án tiến sĩ, Trường đại học Huboldt Berlin Lê Thiều Hoa (1990) “Kết 101 trường hợp nuôi cấy vi khuẩn kị khí khoa vi sinh bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức” Ngoại khoa 2/1990, tr.1-7 Lê Thiều Hoa (1996) “ Kết nuôi cấy phân lập 632 bệnh phẩm tìm vi khuẩn kị khí, khoa Vi sinh bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức từ 30/12/1992 đến 5/10/1995” Tạp chí Y học thực hành, 11, tr.17-19 Lê Thị Thiều Hoa, Nguyễn Thị Mai, Đỗ Kim Sơn cộng (2000) “Nghiên cứu kết nuôi cấy vi khuẩn nước mật, kháng sinh đồ tình hình sử dụng kháng sinh điều trị 100 bệnh nhân mổ sỏi mật khoa phẫu thuật gan mật bệnh viện Việt Đức thời gian 8/1999 đến 1/2000 Ngoại khoa 5/2000, tr 41-48 Trần Thị Lan Phương (2003), “Nghiên cứu vi khuẩn dịch mật bệnh nhân sỏi đường mật mức độ nhạy cảm với kháng sinh chúng” Luận văn bác sĩ chuyên khoa cấp II, Đại học Y Hà Nội Bailay and Scott’s, “ Diagnostic Microbiology”, Thirteenth 13 edition, chapter 22 “anaerobes of clinical important” tr: 495-528 Bao ZY, Lin Q, Meng YH, He C, Su JZ, Peng X (2016), “Application of anaerobic bacteria detection in oral and maxillofacial infection” Journal of Peking University, 48(1):76-9 Biomérieux (1994) “Anaerobier- Diagnostik”, Biomérieux Deutschland 10 GmbH Burhard F (1992) “Mikrobiologische dianostik”, Geoge Thieme Verlag 11 Stuttgart New York Choi TK, Wong J (1990) “Current management of intrahepatic stones”; 12 Wold Surg 14, p487-491 CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 13 Twenty-first Informational Connie R.Mahon, Donald C.Lehman, George Manuselis Textbook of Diagnostic Microbiology fifth edition, chapter 41 “anaerobic bacteriology” 14 section 13, tr: 458-482 Ceylon Med J 2003 “Microbiology of cerebral abscess at the neurosurgical 15 unit of the National Hospital of Sri Lanka” Mar;48(1):14-6 Hahn H., D.Falke, S.H.E Kaufmann, U Ulmann (1999) “Mediznische 16 Mikrobiologie und Infektiologie”; Springer – Verlag Berlin Heideberg Hammond JM, Potgieter PD, Hanslo D, Scott H, Roditi D (1995) “The etiology and antimicrobial susceptibility patterns of microorganisms 17 in acute community-acquired lung abscess” Chest 108(4): 937-41 Handal N, Bakken Jørgensen S, Smith Tunsjø H, Johnsen BO, Leegaard TM (2015) “Anaerobic blood culture isolates in a Norwegian university hospital: identification by MALDI-TOF MS vs 16S rRNA sequencing and antimicrobial susceptibility profiles” Acta 18 Pathologica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica 123(9):749-58 Holdeman L.V., Kelley R.W., Moore W.E.C (1984) “Anaerobic Gram – Negative straight, curved and helical rods”; Section 6, Bergey’s Manual 19 of Systematic Baltimo Jacquenlyin G Black, “Mirobiology” principles exphorations “ eighth 20 edition, tr 514-533 Jawetz, melnick and Adelbery’s, “Medical microbiology ” 26 edition, 21 chapter 21, Section III “Infection caused by anaerobic”, tr 296-303 Kenneth J., Ryan C., George Ray, “Sherris Medical microbiology” 22 (sixth edition), tr: 326-349 Lafaix C (1981) “Infections par les baterises anaerobies non sporulées”; 23 I’ Atelier 606 Paris Lynne S Garcia, Clinical microbiology procedures handbook Second edition, volum 1, Section 4, Tr: 4.0.1- 4.12.6 24 M, Doğan, et al (2013), “A Case Report of Cerebellar Abscess Caused by Bacteroidesfragilis.”, American Journal of Clinical Medicine Research 1.4: 48-50 25 Mandell, Douglas and Rennett’t (2015), “Principles and practice of 26 infections deseases”, tr2736-2781 Miranda KR, Neves FP, Santos-Filho Jd, de Paula GR, Lobo LA, Oelemann WM, Domingues RM (2013), “Application of DNA sequence analysis based on five different conserved genes (16S rDNA, rpoB, gdh, est and pgm) for intra-species discrimination of Bacteroides fragilis.” 