Header Page of 148 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O B YT TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ N I NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN C U XÂY D NG QUY TRÌNH TỔNG HỢP LEVOTHYROXIN MONONATRI VÀ LIOTHYRONIN MONONATRI TỪ L-TYROSIN Chuyên ngành: Công nghệ dư c phẩm bào ch thuốc Mã số: 62720402 TÓM T T LUẬN ÁN TI N Sƾ DƯỢC HỌC Hà N i, năm 2016 Footer Page of 148 Header Page of 148 Công trình đư c hoàn thành t i: - B môn Công nghiệp Dư c, trường Đ i học Dư c Hà N i - B môn Bào ch , trường Đ i học Dư c Hà N i - Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương - Viện Hóa học, viện Hàn lâm khoa học Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Đình Luyện TS Nguyễn Văn Hân Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án s đư c bảo vệ trước H i đồng chấm luận án cấp trường họp t i: Vào hồi: ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án t i: Thư viện quốc gia Việt Nam Thư viện trường Đ i học Dư c Hà N i Footer Page of 148 Header Page of 148 CÁC KÝ HI U, CH VI T T T Ch vi t t t Ch đầy đ nghƿa ti ng Vi t 13 Phổ c ng hưởng từ h t nhân carbon-13 C-NMR (Carbon13- Nuclear Magnetic Resonance) H-NMR Phổ c ng hưởng từ h t nhân proton (Proton- Nuclear Magnetic Resonance) Ac Acetyl (CH3CO-) Acac Acetyl acetonat ACN Acetonitril DMF Dimethylformamid [HCON(CH3)2] eq Đương lư ng (equivalent) EI Ion hóa va ch m điện tử (electron impact) ESI Ion hóa phun mù điện tử (electrospray ionization) Et Ethyl (C2H5-) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (Highperformance liquid chromatography) IR Phổ hồng ngo i (Infrared Spectrophotometer) LD50 Liều ch t trung bình Me Methyl (CH3-) MS Phổ khối lư ng (Mass Spectrometry) OECD Tổ chức H p tác Phát triển Kinh t (Organization for Economic Co-operation and Development) Rf Footer Page of 148 Hệ số lưu giữ (retention factor) Header Page of 148 T2 Diiodothyronin (3,5-diiodo-thyronin) T3 Triiodothyronin, liothyronin (3,5,3’-triiodothyronin) T3 Na Liothyronin natri T3 diNa Liothyronin dinatri T4 Tetraiodothyronin, levothyroxin (3,5,3’,5’tetraiodo-thyronin) T4 Na Levothyroxin natri T4 diNa Levothyroxin dinatri tonc Nhiệt đ nóng chảy Ts Tosyl (p-CH3-C6H4-SO2-) TsOH Acid p-toluensulfonic Footer Page of 148 Header Page of 148 MỞ Đ U Tính c p thi t c a lu n án Kho ng - 5% dân s Vi t Nam bị suy tuyến giáp B nh gặp nhiều lứa tuổi nhiều đ i tượng Trẻ em bị suy giáp chậm lớn phát triển trí tu B nh hay gặp phụ nữ có thai, gây hậu qu nghiêm trọng đến thai nhi Ngoài s trường hợp suy giáp dùng thu c kháng giáp hồi phục ngưng thu c, đa s trường hợp khác ph i điều trị hormon giáp tr ng c đời Hi n nay, nhu cầu s dụng levothyroxin liothyronin nước ta điều trị b nh lớn mà vi c s n xuất nguyên li u nước chưa thực hi n Con đường tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri chủ yếu t L-tyrosin, nguyên li u điều chế phương pháp thủy phân nguồn keratin khác s ng, tóc… Nếu tiến hành nghiên cứu, s n xuất thành công levothyroxin mononatri liothyronin mononatri chủ động nguồn nguyên li u Quyết định s 61/2007/QĐ-TTg Thủ tướng Chính phủ ngày 07/05/2007 vi c phê t “Chương trình nghiên cứu khoa học công ngh trọng điểm qu c gia phát triển công nghi p hóa dược đến năm 2020” đặt cho ngành dược Vi t Nam mục tiêu quan trọng tăng cường tự s n xuất nguyên li u làm thu c, tiến tới chủ động s n xuất thu c nước Mục tiêu c a lu n án Xây dựng quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri từ L-tyrosin quy mô phòng thí nghiệm Đánh giá độ ổn định