ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ XUÂN XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PARABENS TRONG THỰC PHẨM VÀ MỸ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học PGS.TS PHẠM THỊ NGỌC MAI Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia anh chị, bạn công tác Khoa Chất lượng Phụ gia chất hỗ trợ chế biến thực phẩm – Viện An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu môi trường đại Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giáo giảng dạy Khoa Hoá, đặc biệt thầy cô Bộ môn Hoá Phân tích, cho em kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt người bạn nhóm Hoá Phân tích K24 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt trình học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Lê Thị Xuân MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hợp chất parabens 1.1.1 Công thức phân tử tính chất vật lý parabens 1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn parabens 1.1.3 Tác động parabens sức khỏe 1.1.3.1 Gây dị ứng da 6 1.1.3.2 Hiện tượng lão hóa da 1.1.3.3 Mối liên hệ với parabens bệnh ung thư vú 1.2 Tình hình sử dụng parabens giới Việt Nam 1.3 7 Các phương pháp phân tích parabens 1.3.1 Phương pháp điện di mao quản (CE) 1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng 1.3.2.1 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detector UV-VIS 1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 1.3.3 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 10 10 11 13 1.3.4 Đại cương phương pháp sắc ký lỏng 14 1.3.4.1 Nguyên tắc chung phương pháp sắc ký lỏng 14 1.3.4.2 Một số đại lượng đặc trưng sắc ký lỏng 15 1.4 Các phương pháp xử lý mẫuError! Boo CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookm 2.1 Mục tiêu nghiên cứuError! Boo 2.2 Đối tượng nghiên cứuError! Boo 2.3 Nội dung nghiên cứuError! Boo 2.4 Hóa chất, dụng cụ thiết bịError! Boo 2.4.1 Hóa chất Error 2.4.2 Dụng cụ Error 2.4.3 Thiết bị Error 2.5 Phương pháp nghiên cứuError! Boo 2.5.1 Xác định điều kiện phân tích 2.5.1.1 Xác định thông số cho detector khối phổ 2.5.1.2 Khảo sát điều kiện đo sắc ký 2.5.1.3 Khảo sát điều kiện chiết mẫu 2.5.2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 2.5.2.1 Xây dựng đường chuẩn 2.5.2.2 Độ lặp lại (độ chụm) 2.5.2.3 Độ thu hồi (độ đúng) 2.5.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Error Error Error Error Error Error Error Error Error Xác định điều kiện phân tíchError! Boo 3.1.1 Xác định thông số detector khối phổ Error 3.1.2 Khảo sát điều kiện đo máy sắc ký lỏng Error 3.1.2.1 Khảo sát chương trình rửa giải Error 3.1.2.2 Khảo sát nồng độ dung dịch đệm Error 3.1.3 Khảo sát điều kiện chiết mẫu Error 3.1.3.1 Khảo sát loại dung môi chiết Error 3.1.3.2 Khảo sát thành phần dung môi chiết MeOH:H2O Error 3.1.3.3 Khảo sát thời gian rung siêu âm Error 3.1.3.4 Khảo sát nhiệt độ rung siêu âm Error 3.2 Đánh giá phương pháp phân tíchError! Boo 3.2.1 Xây dựng đường chuẩn Error 3.2.3 Độ thu hồi (độ đúng) phương pháp Error 3.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Error 3.3 Phân tích parabens mẫu mỹ phẩm thực phẩm chức năngError! Boo KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 16 DANH SÁCH BẢNG BIỀU Chƣơng Bảng Bảng nồng độ dung dịch chuẩn gốc parabens Error! Bookmark not defined Chƣơng Bảng Bảng điều kiện detector khối phổError! Bookmark not defined Bảng Bảng điều kiện chương trình gradientError! Bookmark not defined Bảng 3 Ảnh hưởng gradient đến độ phân giải Iso-PrP PrP Error! Bookmark not defined Bảng Ảnh hưởng gradient đến cường độ tín hiệu mảnh định lượng parabens Error! Bookmark not defined Bảng Khảo sát loại dung môi chiết Error! Bookmark not defined Bảng Sự phụ thuộc thành phần dung môi chiết hàm lượng MeP, PrP Error! Bookmark not defined Bảng Khảo sát ảnh hưởng dung môi chiếtError! Bookmark not defined Bảng Sự phụ thuộc thời gian rung siêu âm hàm lượng MeP, PrP Error! Bookmark not defined Bảng Khảo sát thời gian rung siêu âmError! Bookmark not defined Bảng 10 Ảnh hưởng nhiệt độ rung siêu âm tới hiệu chiết MeP, PrP Error! Bookmark not defined Bảng 11 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ rung siêu âm Error! Bookmark not defined Bảng 12.