TR I H C QU C GIA HÀ N I NGă I H C KHOA H C T NHIÊN LÊăTH XUÂN XÁCă NHăHẨMăL NG PARABENS TRONG TH C PH MăVẨăM PH M B NG S CăKụăL NG HI UăN NGăCAOă(HPLC) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mư s : 60440118 LU NăV NăTH CăS ăKHOAăH C Ng ih ng d n khoa h c PGS.TS PH M TH MAI Hà N i – 2016 NG C L I C Mă N L i đ u tiên cho em g i l i c m n sâu s c t i PGS.TS Ph m Th Ng c Mai đư t n tình h ng d n t o m i u ki n giúp đ em su t trình th c hi n đ tài vi t lu n v n Tôi xin đ c g i l i c m n chân thành t i Ban lưnh đ o Vi n Ki m nghi m An toàn V sinh Th c ph m Qu c gia anh ch , b n công tác t i Khoa Ch t l ng Ph gia ch t h tr ch bi n th c ph m – Vi n An toàn V sinh Th c ph m Qu c gia đư t o u ki n thu n l i cho đ c h c t p nghiên c u môi tr ng hi n đ i Em xin bày t lòng bi t n t i th y cô giáo gi ng d y t i Khoa Hoá, đ c bi t th y cô B môn Hoá Phân tích, đư cho em nh ng ki n th c quý giá trình h c t p th c hi n đ tài Tôi c ng xin g i l i c m n anh ch , b n bè c a t p th l p cao h c hoá K24, đ c bi t nh ng ng i b n nhóm Hoá Phân tích K24 đư giúp đ , chia s nh ng khó kh n su t trình h c t p th c hi n đ tài Cu i xin g i l i c m n t i gia đình b n bè đư đ ng viên, chia s m i khó kh n Hà N i, tháng 12 n m 2016 H c viên LêăTh Xuơn M CăL C T V Nă CH 1.1 NGăI T NG QUAN T ng quan v h p ch t parabens 1.1.1 Công th c phân t tính ch t v t lý c a parabens 1.1.2 Tác d ng kháng khu n c a parabens 1.1.3 Tác đ ng c a parabens đ i v i s c kh e 1.1.3.1 Gây d ng da 6 1.1.3.2 Hi n t ng lưo hóa da 1.1.3.3 M i liên h v i gi a parabens b nh ung th vú 1.2 Tình hình s d ng parabens th gi i Vi t Nam Các ph 1.3 1.3.1 Ph 7 ng pháp phân tích parabens ng pháp n di mao qu n (CE) 1.3.2 Ph ng pháp s c ký l ng 1.3.2.1 S c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) ghép n i detector UV-VIS 1.3.2.2 Ph ng pháp s c ký l ng kh i ph (LC-MS/MS) 1.3.3 Ph ng pháp s c ký khí kh i ph (GC-MS) 10 10 11 13 1.3.4 i c ng v ph ng pháp s c ký l ng 14 1.3.4.1 Nguyên t c chung c a ph ng pháp s c ký l ng 14 1.3.4.2 M t s đ i l ng đ c tr ng c a s c ký l ng 15 1.4 Các ph ng pháp x lý m uError! Boo CH 2.1 2.2 NGă2.ăă IăT NG, N IăDUNGăVẨăPH NGăPHÁPăNGHIÊN C UError! Bookm M c tiêu nghiên c uError! Boo it ng nghiên c uError! Boo 2.3 N i dung nghiên c uError! Boo 2.4 Hóa ch t, d ng c thi t b Error! Boo 2.4.1 Hóa ch t Error 2.4.2 D ng c Error 2.4.3 Thi t b Error 2.5 Ph ng pháp nghiên c uError! Boo 2.5.1 Xác đ nh u ki n phân tích 2.5.1.1 Xác đ nh thông s cho detector kh i ph 2.5.1.2 Kh o sát u ki n đo s c ký 2.5.1.3 Kh o sát u ki n chi t m u 2.5.2 Xác nh n giá tr s d ng c a ph ng pháp 2.5.2.1 Xây d ng đ ng chu n 2.5.2.2 l p l i (đ ch m) 2.5.2.3 thu h i (đ đúng) 2.5.2.4 Gi i h n phát hi n (LOD) gi i h n đ nh l ng (LOQ) CH NGă3.