độc tính cấp sản phẩm Footer Page of 148 Header Page of 148 Nội dung c a lu n án Kh o sát phương pháp tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri t L-tyrosin Chọn phương pháp phù hợp để triển khai tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri đ t tiêu chuẩn dược dụng Đánh giá độ ổn định s n phẩm điều ki n: lão hóa cấp t c điều ki n thường Đánh giá độc tính cấp s n phẩm Nh ng đóng góp c a lu n án Đã xây dựng quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri t L-tyrosin s n xuất nước theo phương pháp J R Chalmers P Bracco với c i tiến sau:  Đã thực hi n thành công ph n ứng kh hóa hợp chất 3,5-dinitro4-p-methoxyphenoxy-N-acetyl-L-phenylalanin ethyl ester điều ki n áp suất thường  Đã c i tiến phương pháp t o mu i mononatri levothyroxin liothyronin cách dùng natri bicarbonat bão hòa thay cho natri carbonat bão hòa Lần thực hi n thành công phương pháp t o ether Ullmann tổng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl ester t ph n ứng dẫn chất L-tyrosin 4-bromoanisol với xúc tác mu i đồng (I) iodid ph i t sắt (III) acetylacetonat môi trường kali carbonat dung môi dimethyl formamid C u trúc c a lu n án Footer Page of 148 Header Page of 148 Luận án gồm 135 trang, 50 hình, 38 b ng, 148 tài li u tham kh o B cục gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Tổng quan (32 trang), Nguyên li u, trang thiết bị phương pháp nghiên cứu (9 trang), Thực nghi m kết qu nghiên cứu (65 trang), Bàn luận (25 trang), Kết luận đề xuất (2 trang), Tài li u tham kh o (17 trang), Danh mục công trình khoa học công b liên quan đến đề tài luận án (1 trang), Danh mục phụ lục (4 trang), Phụ lục (79 trang) Ch ng 1: T NG QUAN 1.1 T ng quan v levothyroxin liothyronin 1.1.1 Levothyroxin mononatri hydrat I HO I O I ONa NH O x H O 2 I Hình 1.2 Công thức cấu t o levothyroxin mononatri hydrat 1.1.2 Liothyronin mononatri hydrat O HO I I O NH O N a x H 2O I Hình 1.4 Công thức cấu t o liothyronin mononatri hydrat 1.1.3 Tác dụng dược lý hormon tuyến giáp Kích thích ph n ứng trao đổi làm tăng chuyển hoá b n, tăng hấp thu glucose ruột tăng phân huỷ glycogen, nên gây tăng đường huyết, tăng phân huỷ triglycerid, phospholipid cholesterol, tăng tổng hợp protein Không đủ hormon tuyến giáp gây b nh Footer Page of 148 Header Page of 148 suy giáp, trẻ chậm lớn không phát triển trí tu , người lớn bị chứng m ch chậm, gi m thân nhi t, gi m trao đổi chất b n, gi m ho t động trí não, bướu cổ 1.2 Các ph ng pháp t ng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri Có phương pháp: Phương pháp tổng hợp qua chất trung gian 3,5-diiodo-Lthyronin: I I2/KI/base 1e q O HO I OH O I N a2CO N a2CO eq I I2/KI/base 2e q I ONa N H2 O NH O HO I HO I O I ON a NH2 O I Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp levothyroxin mononatri (8) liothyronin mononatri (7) t 3,5-diiodo-L-thyronin (6) Trong giới thi u phương pháp tổng hợp 6: Phương pháp tác gi như: C R Harington cộng sự, A David cộng sự, W Siedel cộng sự, G Hillmann, J R Chalmers cộng (sau có c i tiến P Bracco s bước quan trọng), P Z Anthony R I Meltzer Các phương pháp khác: Phương pháp Salamonczyk, Phương pháp oxy hóa L G Ginger 1.3 Các ph ng pháp t o hợp ch t diaryl ether Có phương pháp: Phương pháp ghép đôi nhờ xúc tác Cu: Ph n ứng Ullmann cổ điển; Ph n ứng ghép đôi Ullmann dẫn chất có nhóm Footer Page of 148 Header Page of 148 ortho; Ph n ứng ghép đôi acid arylboronic nhờ xúc tác Cu(OAc)2 Phản ứng nhân nhân thơm: Ph n ứng nhân chuẩn; Ph n ứng nhân để t o phức kim lo i-aren; Với mu i