Độ chệch điểm chuẩnError! Bookmark not defined Bảng 13 Hàm lượng parabens mẫu khảo sát Error! Bookmark not defined Bảng 14 Nồng độ chuẩn thêm vào mẫu khảo sát độ lặp lại Error! Bookmark not defined Bảng 15 Độ lặp lại phương pháp phân tíchError! Bookmark not defined Bảng 16 Độ thu hồi phương pháp phân tíchError! Bookmark not defined Bảng 17 Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Error! Bookmark not defined Bảng 18 Hàm lượng parabens mẫu TPCN Error! Bookmark not defined Bảng 19 Hàm lượng parabens mẫu mỹ phẩm Error! Bookmark not defined DANH SÁCH HÌNH Chƣơng Hình 1 Công thức phân tử methylparaben Hình Công thức phân tử propylparaben Hình Công thức phân tử isopropylparaben Hình Công thức phân tử isobutylparaben Hình Công thức phân tử phenylparaben Hình Công thức phân tử benzylparaben Hình Công thức phân tử pentylparaben Hình Cơ chế gây hại ADN da hợp chất parabens Hình Mô hình phân mảnh parabens phân tích LCMS/MS 12 Hình 10 Sơ đồ cấu tạo hệ thống UPLC-MS/MS 15 Chƣơng Hình Lược đồ quy trình phân tích mẫu theo dự kiến Error! Bookmark not defined Chƣơng Hình Sắc đồ khảo sát chương trình rửa giảiError! Bookmark not defined Hình Sắc đồ khảo sát thành phần dung dịch đệmError! Bookmark not defined Hình 3 Biều đồ khảo sát loại dung môi chiếtError! Bookmark not defined Hình Sắc đồ khảo sát loại dung môi chiếtError! Bookmark not defined Hình Biểu đồ phụ thuộc độ thu hồi thành phần dung môi chiết Error! Bookmark not defined Hình Biều đồ phụ thuộc hàm lượng MeP, PrP thời gian rung siêu âm Error! Bookmark not defined Hình Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng độ thu hồi thời gian rung siêu âm Error! Bookmark not defined Hình Quy trình xử lý mẫu phân tíchError! Bookmark not defined Hình Đường chuẩn parabens theo diện tích pic Error! Bookmark not defined Hình 10 Biểu đồ hàm lượng (%) parbens mẫu TPCN Error! Bookmark not defined Hình 11 Biểu đồ hàm lượng parabens có mỹ phẩm Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên Tiếng việt MeP Methylparaben Methylparaben PrP Propylparaben Propylparaben Iso-PrP Isopropylparaben Isopropylparaben Iso-BuP Isobutylparaben Isobutylparaben BeP Benzylparaben Benzylparaben PeP Pentylparaben Pentylparaben PheP Phenylparaben Phenylparaben % Relative standard % Độ lệch chuẩn % RSD ACN GC–MS HPLC LC–MS deviation tương đối Acetonitrile Acetonitril Gas chromatography - Sắc ký khí khối Mass spectroscopy High performance liquid Chromatography Liquid Chromatography Mass Spectroscopy phổ Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng khối phổ Giới hạn phát LOD Limit of Detection LOQ Limit of Quantification MeOH Methanol UV-VIS Ultraviolet-Visible R Relative coefficient Hệ số tương quan Ppm Parts per million Phần triệu AOAC Association of Official Hội phân tích hoá Giới hạn định lượng Methanol Tử ngoại khả kiến Analytical Chemist học Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích ĐẶT VẤN ĐỀ Chất bảo quản hóa chất tự nhiên hay tổng hợp thêm vào thực phẩm, dược phẩm, mẫu phẩm sinh học, v.v để ngăn ngừa làm chậm lại thối rữa, hư hỏng gây phát triển vi sinh vật, haycác thay đổi không mong muốn mặt hóa học sản phẩm Parabens tên gọi chung nhóm chất bảo quản hóa học, sử dụng phổ biến lâu đời Về mặt hóa học, parabens loạt este axit parahydroxybenzoic hay gọi acid 