27 28 Anaerobe 19:58-61 Murray, Rosenthal, Pfaller, “Medical microbiology”, tr 327-350 Paster BJ, Dewhirst FE, Olsen I, Fraser GJ.(1994) “Phylogeny of Bacteroides, Prevotella, and Porphyromonas spp and related bacteria” 29 Bacteriol 176(3):725-32 Pasteur L (1861) “Animalcules infusoires vivant sans oxygène libre et déterminant des fermentations”, C.R Acad Sci.[D] (Paris) 56: 1189 – 30 1894 Rosenblatt J.E (1976), “Isolation and identification of anaerobic 31 bacteria”, Hum Pathol 7: 177-186 .Seneviratne Rde S, Navasivayam P, Perera S, Wickremasinghe RS, (2003), “Microbiology of cerebral abscess at the neurosurgical unit of the 32 National Hospital of Sri Lanka” Ceylon Med J 48(1):14-6 Silver S (1980), “Anaerobic bacteriology for the clinical laboratory”, The 33 C.V.Mosby company st Louis Toronto London, Washington D.C Smith L.D.S (1967) “Anaerobes an oxygen” In Fredelle V editor: “The anaerobic bacteria”, Montreal, Institut of Microbiology an Hygiene of 34 Monteal Universit Somer H.R.J., Summanen P.H, Finegold S M (1995), “Bacteroides, porphyromonas, prevotella, fusobacterium, and other anaerobic”; Manual of clinical microbiology, ed.6 ASM press; Washington D C chap 49 35 p603-620 Sudhaharan S, Chavali P, Vemu L, (2016), “Anaerobic brain abscess” 36 Iran J Microbiol 8(2):120-4 Sutter V.L., Citron D.M , Finegold S.M (1980), “Wadsworth anaerobic 37 bacteriology manual”; Ed 3, St Louis Toronto London 1980 Veillon A (1893) “Sur un microcoque anaerobie trouvé dans des 38 suppurations fétides” C.R.Soc.Biol (Paris) 45: 807 – 809 Veillon A , Zuber A (1897) “Sur quelques microbes strictment anaérobies et leur role dans la pathologie humanine”; C.R.SOC Biol 39 (Paris) 49: 253 – 255 Veillon A , Zuber A (1898) “Sur quelques microbes strictment 40 anaérobies”; Arch Med Exp Anatopathol 10: 517 – 545 Wagner C (1999) “III Anaerobe wachsenden Bakterien”; Resistezen UK Benjamin Franklin 1999 alle Materialien; Institut fur Infektionsmedizin, Abteilung Medizinnische Mikrobiologie des UKBF/FU Berlin P41 41 Werner H.(1985) “Anaerobier-Infektionen-pathogenese, Klinik, Therapie, Diagnostik”; 2.Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart New 42 York Werner H (1992) “Medizinische Mikrobiologie mit Repetiorium” 43 Walter de Gruyter Berlin New York 1992 Wilson JR1, Limaye AP, (2004), “Risk factors for mortality in patients 44 with anaerobic bacteremia” Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 23(4):310-6 Yang NW, Kim JM, Choi GJ, Jang SJ, (2010), “Development and evaluation of the quick anaero-system-a new disposable anaerobic culture 45 system” Korean J Lab Med, 30(2):133-7 Yang Y, Gong S, Liu Y (2001) The clinical investigation of bacteriology of chronic suppurative otitis media Journal of clinical 46 otorhinolaryngology 15(12): 550-2 Yi-Weitang, Max sussman, Dongyou Liu, Ian Poxton and Joseph 47 Schwart zman “Medical microbiology” tr 875-968 Fan YC1, Wang CL1, Wang C2, Chen TC1, Chou CH1, Tsai HJ1(2016)” Incidence and Antimicrobial Susceptibility to Clostridium perfringens in Premarket Broilers in Taiwan” Jun;60(2):444-9 doi: 10.1637/11315-110915-Reg Avian Dis 2016 ... kháng sinh vi khuẩn kị khí mẫu bệnh phẩm với mục tiêu là: Phân lập, xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn kị khí mẫu bệnh phẩm lâm sàng Định danh chủng vi khuẩn kị khí phân lập Xác định mức độ nhạy cảm. .. lượng mẫu lớn công bố tỉ lệ mọc vi khuẩn kị khí bệnh phẩm người bệnh có nhiễm trùng hay mức độ nhạy cảm kháng sinh chủng vi khuẩn kị khí Nguyên nhân tình trạng thiếu hiểu biết vi khuẩn kị khí, ... thể vi khuẩn Sau 24 – 48 mọc môi trường kị khí mà không mọc môi trường khí xác định vi khuẩn kị khí, vi khuẩn mọc hai môi trường xác định vi khuẩn hiếu kị khí tùy tiện 2.3.3 Phương pháp định danh