diaryl iodo Phản ứng oxy hóa: Oxy hóa phenol Các phương pháp khác 1.4 Phân tích, l a chọn h ớng nghiên c u Qua tổng quan tài li u dựa vào xu hướng nghiên cứu giới tổng kết có phương pháp tổng hợp nguyên li u t Ltyrosin: Phương pháp 1: Oxy hóa dẫn chất 3,5-diiodo-L-tyrosin theo phương pháp L G Ginger t o levothyroxin; Phương pháp 2: Ngưng tụ với dẫn chất iodoni iodid G Hillmann t o levothyroxin liothyronin; Phương pháp 3: Tổng hợp qua dẫn chất nitro J R Chalmers t o levothyroxin liothyronin; Phương pháp 4: T o cầu n i diaryl ether t dẫn chất L-tyrosin với acid 4- methoxyphenylboronic, xúc tác Cu(OAc)2 theo tác gi A David t o levothyroxin liothyronin T phương pháp dự định tiến hành kh o sát để tìm phương pháp phù hợp với điều ki n thiết bị hi n có triển khai tổng hợp quy mô lớn Đồng thời nghiên cứu phương pháp t o ether Ullmann aryl halogenid L-tyrosin để t o liên kết ether hormon giáp tr ng với hy vọng có đóng góp mặt khoa học, sau tiến hành nghiên cứu tiếp kh ứng dụng vào thực tế s n xuất Ch ng 2: NGUYÊN LI U, TRANG THI T B VÀ PH PHÁP NGHIÊN C U 2.1 Nguyên li u Footer Page of 148 NG Header Page 10 of 148 Nguyên li u, hóa chất, dung môi s dụng nghiên cứu lo i đ t tiêu chuẩn tổng hợp Các dung môi sắc ký đ t tiêu chuẩn dùng cho HPLC 2.2 Thi t b nghiên c u S dụng thiết bị tổng hợp hóa dược chuyên dụng, thiết bị dùng để định tính, định lượng tin cậy trường Đ i học Dược Hà Nội, vi n Hóa học hợp chất thiên nhiên - Vi n Hàn lâm Khoa học Vi t Nam, vi n Kiểm nghi m thu c trung ương 2.3 Ph ng pháp nghiên c u 2.3.1 Phương pháp tổng hợp hóa học Bằng ph n ứng hữu cơ b n: iodo hóa, acetyl hóa, ester hóa, oxy hóa, thủy phân, nitro hóa, ngưng tụ, kh hóa, diazo hóa ph n ứng t o mu i natri t phenol, t acid carboxylic 2.3.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết Theo phương pháp: Nhi t độ nóng ch y Sắc ký lớp m ng 2.3.3 Phương pháp phân tích cấu trúc Để phân tích, khẳng định cấu trúc chất tổng hợp, đề tài s dụng phương pháp phổ: IR, MS, 1H-NMR 13C-NMR 2.3.4 Phương pháp kiểm nghiệm Theo USP 34 đ i với T3Na BP 2010 đ i với T4Na 2.3.5 Phương pháp đánh giá độ ổn định - Đ i tượng th : lô đóng lọ PE, tránh ánh sáng - Điều ki n th nghi m: Điều ki n lão hóa cấp t c: Nhi t độ 40  2°C; độ ẩm: 75  5% Điều ki n thường: Nhi t độ thường 30  2°C; độ ẩm: 75  5% Footer Page 10 of 148 Header Page 15 of 148 3.3.4 Tạo levothyroxin mononatri (8) Kh o sát phương pháp t o mu i với tác nhân Na2CO3 bão hòa NaHCO3 bão hòa Hi u suất t o mu i phương pháp tương đương (78,0 %) Tạo muối với natri carbonat bão hòa: I HO I I O I OH O HO I I O N H2 O Na2C O3 bh I ONa NH2 I K t qu : tonc: 206,5-208,9 (phân hủy); Rf [CHCl3-MeOH-HCOOH (70:15:15)] = 0,42; Góc quay cực riêng: +18,5o (C = HCl 0,2M / EtOH 96%); Hàm lượng: 97,9 %; Kết phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3458 (NH2); 3060 (C-Hthơm); 2910 (C-Hno); 1591 (C=Ocarboxylat); 1534 (C=C thơm); 1242 1137 (C-Odiaryl ether); 543 436 (C-I) ESI-MS (m/z): 799,4 [M+H]+ (CTPT C15H10I4NNaO4, M = 798,85) 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd, JH3a-H3b = 14,0 Hz, 3JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a = 14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2H3b 13 = 4,5 Hz, H-2); 7,0 (2H, s, H-2’’, H-6’’); 7,8 (2H, s, H-2’, H-6’) C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 35,1 (C-3); 55,0 (C-2); 87,9 (C-3’’, C-5’’); 91,8 (C-3’, C-5’); 124,91 (C-2’’, C-6’’); 139,2 (C-1’); 140,9 (C-2’, C-6’); 148,2 (C-4’’); 151,6 (C-1’’); 153,4 (C-4’); 169,6 (C=Ocarboxylat) Tạo muối