4-hydroxybenzoic Parabens có tính chất kháng khuẩn kháng nấm nên dùng làm chất bảo quản để ngăn ngừa nhiễm khuẩn (do nấm vi khuẩn) hạn chế phân hủy hoạt chất dẫn đến giảm hiệu dược phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm Gần đâycó nhiều nghiên cứu cho thấy, hợp chất parabens hoạt động tương tự hormone oestrogen tế bào thể Các hoạt động có liên quan định đến bệnh ung thư vú Những thông tin làm cho nhiều phụ nữ lo lắng, người tiêu dùng khuyến cáo hạn chế sử dụng loại mỹ phẩm xung quanh cánh tay, ngực vùng da nhạy cảm Parabens gây dị ứng da người có địa dị ứng hay mẫn cảm Ngoài có thông tin việc parabens làm thúc đẩy trình lão hóa da tác động ánh nắng mặt trời Trước chứng tác hại parabens sức khỏecon người, Cục Quản lý Dược ban hành công văn số 6577/QLD-MP quy định việc sử dụng số chất mỹ phẩm Theo đó, có parabens bị cấm sử dụng Việt Nam từ ngày 30/7/2015là: isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben pentylparaben Cũng theo công văn này, propylparaben muối phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối đa 0,4% (tính theo acid), dạng hỗn hợp parabens khác với tổng nồng độ tối đa 0,8% (tính theo acid).Thời hạn công bố sản phẩm sản xuất nước, nhập đến hết ngày 31/12/2015.Các sản phẩm sản xuất nước, nhập phép lưu hành thị trường đến hết ngày 30/6/2016 Với yêu cầu thực tế nay,việc kiểm soát chất bảo quản parabens cần thiết Trong phạm vi luận văn thạc sĩ “Xác định hàm lƣợng prabens thực phẩm mỹ phẩm sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)” tiến hành khảo sát điều kiện HPLC thích hợp để định tính, định lượng chất parabens, bao gồm: methylparaben, propylparaben, isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben, pentylparaben Mục tiêu nghiên cứu: Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích  Xây dựng chuẩn hóa phương pháp định lượng chất paraben nêu bằngphương pháp sắc ký lỏng kết hợp với đầu dò khối phổ  Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng parabens số mẫu mỹ phẩm, thực phẩm chức Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích  Khối lượng mol phân tử: 194,23 g/mol  Công thức cấu tạo Hình 1.4: Hình Công thức phân tử isobutylparaben  Phenylparaben  Danh pháp IUPAC: phenyl 4-hydroxybenzoate  Công thức phân tử: C13H10O3  Khối lượng mol phân tử: 214,22 g/mol  Công thức cấu tạo Hình 1.5: Hình Công thức phân tử phenylparaben  Bezylparaben  Danh pháp IUPAC: benzyl 4-hydroxybenzoate  Công thức phân tử: C14H12O3  Khối lượng mol phân tử: 228,24 g/mol  Công thức cấu tạo Hình 1.6: Hình Công thức phân tử benzylparaben  Độ tan nước 25oC: 0,05 g/100 mL  Pentylparaben Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích  Danh pháp IUPAC: pentyl 4-hydroxybenzoate  Công thức phân tử: C12H16O3  Khối lượng mol phân tử: 208,25 g/mol  Công thức cấu tạo Hình 1.7: Hình Công thức phân tử pentylparaben 1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn parabens Các parabens có tác dụng sát khuẩn (tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn khác nhau) diệt nhiều loại vi nấm Parabens có hoạt tính kháng khuẩn chúng làm thay đổi đặc tính màng tế bào, khiến cho cấu trúc lớp màng tế bào thay đổi cho phép chất tan tế bào bị rò rỉ ngoài[24] Tác giả Steinberg Doron cộng sự[24] nghiên cứu đặc tính kháng khuẩn bốn parabens là: methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben vi khuẩn Streptococcus sobrinus gây bệnh sâu Kết thu cho thấy, theo chiều tăng chuỗi akyl khả kháng khuẩn parabens tăng dần Tuy nhiên, theo chiều tăng chuỗi ankyl khả tan nước giảm dần, vi khuẩn thường phát triển môi trường nước Do đồng phân có chuỗi alkyl ngắn thường lựa chọn sử dụng với mục đích bảo quản Để tăng hiệu bảo quản, parabens sử dụng kết hợp với Thông thường, người ta phối