ăK T QU VẨăTH O LU N Error! Bookmark not defined 3.1 Error Error Error Error Error Error Error Error Error Xác đ nh u ki n phân tíchError! Boo 3.1.1 Xác đ nh thông s c a detector kh i ph Error 3.1.2 Kh o sát u ki n đo máy s c ký l ng Error 3.1.2.1 Kh o sát ch ng trình r a gi i Error 3.1.2.2 Kh o sát n ng đ dung d ch đ m Error 3.1.3 Kh o sát u ki n chi t m u Error 3.1.3.1 Kh o sát lo i dung môi chi t Error 3.1.3.2 Kh o sát thành ph n dung môi chi t MeOH:H2O Error 3.1.3.3 Kh o sát th i gian rung siêu âm Error 3.1.3.4 Kh o sát nhi t đ rung siêu âm Error 3.2 ánh giá ph ng pháp phân tíchError! Boo 3.2.1 Xây d ng đ 3.2.3 thu h i (đ đúng) c a ph ng chu n Error ng pháp Error 3.2.4 Gi i h n phát hi n (LOD) gi i h n đ nh l ng (LOQ) Error 3.3 Phân tích parabens m u m ph m th c ph m ch c n ngError! Boo K T LU N Error! Bookmark not defined TẨIăLI U THAM KH O 16 Ch ngă2 Ch ngă3 DANHăSÁCHăB NG BI U B ng B ng n ng đ dung d ch chu n g c c a parabens Error! Bookmark not defined B ng B ng u ki n c a detector kh i ph Error! Bookmark not defined B ng B ng u ki n ch ng trình gradientError! Bookmark not defined B ng 3 nh h ng c a gradient đ n đ phân gi i c a Iso-PrP PrP Error! Bookmark not defined B ng nh h ng c a gradient đ n c ng đ tín hi u m nh đ nh l ng c a parabens Error! Bookmark not defined B ng Kh o sát lo i dung môi chi t Error! Bookmark not defined B ng S ph thu c thành ph n dung môi chi t hàm l ng MeP, PrP Error! Bookmark not defined B ng Kh o sát nh h ng c a dung môi chi tError! Bookmark not defined B ng S ph thu c gi a th i gian rung siêu âm hàm l ng MeP, PrP Error! Bookmark not defined B ng Kh o sát th i gian rung siêu âmError! Bookmark not defined B ng 10 nh h ng c a nhi t đ rung siêu âm t i hi u qu chi t MeP, PrP Error! Bookmark not defined B ng 11 Kh o sát nh h ng c a nhi t đ rung siêu âm Error! Bookmark not defined B ng 12 ch ch c a m chu nError! Bookmark not defined B ng 13 Hàm l ng parabens m u kh o sát Error! Bookmark not defined B ng 14 N ng đ chu n thêm vào t ng n n m u kh o sát đ l p l i Error! Bookmark not defined B ng 15 l p l i c a ph ng pháp phân tíchError! Bookmark not defined B ng 16 thu h i c a ph ng pháp phân tíchError! Bookmark not defined B ng 17 Gi i h n phát hi n gi i h n đ nh l ng c a ph ng pháp Error! Bookmark not defined B ng 18 Hàm l ng parabens m u TPCN Error! Bookmark not defined B ng 19 Hàm l ng parabens m u m ph m Error! Bookmark not defined Ch ngă1 Ch ngă2 Ch ngă3 DANH SÁCHăHỊNH Hình 1 Công th c phân t c a methylparaben Hình Công th c phân t c a propylparaben Hình Công th c phân t c a isopropylparaben Hình Công th c phân t c a isobutylparaben Hình Công th c phân t c a phenylparaben Hình Công th c phân t c a benzylparaben Hình Công th c phân t c a pentylparaben Hình C ch gây h i ADN da c a h p ch t parabens Hình Mô hình phân m nh c a parabens phân tích LCMS/MS 12 Hình 10 S đ c u t o h th ng UPLC-MS/MS 15 Hình L c đ quy trình phân tích m u theo d ki n Error! Bookmark not defined Hình S c đ kh o sát ch ng trình r a gi iError! Bookmark not defined Hình S c đ kh o sát thành ph n dung d ch đ mError! Bookmark not defined Hình 3 Bi u đ kh o sát lo i dung môi chi tError! Bookmark not defined Hình S c đ kh o sát lo i dung môi chi tError! Bookmark not defined Hình Bi u đ s ph thu c c a đ thu h i thành ph n dung môi chi t Error! Bookmark not defined Hình Bi u đ s ph thu c c a hàm l ng MeP, PrP th i gian rung siêu âm Error! Bookmark not defined Hình Bi u đ kh o sát nh h ng c a đ thu h i th i gian rung siêu âm Error! Bookmark not defined Hình Quy trình x lý m u phân tíchError! Bookmark not defined