với natri bicarbonat bão hòa: H HO I H O I OH N H2 O N aH C O3 bh I I O I 11 Footer Page 15 of 148 O HO ON a NH2 I Header Page 16 of 148 K t qu : tonc: 207-209oC; Rf [CHCl3-MeOH-HCOOH (70:15:15)] = 0,42; Góc quay cực riêng: +18,5o (C=2 HCl 0,2M/ EtOH 96%) 3.4 T ng hợp tinh ch liothyronin mononatri Gồm giai đo n: Tổng hợp liothyronin t 3,5-diiodo-L-thyronin (tinh chế qua mu i dinatri); T o mu i mononatri (kh o sát với tác nhân t o mu i Na2CO3 bão hòa NaHCO3 bão hòa) O HO I O OH I2 /KI , ethyla NH2 O HO I I O I OH NH2 I NaOH 50 % O O HO I I O HCl N OH NH2 I NaO I I O 37 ONa NH2 I Na2 CO3 bh O HO I I O ONa NH2 I Hình 3.9 Sơ đồ ph n ứng t o liothyronin natri (7) K t qu : Liothyronin: tonc: 236-237oC; Rf = 0,32 [NH4OH-2-C3H7OHCH3COOC2H5 (20:35:55)]; HPLC: pic l , thời gian lưu mẫu th mẫu chuẩn (tR = 4,3 phút) Điều ki n sắc ký: Pha động: hỗn hợp (ACN : H2O) = (60 : 40); thêm 0,5 mL acid H3PO4 1000,0 mL T c độ dòng: 1,5 mL/phút Cột C18 Phenomenex 4,6 mm x 25 cm, 5μm; bước sóng 225 nm; Kết phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3178 (OHphenol); 3035 (CHthơm); 2762 (N+-Hmu i nội phân t ); 1599 (C=Ocarboxylat mu i nội phân t ); 1570 1496 (C=Cthơm); 1246 1175 (C-Odiaryl ether); 534 (C-I) ESI-MS (m/z): 651,6 [M+H]+ (CTPT C15H12I3NO4, M = 650,97) 1H-NMR 12 Footer Page 16 of 148 Header Page 17 of 148 (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd, 2JH3a-H3b = 14,0 Hz, JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a = 14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2-H3b = 4,5 Hz, H-2); 6,6 (1H, dd, 3JH5’’-H6’’ = 9,0 Hz, 4JH5’’-H3’’ = 3,0 Hz, H-5’’); 6,8 (1H, d, JH6’’-H5’’ = 9,0 Hz, H-6’’); 7,0 (1H, d, 4JH2’’-H6’’ = 3,0 Hz, H-2’’); 7,8 (2H, s, H-2’, H-6’) 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 34,9 (C-3); 54,9 (C-2); 84,5 (C-3’’); 91,9 (C-3’, C-5’); 115,1 (C-5’’); 116,2 (C-6’’); 124,4 (C-2’’); 138,8 (C-2’, C-6’); 140,8 (C-1’); 148,9 (C-4’); 151,9 (C-1’’); 152,1 (C-4’’); 169,1 (C=Ocarboxylic) Liothyronin mononatri: Kh o sát phương pháp t o mu i mononatri với tác nhân t o mu i Na2CO3 bão hòa NaHCO3 bão hòa Hi u suất t o mu i phương pháp tương đương (71,1 %) K t qu : tonc: 205-206°C (phân hủy); Rf = 0,31 [CHCl3 - MeOH HCOOH (70:15:15)]; Hàm lượng: 98,2%; Kết phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3389 (NH2); 2963 (C-Hthơm); 1618 (C=Ocarboxylat); 1498,08 (C=Cthơm); 1246,27 (C-Odiaryl ether); 498,87 456,01 (C-I) ESI-MS (m/z): 673,64 [M+H]+ (CTPT C15H11I3NNaO4, M = 672,96) 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd, JH3a-H3b = 14,0 Hz, 3JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a = 14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,4 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2H3b = 4,5 Hz, H-2); 6,6 (1H, dd, 3JH6’’-H5’’ = 9,0 Hz, 4JH6’’-H3’’ = 3,0 Hz, H-6’’); 6,8 (1H, d, 3JH5’’-H6’’ = 9,0 Hz, H-5’’); 7,0 (1H, d, 4JH2’’H6’’ = 3,0 Hz, H-2’’); 7,8 (2H, s, H-2’, H-6’) 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 35,3 (C-3); 55,1 (C-2); 84,5 (C-3’’); 92,0 (C-3’, C-5’); 115,1 (C-5’’); 116,1 (C-6’’); 124,4 (C-2’’); 139,1 (C-2’, C-6’); 13 Footer Page 17 of 148 Header Page 18 of 148 140,8 (C-1’); 148,9 (C-4’); 151,8 (C-1’’); 152,1 (C-4’’); 170,0 (C=Ocarboxylat) 3.5 Triển khai quy trình t ng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri L - ty ro s i n N IT R O H Ó A H N O 36 % /H 2S O % N -A C E T Y L H Ó A A c 2O / N a O H N E ST ER H ÓA E t O H / S O C l2 E TH ER H ÓA p -m e t h o x y p h e n o l/p y r i d in T s C l / p y ri d