hợp hai paraben trở lên, thí dụ phối hợp 0,18% methyl parabens, 0,02% propyl parabens để làm chất bảo quản sát khuẩn nhiều loại thuốc tiêm chích phối hợp parabens với số hóa chất khác Trước đây, parabens sử dụng rộng rãi thuốc chữa bệnh, thường hàm lượng cao, khoảng 1% đến 5% [5] Khi tác hại parabens sức khỏe người phát hiện, việc sử dụng parabens sản phẩm thuốc chữa bệnh giảm xuống So với dược phẩm, hàm lượng parabens sử dụng sản phẩm mỹ phẩm thường nồng độ thấp (khoảng 0,1% đến l0,8%), nay, chúng loại chất bảo quản sử dụng nhiều nhiều lí do: giá thành rẻ, hiệu bảo quản tốt, không màu, không mùi, không làm thay đổi tính chất sản phẩm 1.1.3 Tác động parabens sức khỏe 1.1.3.1 Gây dị ứng da Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Tác giả Christen M Mowad [9] trình bày báo hai trường hợp viêm da dị ứng tiếp xúc gây parabens, thông qua việc sử dụng sản phẩm hàng ngày sữa tắm, dầu gội đầu, nước rửa tay, v.v Nghiên cứu rằng, benzylparaben chất có khả gây dị ứng mạnh nhất, khối lượng phân tử lớn Trong báo cáo khác, tác giảJames E Nagel cộng sự[13] trình bày hai trường hợp dị ứng với parabens đường tiêm da Cơ chế gây dị ứng parabens chưa rõ ràng, nhiều trường hợp dị ứng với chất bảo quản ghi nhận Một điều tra năm 1973, tiếnhành 1200 cá nhân thực The North American Contact Dermatitis Group cho thấy tỷ lệ dị ứng với parabens 3% [13] 1.1.3.2 Hiện tượng lão hóa da Theo kết nghiên cứu rác giả Osamu Handa cộng sự[19], methylparaben tăng cường khả gây hại tia UVB tế bào sừng da Tia UVB với cường độ 15 mJ/cm2 30 mJ/cm2 (tương ứng với cường độ UVB trung bình tiếp xúc với ánh sáng mặt trời vòng phút vào ngày đẹp trời châu Âu) không gây hại đến tế bào sừng Tuy nhiên kết hợp sử dụng methylparaben 0,003% việc chiếu xạ tia UVB với cường độ lượng tế bào sừng bị hoại tử tăng lên đáng kể Theo kết nghiên cứu khác tác giả Yoshinori Okamoto cộng [28], methylparaben sản phẩm chuyển hóa methylparaben, kết hợp với ánh sáng mặt trời gây tổn hại ADN da Cơ chế tác động mô tả Hình1.8: Hình Cơ chế gây hại ADN da hợp chất parabens 1.1.3.3 Mối liên hệ với parabens bệnh ung thư vú Hơn 50 năm nay, hợp chất parabens biết đến có hoạt tính oestrogen Oestrogen biết có ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú việc ngưng hoạt động oestrogen phương pháp ưu tiên điều trị cho khối u vú nhạy cảm với hormone Nhóm tác giả Byford J.E cộng sự[6] tiến hành nghiên cứu hoạt tính oestrogen hợp chất parabens (methylparaben, ethylparaben, n-propylparaben, n-butylparaben) tế bào ung thư vú nuôi cấy MCF7 Parabens di Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích chuyển [3H] oestradiol từ thụ thể tế bào tương MCF7 Paraben tăng biểu gen quy định oestrogen tăng khả sản sinh tế bào Liên kết parabens với tế bào MCF7 tăng lên theo chiều dài chuỗi alkyl, nhiên liên kết yếu Kết phù hợp với báo cáo nghiên cứu tính liên kết áp dụng với hệ tử cung chuột Theo tác giảRoutledge E.J cộng [20], tất parabens bao gồm: methylparaben, ethylparaben, n-propylparaben, butylparaben có hoạt tính tương tự oestrogen Trong methyl paraben chất có hoạt tính oestrogen yếu với cường độ thấp khoảng 2500000 lần so với 17-estradiol (một loại oestrogen có tự nhiên) Hoạt tính oestrogen mạnh lên theo chiều tăng chuỗi alkyl, cụ thể ethylparaben, propylparaben butylparaben có cường độ thấp khoảng 150000 lần, 30000 lần, 10000 so với 17-estradiol Nghiên cứu rằng, cường độ hoạt tính oestrogen parabens cá thể chuột thấp đến lần so với cường độ thử nghiệm ống nghiệm Nguyên nhân giải thích parabens nhanh chóng đào thải thông qua hệ tiết thể Một nghiên cứu khác tác giả Thuy T.B Vo cộng sự[25] tiến hành cá thể chuột giai đoạn từ 21-40 ngày tuổi cho kết tương tự Hoạt động estrgen mạnh lên theo thứ tự sau: ethylparaben