Hình ng chu n c a parabens theo di n tích pic Error! Bookmark not defined Hình 10 Bi u đ hàm l ng (%) parbens m u TPCN Error! Bookmark not defined Hình 11 Bi u đ hàm l ng parabens có m ph m Error! Bookmark not defined DANH M CăCÁCăCH VI T T T Tênăvi tăt t Tênăti ngăanh TênăTi ngăvi t MeP Methylparaben Methylparaben PrP Propylparaben Propylparaben Iso-PrP Isopropylparaben Isopropylparaben Iso-BuP Isobutylparaben Isobutylparaben BeP Benzylparaben Benzylparaben PeP Pentylparaben Pentylparaben PheP Phenylparaben Phenylparaben % RSD ACN GC–MS HPLC LC–MS % Relative standard deviation % l ch chu n t ng đ i Acetonitrile Acetonitril Gas chromatography - S c ký khí kh i ph Mass spectroscopy High performance liquid Chromatography Liquid Chromatography - S c ký l ng hi u n ng cao S c ký l ng kh i ph Mass Spectroscopy Gi i h n phát hi n LOD Limit of Detection LOQ Limit of Quantification MeOH Methanol UV-VIS Ultraviolet-Visible R Relative coefficient Ppm Parts per million Ph n tri u AOAC Association of Official H i phân tích hoá Gi i h n đ nh l ng Methanol T ngo i kh ki n H s t ng quan Analytical Chemist h c Lu n v n Th c s Chuyên ngành: Hóa Phân tích TăV Nă Ch t b o qu n nh ng hóa ch t t nhiên hay t ng h p đ c thêm vào th c ph m, d c ph m, m u ph m sinh h c, v.v đ ng n ng a ho c làm ch m l i s th i r a, h h ng gây b i s phát tri n c a vi sinh v t, haycác thay đ i không mong mu n v m t hóa h c c a s n ph m Parabens tên g i chung c a nhóm ch t b o qu n hóa h c, đ c s d ng ph bi n lâu đ i V m t hóa h c, parabens m t lo t este c a axit parahydroxybenzoic hay đ c g i acid 4-hydroxybenzoic Parabens có tính ch t kháng khu n kháng n m nên đ c dùng làm ch t b o qu n đ ng n ng a s nhi m khu n (do n m ho c vi khu n) h n ch s phân h y c a ho t ch t d n đ n gi m hi u qu c a d c ph m, th c ph m ch c n ng, m ph m G n đâycó nhi u nghiên c u cho th y, h p ch t parabens có th ho t đ ng t ng t nh hormone oestrogen t bào c a c th Các ho t đ ng có liên quan nh t đ nh đ n b nh ung th vú Nh ng thông tin làm cho nhi u ph n lo l ng, ng i tiêu dùng đ c khuy n cáo h n ch s d ng lo i m ph m xung quanh cánh tay, ng c nh ng vùng da nh y c m Parabens c ng có th gây d ng da đ i v i nh ng ng i có c đ a d ng hay m n c m Ngoài có thông tin v vi c parabens làm thúc đ y trình lưo hóa da d i tác đ ng c a ánh n ng m t tr i Tr c nh ng b ng ch ng v tác h i c a parabens đ i v i s c kh econ ng i, C c Qu n lý D c đư ban hành công v n s 6577/QLD-MP quy đ nh v vi c s d ng m t s ch t m ph m Theo đó, có parabens đư b c m s d ng Vi t Nam t ngày 30/7/2015là: isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben pentylparaben C ng theo công v n này, propylparaben mu i đ c phép dùng riêng l v i n ng đ t i đa 0,4% (tính theo acid), d ng h n h p parabens khác v i t ng n ng đ t i đa 0,8% (tính theo acid).Th i h n công b đ i v i s n ph m m i s n xu t n c, nh p kh u đ n h t ngày 31/12/2015.Các s n ph m s n xu t n c, nh p kh u đ c phép l u hành th tr ng đ n h t ngày 30/6/2016 V i yêu c u th c t hi n nay,vi c ki m soát ch t b o qu n parabens r t c n thi t Trong ph m vi lu n v n th c s “Xácă đ nhă hƠmă l ngă prabensă trongă th căph măvƠăm ăph măb ngăs