i n K H HÓ A p s u ấ t t h ườ n g H 2/ P d -C D IA Z O H Ó A IO D O H Ó A (o n e p o t) N a N O 2/ H 2S O % , A c O H I 2/K I H B r % /A c O H L O I N HÓ M B O V IO D O H Ó A T O T3 I OD O HÓ A T O T4 I 2/ K I e q , E tN H T O M U I NA T R I T O MU I NA TR I N a H C O bh L io thy ro n in m o n o n a tr i I2/ K I e q , E t N H N a HC O3 bh L e v o t h y ro x i n m o n o n a tr i Hình 3.11 Sơ đồ quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri 14 Footer Page 18 of 148 Header Page 19 of 148 Kh i lượng L-tyrosin: 525,0 g Hi u suất toàn chặng: levothyroxin mononatri đ t 27,4 %, liothyronin mononatri đ t 23,0 % Các ph n ứng cho hi u suất tương đ i ổn định 3.6 Kiểm tra ch t l ợng s n phẩm theo tiêu chuẩn d ợc điển Nguyên li u liothyronin mononatri tổng hợp đ t tiêu chuẩn theo USP 34 levothyroxin mononatri tổng hợp đ t tiêu chuẩn theo BP 2010 3.7 Đánh giá độ n đ nh c a s n phẩm S li u độ ổn định điều ki n lão hóa cấp t c cho thấy s n phẩm biến đổi đáng kể tiêu chất lượng theo dõi Dữ li u độ ổn định dài h n cho thấy hàm lượng giới h n qui định Tuổi thọ levothyroxin mononatri liothyronin mononatri dự đoán 26 tháng 30 tháng 3.8 Đánh giá độc tính c p C hai nguyên li u không độc, không xác định LD50 Ch ng 4: BÀN LU N 4.1 V t ng hợp hóa học 4.1.1 Các phương pháp tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin Qua tổng quan tài li u tìm phương pháp tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri t L-tyrosin Trong có phương pháp không kh o sát: Phương pháp oxy hóa dẫn chất 3,5-diiodo-L-tyrosin theo phương pháp L G Ginger; Phương pháp t o cầu n i diaryl ether t dẫn chất Ltyrosin với acid 4-methoxyphenylboronic, xúc tác Cu(OAc)2 theo tác gi A David Đã kh o sát phương pháp sau đây: 15 Footer Page 19 of 148 Header Page 20 of 148 Ph ng pháp sử dụng ph n ng t o diaryl ether c a Ullmann: Cách 100 năm, Ullmann đưa phương pháp t o ether phenol aryl halogenid Xúc tác cho ph n ứng bột đồng nguyên t hay mu i đồng với lượng lớn, nhi t độ ph n ứng thường cao Trong su t 100 năm qua có hàng trăm công trình tổng hợp ether theo phương pháp t o ether Ullmann cổ điển công b , đặc bi t chưa có công trình áp dụng tổng hợp hormon giáp tr ng Trường hợp aryl halogenid có nhóm ortho t o phức với Cu triazen trifluoroacetamid ph n ứng x y nhi t độ thấp ph n ứng Ullmann cổ điển Trường hợp ph n ứng thay aryl halogenid acid arylboronic ph n ứng x y nhi t độ phòng với xúc tác Cu (II) acetat, triethylamin pyridin Phương pháp áp dụng tổng hợp levothyroxin với hi u suất t o ether 81 % Không d ng đó, đến năm 2010, hai tác gi người Trung Qu c Xiaoyan Liu Songlin Zhang cộng tiếp tục c i tiến phương pháp t o ether Ullmann kết hợp xúc tác Cu/Fe làm gi m đáng kể lượng chất xúc tác Các tác gi tổng hợp thành công cấu trúc diaryl ether hàng chục chất với quy mô lớn hi u suất tương đ i t t Nghiên cứu Xiaoyan Liu Songlin Zhang cộng t o ý tưởng cho trình tìm kiếm phương pháp tổng hợp cấu trúc diaryl ether hormon giáp tr ng Chúng th nghi m ph n ứng t o cấu trúc diaryl ether 3,5-diiodo-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester 4-bromoanisol với xúc tác nguồn đồng ph i t nguồn sắt Nghiên cứu bước đầu cho thấy, ph n ứng có nhiều ưu điểm như: d tiến hành, thích 16 Footer Page 20 of 148 Header Page 21 of 148 hợp để nâng cấp quy trình Tuy nhiên có s vấn đề cần khắc phục tiến hành ph n ứng ph i đặc bi t tránh nước, tất c chất tham gia ph n ứng dung môi ph i đ m b o khan để hợp chất 4-brommoanisol không bị thủy phân t o hợp chất phenol Đồng thời kết thúc ph i tiến hành x lý để tránh ph n ứng thủy phân s n phẩm môi trường kiềm Về chế ph n ứng, theo Ying-Peng Zhang cộng sự, gi i thích sau: PhOH Fe(acac)3 HO-Cu-OPh Fe(acac)3 (a) Ar-X n+ Cu O-Cu-O-Ph Ar HX HX (b) Ar O Fe(acac)3 Ph (c) Hình 4.1 Sơ đồ chế ph n ứng t o cấu trúc diaryl ether phenol aryl halogenid Kết khảo sát ảnh hưởng xúc tác tới hiệu suất phản ứng: xúc tác CuI cho hi u suất ph n ứng cao nhất, điều gi i thích sau: Trong hỗn hợp ph n ứng, đồng tồn t i d ng phức (d) (a): O O Cu O O d HO→Cu←OPh a 17 Footer Page 21 of 148 Header Page 22 of 148 Cu (I) thường t o phức với s ph i trí 2, dùng xúc tác Cu (I) ưu tiên phức (a) Cu (II) thường t o phức với s ph i trí 4, dùng xúc tác Cu (II) ưu tiên phức (d) Phức (a) tham gia vào chu trình ph n ứng theo chế ph n ứng đề cập nên hi u suất ph n ứng cao dùng xúc tác CuI Kết khảo sát ảnh hưởng phối tử: ph i t Fe(acac)3 cho hi u suất ph n ứng cao nhất, gi i thích có cấu trúc phức chất khác hẳn cấu trúc thông thường ph i t khác nên kh tham gia ph n ứng ph i t sắt (III) acetylacetonat cao Mặc dù hi u suất ph n ứng t o ether theo phương pháp Ullmann tương đ i cao thời gian nghiên cứu h n hẹp nguyên li u đắt tiền iod l i dùng t ph n ứng quy trình nên vi c áp dụng để triển khai s n xuất thời điểm chưa thích hợp Ph ng pháp qua hợp ch t nitro c a tác gi J R Chalmers P Bracco: Chúng thực hi n ph n ứng sở kết hợp phương pháp J R Chalmers P Bracco Tuy quy trình có s bước ph n ứng nhiều ph n ứng không khó thực hi n, đặc bi t đến ph n ứng cu i dùng iod nguyên li u đắt tiền hi u suất tính t ph n ứng có dùng iod cao Phương pháp lựa chọn để triển khai tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri Về phản ứng “chìa khóa”- tạo ether quy trình: Ph n ứng kh o sát với phương pháp: phương pháp J R Chalmers phương pháp P Bracco Phương pháp P Bracco cho hi u suất cao phương pháp J R Chalmers, vi c thu s n phẩm 18 Footer Page 22 of 148 Header Page 23 of 148 không ph i qua giai đo n chiết với dung môi dicloromethan, thích hợp triển khai quy mô lớn Tuy nhiên, c hai quy trình ph i lưu ý giai đo n cất lo i pyridin Cơ chế ph n ứng: OH O2 N N O2 O Ts T sC l O2 N N O2 O CH + N H R N 26 Cl R tosylat ester N H3 C O N H 27 O- + H3 C O -me thoxyphe nol - OT s N O2 R OH + O O2 N N u- R = - CH 2- CH (N HAc)C OO E t Hình 4.3 Cơ chế ph n ứng t o cấu trúc diaryl ether phương pháp J R Chalmers P Bracco Cơ chế ph n ứng cho thấy điểm mấu ch t nh hưởng đến hi u suất ph n ứng tỉ l mol 4-methoxyphenol hợp chất dinitro 26, cách thêm 4-methoxyphenol dung môi Vi c hòa tan 4methoxyphenol pyridin t o nucleophile 4-MeO-C6H4O- sau nh t t vào kh i ph n ứng, thúc đẩy ph n ứng x y nhanh hơn, tăng đáng kể hi u suất, gi m lượng 4-methoxyphenol s dụng Phương pháp P Bracco không làm tăng hi u suất ph n ứng mà vi c tách tinh chế chế s n phẩm ph n ứng đơn gi n hóa so với phương pháp J R Chalmers Vi c tiến hành ph n ứng giai đo n pyridin cho thấy quy trình thích hợp để triển khai quy trình quy mô lớn 19 Footer Page 23 of 148 Header Page 24 of 148 Ph ng pháp qua muối iodoni c a G Hillmann: Tổng hợp theo đường qua mu i iodoni qua giai đo n Hi u suất ph n ứng tương đ i cao, hi u suất toàn chặng 33,3% (không tính hi u suất ph n ứng tổng hợp mu i iodoni) Riêng ph n ứng tổng hợp mu i iodoni, dùng đến nguyên li u natri iodat kali iodid đắt tiền, cho hi u suất thấp (12,3%) Hơn nữa, s n phẩm khó tinh chế d gây nổ Do khó làm ph n ứng với cỡ mẻ lớn Một s kh o sát thay đổi tỉ l natri iodat anhydrid acetic không tăng hi u suất ph n ứng 4.1.2 Về trình