căkýăl ngăhi uăn ngăcaoă(HPLC)” ti n hành kh o sát u ki n HPLC thích h p đ đ nh tính, đ nh l parabens, bao g m: methylparaben, propylparaben, ng ch t isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben, pentylparaben M cătiêuănghiênăc u: Lê Th Xuân i h c KHTN Hà N i Lu n v n Th c s  Xây d ng chu n hóa ph b ngph  Chuyên ngành: Hóa Phân tích ng pháp đ nh l ng ch t paraben nêu ng pháp s c ký l ng k t h p v i đ u dò kh i ph ng d ng ph ng pháp đ xác đ nh hàm l ng parabens m t s m u m ph m, th c ph m ch c n ng Lê Th Xuân i h c KHTN Hà N i Lu n v n Th c s  Kh i l Chuyên ngành: Hóa Phân tích ng mol phân t : 194,23 g/mol  Công th c c u t o Hình 1.4: Hình Công th c phân t c a isobutylparaben  Phenylparaben  Danh pháp IUPAC: phenyl 4-hydroxybenzoate  Công th c phân t : C13H10O3  Kh i l ng mol phân t : 214,22 g/mol  Công th c c u t o Hình 1.5: Hình Công th c phân t c a phenylparaben  Bezylparaben  Danh pháp IUPAC: benzyl 4-hydroxybenzoate  Công th c phân t : C14H12O3  Kh i l ng mol phân t : 228,24 g/mol  Công th c c u t o Hình 1.6: Hình Công th c phân t c a benzylparaben  tan n c 25oC: 0,05 g/100 mL  Pentylparaben Lê Th Xuân i h c KHTN Hà N i Lu n v n Th c s Chuyên ngành: Hóa Phân tích  Danh pháp IUPAC: pentyl 4-hydroxybenzoate  Công th c phân t : C12H16O3  Kh i l ng mol phân t : 208,25 g/mol  Công th c c u t o Hình 1.7: Hình Công th c phân t c a pentylparaben 1.1.2 Tác d ng kháng khu n c a parabens Các parabens có tác d ng sát khu n (tiêu di t nhi u lo i vi khu n khác nhau) di t nhi u lo i vi n m Parabens có ho t tính kháng khu n chúng làm thay đ i đ c tính c a màng t bào, n cho c u trúc l p màng t bào thay đ i cho phép ch t tan t bào b rò r ngoài[24] Tác gi Steinberg Doron c ng s [24] đư nghiên c u đ c tính kháng khu n c a b n parabens là: methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben đ i v i vi khu n Streptococcus sobrinus gây b nh sâu r ng K t qu thu đ c cho th y, theo chi u t ng c a chu i akyl kh n ng kháng khu n c a parabens t ng d n Tuy nhiên, theo chi u t ng c a chu i ankyl kh n ng tan n c gi m d n, vi khu n th ng phát tri n môi tr ng n c Do v y đ ng phân có chu i alkyl ng n th ng đ c l a ch n s d ng v i m c đích b o qu n t ng hi u qu b o qu n, parabens đ c s d ng k t h p v i Thông th ng, ng i ta ph i h p hai paraben tr lên, thí d nh ph i h p 0,18% methyl parabens, 0,02% propyl parabens đ làm ch t b o qu n sát khu n nhi u lo i thu c tiêm chích ho c ph i h p parabens v i m t s hóa ch t khác Tr c đây, parabens đư đ c s d ng r ng rưi thu c ch a b nh, th ng hàm l ng cao, kho ng 1% đ n 5% [5] Khi nh ng tác h i c a parabens đ i v i s c kh e ng i đ c phát hi n, vi c s d ng parabens s n ph m thu c ch a b nh đư gi m xu ng So v i d c ph m, hàm l ng parabens s d ng s n ph m m ph m th ng n ng đ th p h n (kho ng 0,1% đ n l0,8%), hi n nay, chúng v n lo i ch t b o qu n đ c s d ng nhi u nh t nhi u lí do: giá thành r , hi u qu b o qu n t t, không màu, không mùi, không làm thay đ i tính ch t c a s n ph m 1.1.3 Tácăđ ng c aăparabensăđ i v i s c kh e 1.1.3.1 Gây d ng da Lê Th Xuân i h c KHTN Hà N i Lu n v n Th c s Chuyên ngành: Hóa Phân tích Tác gi Christen M Mowad [9] đư trình bày báo c a v hai