tổng hợp levothyroxin liothyronin từ 3,5diiodo-L-thyronin Vi c định hướng s n phẩm ph n ứng iodo hóa 3,5-diiodo-Lthyronin (6 T2) để levothyroxin hay liothyronin khác tỷ l mol I2/3,5-diiodo-L-thyronin, t c độ tiến hành ph n ứng iodo hóa nhi t độ ph n ứng Với tỷ l mol I2/3,5-diiodo-L-thyronin = 1/1 trình iodo hóa chủ yếu x y vị trí ortho- so với nhóm OH phenol 3,5-diiodo-L-thyronin Với tỷ l mol I2/3,5diiodo-L-thyronin ≥ t o levothyroxin Để h n chế t o thành levothyroxin ph n ứng tổng hợp liothyronin, cần lưu ý dùng tỉ l mol I2/3,5-diiodo-L-thyronin h n chế t c độ ph n 4.1.3 Phương pháp tạo muối mononatri c a levothyroxin liothyronin Phương pháp t o mu i mononatri levothyroxin (T4) liothyronin (T3) thông qua mu i dinatri b n chất để tinh chế T4 T3 Qua tổng quan tài li u, nhận thấy để t o mu i mononatri tất c tác gi dùng Na2CO3 bão hòa 20 Footer Page 24 of 148 Header Page 25 of 148 Trước tiên áp dụng phương pháp t o mu i mononatri cách cho d ng acid T4 T3 ph n ứng với Na2CO3 bão hòa theo tài li u tham kh o Xét theo lý thuyết giá trị pKa Na2CO3 ph n ứng với c hai nhóm COOH OH T4 T3 Có thể gi i thích trình t o mu i mononatri x y theo thứ tự sau: Khi cho Na2CO3 bão hòa ph n ứng với T4 T3 nhóm có COOH có tính acid m nh nhóm OH phenol ph n ứng trước sinh NaHCO3 Khi dung dịch tồn t i c d ng mu i NaHCO3 (mới t o ra) Na2CO3 (còn dư) NaHCO3 ph n ứng với nhóm COOH T4 T3 t o d ng mu i mononatri Na2CO3 có kh ph n ứng tiếp với nhóm OH phenol để t o mu i dinatri Vì vậy, s n phẩm ph n ứng có c mu i mononatri mu i dinatri T4 T3 Nhưng chỉnh pH kh i ph n ứng 9-10 ~ pKa2(acid carbonic) (= 10) d ng mu i dinatri chuyển hết mu i mononatri: X O HO I I O OH pH < X O NaO I I O N H2 I ON a N H2 I X O HO I I O ON a p H -1 pH > 1 N H2 I M u ối d i n a tr i M u ối m o no n a tr i X = I : L e v ot h y ro x in X = H : L io th y ro n in T phân tích trên, mặt lý thuyết cho thấy dùng NaHCO3 thay cho Na2CO3 để t o mu i mononatri mà không cần dùng acid điều chỉnh pH hỗn hợp ph n ứng 9-10 Do đó, 21 Footer Page 25 of 148 Header Page 26 of 148 th nghi m thấy phương pháp t o mu i mononatri NaHCO3 cho hi u suất tương đương với phương pháp dùng Na2CO3 Tóm lại, quy trình tổng hợp liothyronin mononatri levothyroxin mononatri có nhiều ưu điểm: s dụng hóa chất dung môi rẻ tiền, hi u suất tính t ph n ứng dùng iod cao nhất, ph n ứng d dàng tiến hành nâng cấp quy mô lớn Quá trình tổng hợp không x y trình chuyển cấu hình hay racemic hóa C hai hormon s dụng với liều lượng thấp (50-100µg/ ngày), áp dụng để s n xuất hai hormon t i Vi t Nam 4.2 Khẳng đ nh c u trúc Các hợp chất luận án sau tổng hợp xong nhận d ng cấu trúc phương pháp phổ hồng ngo i (IR), phổ kh i lượng (MS), phổ cộng hưởng t h t nhân proton carbon 13 (1HNMR 13 C-NMR) Vi c xác định cấu trúc chủ yếu chứng minh ph n ứng hóa học x y 4.3 Độ n đ nh Nghiên cứu độ ổn định levothyroxin mononatri liothyronin mononatri thực hi n mẻ, b o qu n điều ki n thường thời gian 18 tháng điều ki n lão hóa cấp t c thời gian tháng Các tiêu theo dõi theo BP 2010 đ i với levothyroxin mononatri theo USP 34 đ i với liothyronin mononatri Kết qu nghiên cứu cho thấy mẫu nguyên li u ổn định sau 18 tháng b o qu n điều ki n thường sau tháng điều ki n lão hóa cấp t c tiêu nghiên cứu Tuổi thọ liothyronin mononatri dự đoán 30 tháng, tuổi thọ levothyroxin mononatri dự đoán 26 tháng 22 Footer Page 26 of 148 Header Page 27 of 148 4.4 Độc tính c p Kết qu nghiên cứu cho thấy với liều levothyroxin mononatri liothyronin mononatri cao 5000 mg/kg sau ngày chuột ho t động, ăn u ng bình thường, phân nước tiểu bình thường, niêm m c hồng hào, lông mượt Chuột không chết nên xác định liều LD50 Vậy levothyroxin mononatri liothyronin mononatri hi n độc tính cấp c th với liều cao 5000 mg/kg K T LU N VÀ Đ XU T K T LU N Đã xây dựng quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri t L-tyrosin s n xuất nước kết hợp phương pháp J R Chalmers P Bracco quy mô phòng thí nghi m với c i tiến sau: - Đã c i tiến ph n ứng kh hóa hợp chất 3,5-dinitro-4-p- methoxyphenoxy-N-acetyl-L-phenylalanin ethyl ester điều ki n áp suất thường đ m b o an toàn s n xuất, nâng cấp quy trình - Đã c i tiến phương pháp t o mu i mononatri levothyroxin liothyronin cách dùng natri bicarbonat bão hòa thay cho natri carbonat bão hòa Lần thực hi n thành công phương pháp t o ether Ullmann tổng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl ester t ph n ứng dẫn chất L-tyrosin 4-bromoanisol với xúc tác đồng (I) iodid ph i t sắt (III) acetylacetonat môi trường kali carbonat dung môi dimethyl formamid 23 Footer Page 27 of 148 Header Page 28 of 148 Đã đánh giá độ ổn định levothyroxin mononatri liothyronin mononatri tổng hợp C hai s n phẩm giữ chất lượng sau tháng b o qu n điều ki n lão hóa cấp t c 18 tháng điều ki n thường Tuổi thọ levothyroxin mononatri liothyronin mononatri dự đoán 26 tháng 30 tháng Đã đánh giá độc tính cấp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri tổng hợp C hai s n phẩm không độc, không xác định LD50 Đ XU T Nghiên cứu triển khai tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri quy mô pilot Tiếp tục nghiên cứu hoàn thi n triển khai tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri theo phương pháp 24 Footer Page 28 of 148 Header Page 29 of 148 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Thị Ngọc Hà, Nguyễn Văn Hân, Đào Nguyệt Sương Huyền, Nguyễn Đình Luyện (2013), “Nghiên cứu tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin từ L-tyrosin làm nguyên liệu tổng hợp hormon giáp trạng”, Tạp chí Dược học, số 8-2013, tr 41-45 Nguyễn Thị Ngọc Hà, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Văn Hân, Nguyễn Đình Luyện (2014), “Tổng hợp cấu trúc diaryl ether từ 4-methoxyphenol N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester với xúc tác p-toluensulfonyl clorid- Một phương pháp tổng hợp hormon tuyến giáp”, Tạp chí Nghiên cứu dược Thông tin thuốc, số 1-2014, tr 22-24 Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Thị Ngọc Hà, Nguyễn Văn Hân, Đào Nguyệt Sương Huyền, Nguyễn Đình Luyện (2014), “Nghiên cứu tổng hợp liothyronin từ L-tyrosin làm nguyên liệu sản xuất thuốc”, Tạp chí Hóa học, số 1-2014, tr.53 Nguyễn Thị Ngọc Hà, Nguyễn Văn Hải, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Văn Hân, Nguyễn Đình Luyện (2014), “Phương pháp tạo cấu trúc diaryl ether tổng hợp hormon tuyến giáp từ L-tyrosin”, Tạp chí Dược học, số 8-2014, tr 36-39 Footer Page 29 of 148 ... Vậy levothyroxin mononatri liothyronin mononatri hi n độc tính cấp c th với liều cao 5000 mg/kg K T LU N VÀ Đ XU T K T LU N Đã xây dựng quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri. .. Kh o sát phương pháp tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri t L-tyrosin Chọn phương pháp phù hợp để triển khai tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri đ t tiêu chuẩn... Nghiên cứu triển khai tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri quy mô pilot Tiếp tục nghiên cứu hoàn thi n triển khai tổng hợp levothyroxin mononatri liothyronin mononatri theo phương