tr ng h p viêm da d ng ti p xúc gây b i parabens, thông qua vi c s d ng s n ph m hàng ngày s a t m, d u g i đ u, n c r a tay, v.v Nghiên c u c ng ch r ng, benzylparaben ch t có kh n ng gây d ng m nh nh t, có th kh i l ng phân t l n h n Trong m t báo cáo khác, tác gi James E Nagel c ng s [13] đư trình bày v hai tr ng h p d ng v i parabens b ng đ ng tiêm d i da C ch gây d ng c a parabens hi n v n ch a rõ ràng, nh ng nhi u tr ng h p d ng v i ch t b o qu n đư đ c ghi nh n M t cu c u tra n m 1973, ti nhành 1200 cá nhân đ c th c hi n b i The North American Contact Dermatitis Group đư cho th y t l d ng v i parabens 3% [13] 1.1.3.2 Hi n t ng lưo hóa da Theo k t qu nghiên c u c a rác gi Osamu Handa c ng s [19], methylparaben t ng c ng kh n ng gây h i c a tia UVB đ i v i t bào s ng da Tia UVB v i c ng đ 15 mJ/cm2 30 mJ/cm2 (t ng ng v i c ng đ UVB trung bình ti p xúc v i ánh sáng m t tr i vòng phút vào ngày đ p tr i châu Âu) h u nh không gây h i đ n t bào s ng Tuy nhiên k t h p s d ng methylparaben 0,003% vi c chi u x b ng tia UVB v i c ng đ nh l ng t bào s ng b ho i t t ng lên đáng k Theo k t qu m t nghiên c u khác c a tác gi Yoshinori Okamoto c ng s [28], methylparaben s n ph m chuy n hóa c a methylparaben, k t h p v i ánh sáng m t tr i có th gây t n h i đ i v i ADN da C ch tác đ ng đ c mô t nh Hình1.8: Hình C ch gây h i ADN da c a h p ch t parabens 1.1.3.3 M i liên h v i gi a parabens b nh ung th vú H n 50 n m nay, h p ch t parabens đư đ c bi t đ n có ho t tính oestrogen Oestrogen đ c bi t có nh h ng đ n t l m c b nh ung th vú vi c ng ng ho t đ ng c a oestrogen v n ph ng pháp u tiên u tr cho kh i u vú nh y c m v i hormone Nhóm tác gi Byford J.E c ng s [6] ti n hành nghiên c u ho t tính oestrogen c a h p ch t parabens (methylparaben, ethylparaben, n-propylparaben, n-butylparaben) t bào ung th vú nuôi c y MCF7 Parabens có th di Lê Th Xuân i h c KHTN Hà N i Lu n v n Th c s Chuyên ngành: Hóa Phân tích chuy n [3H] oestradiol t th th c a t bào t ng MCF7 Paraben c ng có th t ng bi u hi n c a gen quy đ nh oestrogen t ng kh n ng s n sinh t bào Liên k t c a parabens v i t bào MCF7 t ng lên theo chi u dài chu i alkyl, nhiên liên k t y u K t qu c ng phù h p v i báo cáo nghiên c u v tính liên k t áp d ng v i h t cung c a chu t Theo tác gi Routledge E.J c ng s [20], t t c parabens bao g m: methylparaben, ethylparaben, n-propylparaben, butylparaben đ u có ho t tính t ng t oestrogen Trong methyl paraben ch t có ho t tính oestrogen y u nh t v i c ng đ th p h n kho ng 2500000 l n so v i 17-estradiol (m t lo i oestrogen có t nhiên) Ho t tính oestrogen m nh lên theo chi u t ng c a chu i alkyl, c th ethylparaben, propylparaben butylparaben l n l t có c ng đ th p h n kho ng 150000 l n, 30000 l n, 10000 so v i 17-estradiol Nghiên c u c ng ch r ng, c ng đ ho t tính oestrogen c a parabens cá th chu t th p h n đ n l n so v i c ng đ th nghi m ng nghi m Nguyên nhân đ c gi i thích parabens nhanh chóng đ c đào th i thông qua h ti t c a c th M t nghiên c u khác c a tác gi Thuy T.B Vo c ng s [25] ti n hành đ i v i cá th chu t giai đo n t 21-40 ngày tu i c ng cho k t qu t ng t Ho t đ ng estrgen m nh lên theo th t sau: ethylparaben