ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= NGUYỄN THỊ NHUNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC-MS/MS Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Bản khóa luận đƣợc thực hoàn thành Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia với hƣớng dẫn PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Thị Hồng Hảo định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn góp ý giúp em hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hà Bình hƣớng dẫn giúp đỡ hoàn thành khóa luận Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS Trần Cao Sơn cán khoa Độc học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện giúp hoàn thành đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giáo giảng dạy khoa Hoá, đặc biệt thầy cô môn Hoá Phân tích, cho kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt ngƣời bạn nhóm hoá phân tích K24 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt trình học tập thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè bên tôi, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ học tập sống Do thời gian thực đề tài có hạn nên không tránh thiếu sót Tôi mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy cô bạn sinh viên Hà Nội, ngày 07 tháng 11 năm 2016 Nguyễn Thị Nhung Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu độc tố nhuyễn thể gây liệt 1.1.1 Giới thiệu STX 1.1.2 Giới thiệu NEO 1.1.3 Giới thiệu GTX-1 1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép (ML) .6 1.1.5 Những tác hại độc tố nhuyễn thể gây liệt 1.2 Các phƣơng pháp xác định độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.2.1 Các phƣơng pháp thử sinh học .9 1.2.2 Phƣơng pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA 10 1.2.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 11 1.2.4 Kỹ thuật điện di .13 1.2.5 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS) .13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tƣợng nội dung nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 16 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .16 2.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu 16 2.2.2 Phƣơng phápsắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 17 2.2.3 Thẩm định phƣơng pháp 23 Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên 2.2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 26 2.3 Phƣơng tiện nghiên cứu 26 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 26 2.3.2 Dung môi, hóa chất 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Tối ƣu hóa điều kiện chạy thiết bị LC-MS/MS Error! Bookmark not defined 3.1.1 Tối ƣu hóa điều kiện chạy thiết bị khối phổ MS/MS Error! Bookmark not d 3.1.2 Tối ƣu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Error! Bookmark 3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 3.2.1 Chọn qui trình xử lí mẫu Error! Bookmark not defined 3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ lên trình chiết mẫu Error! Bookmark not def 3.2.3 Khảo sát trình pha loãng dịch chiết Error! Bookmark not defined 3.2.4 Khảo sát thể tích dung môi chiết Error! Bookmark not defined 3.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích Error! Bookmark not defined 3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc Error! Bookmark not defined 3.3.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) Error! Bookmark not define 3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính Error! Bookmark not defined 3.3.4 Độ xác (accuracy) phƣơng pháp phân tích (độ độ chụm) Error! Bookmark not defined 3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực tế Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học độc tính vài độc tố PSP Bảng 1.2: Một số nước đưa qui định giới hạn tối đa cho phép (ML) PSP Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định PSP 11 Bảng 2.1: Bảng pha dung dịch chuẩn làm viêc̣ Error! Bookmark not defined Bảng 3.1: Ion mẹ chất Error! Bookmark not defined Bảng 3.2: Điều kiện tối ưu cho ESI-MS/MS Error! Bookmark not defined Bảng 3.3: Các thông số tối ưu MS/MS Error! Bookmark not defined Bảng 3.4: Chương trình gradient Error! Bookmark not defined Bảng 3.5: Lựa chọn quy trình chiết mẫu Error! Bookmark not defined Bảng 3.6: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên trình chiết mẫu Error! Bookmark not defined Bảng 3.7: Khảo sát trình pha loãng dịch chiết Error! Bookmark not defined Bảng 3.8: Khảo sát thể tích dung môi chiết Error! Bookmark not defined Bảng 3.9: Ion mẹ ion STX, GTX-1, NEO Error! Bookmark not Bookmark not defined Bảng 3.10: LOD LOQ STX, GTX-1, NEO Error! defined Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Bảng 3.11: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PSP Error! Bookmark not defined Bảng 3.12: Độ lặp lại độ thu hồi STX, GTX-1, NEO mẫu Ngao Error! Bookmark not defined Bảng 3.13: Độ lặp lại độ thu hồi STX, GTX-1, NEO mẫu Hàu Error! Bookmark not defined Bảng 3.14: Kết phân tích mẫu thực tế địa bàn Hà Nội Error! Bookmark not defined Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo tổng quát độc tố PSP Hình 1.2: Công thức cấu tạo STX Hình 1.3: Công thức cấu tạo Neo Hình 1.4: Công thức cấu tạo GTX-1 Hình 2.1: Sơ đồ đơn giản hệ thống sắc ký lỏng 18 Hình 2.2: Bộ kết nối phun điện tử Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực 20 22 Hình 2.4: Bộ phân tích khối ba tứ cực 22 Hình 3.1: Sắc kí đồ mix PSP chuẩn 100 ng/mL chạy chương trình gradient Error! Bookmark not defined Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 1Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình theo tác giả Van De Riet Error! Bookmark not defined Hình 3.3: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined Hình 3.4: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined Hình 3.5:Sắc kí đồ PSP 100 ng/mL quy trình Error! Bookmark not defined Hình 3.6: Sắc kí đồ quy trình không gia nhiệt thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL Error! Bookmark not defined Hình 3.7: Sắc kí đồ quy trình gia nhiệt thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL Error! Bookmark not defined Hình 3.8: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng trình pha loãng đến hiệu suất Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên thu hồi Error! Bookmark not defined Hình 3.9: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng thể tích chiết đến hiệu suất thu hồi Error! Bookmark not defined Hình 3.10: Quy trình xử lí mẫu tối ưu Error! Bookmark not defined Hình 3.11: Phổ khối PSP Error! Bookmark not defined Hình 3.12: Sắc đồ mẫu trắng không có tín hiêụ chấ t phân tích Error! Bookmark not defined Hình 3.13: Sắc đồ mẫu chuẩn ở mức 200 ng/mL Error! Bookmark not defined Hình 3.14: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn ở mức 200 ng/mL Error! Bookmark not defined Hình 3.15: Sắc kí đồ STX LOD 10 ng/mL (tương đương 100 µg/kg mẫu) Error! Bookmark not defined Hình 3.16: Sắc kí đồ NEO LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg mẫu) Error! Bookmark not defined Hình 3.17: Sắc kí đồ GTX-1 LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg mẫu) Error! Bookmark not defined Hình 3.18: Đường chuẩ n STX theo diêṇ tích pic Error! Bookmark not Hình 3.19: Đường chuẩ n GTX-1 theo diêṇ tích pic Error! Bookmark not defined defined Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Hình 3.20: Đường chuẩn NEO theo diêṇ tích pic Error! Bookmark defined Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên not DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu CAN AOAC Tiếng Anh Acetonitrile Association of Official Analytical Communities Tiếng Việt Acetonitril Hiệp hội nhà phân tích Độc tố nhuyễn thể gây trí ASP Amnesic Shellfish Poisoning CAD Collision Gas Pressure Áp suất khí va chạm CE Collision Energy Năng lƣợng va chạm CUR Curtain Gas Khí màng CXP Collision Cell Exit Potential Thế đầu DP Declustering Potential Thế phân mảnh DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning Độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy d-SPE Dispersive solid phase extraction nhớ Chiết phân tán pha rắn Eq Equivalents Tƣơng đƣơng ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử FLD Fluoroscence detector Detector huỳnh quang GCB Graphitized carbon black Than hoạt tính GS1 Ion Source Gas Khí nguồn ion GS2 Ion Source Gas Khí nguồn ion GTX-1 Gonyautoxins-1 Độc tố gonyautoxins-1 HPLC High performance liquid chromatography Nguyễn Thị Nhung Sắc ký lỏng hiệu cao Trường ĐHKH Tự Nhiên Hình 2.1: Sơ đồ đơn giản hệ thống sắc ký lỏng Trong HPLC, pha tĩnh chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó chất rắn, xốp kích thƣớc hạt nhỏ, từ – 7mm Tuỳ theo chất pha tĩnh, phƣơng pháp sắc ký lỏng pha liên kết thƣờng chia làm loại: sắc ký pha thƣờng (NP-HPLC) sắc ký pha ngƣợc (RPHPLC) [2], [4]  Sắc ký pha thƣờng: pha tĩnh có bề mặt chất phân cực (đó làcác silica trần silica đƣợc gắn nhóm ankyl có cacbon mang nhóm chức phân cực: -NH2, -CN ), pha động dung môi hữu không phân cực nhƣ: n-hexan, toluene Hệ tách đa dạng chất không phân cực hay phân cực  Sắc ký pha ngƣợc: pha tĩnh thƣờng silica đƣợc ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng –C18H37, pha động phân cực: nƣớc, methanol, axetonitril Trong nhiều trƣờng hợp thành phần pha động lại nƣớc nên kinh tế Hệ đƣợc sử dụng để tách chất có độ phân cực đa dạng: từ phân cực, phân cực tới không phân cực Pha động HPLC đóng góp phần quan trọng việc tách chất phân tích trình sắc ký định Mỗi loại sắc ký có pha động rửa giải riêng cho để có đƣợc hiệu tách tốt Nguyễn Thị Nhung 18 Trường ĐHKH Tự Nhiên Detector phận quan trọng định độ nhạy phƣơng pháp Tuỳ thuộc chất lí hoá chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp Một số loại Detector dùng HPLC nhƣ: Detector quang phổ hấp thụ phân tử UVVIS, Detector huỳnh quang RF, Detector độ dẫn Khối phổ (MS) đóng vai trò nhƣ detector đặc biệt HPLC 2.2.2.2 Máy khối phổ (Mass Spectrometry) Khối phổ thiết bị phân tích dựa sở xác định khối lƣợng phân tử hợp chất hóa học việc phân tách ion phân tử theo tỉ số khối lƣợng điện tích (m/z) chúng Các ion tạo cách thêm hay bớt điện tích chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành đƣợc tách theo tỉ số m/z phát hiện, từ cho thông tin khối lƣợng cấu trúc phân tử hợp chất [4] Cấu tạo thiết bị khối phổ bao gồm phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích phận phát  Nguồn ion Chất phân tích sau khỏi cột tách đƣợc dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng đƣợc ion hóa nguyên tử Một số kĩ thuật ion hóa thƣờng đƣợc sử dụng sắc ký lỏng khối phổ nhƣ: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học áp suất khí (atmospheric pressure chemical ionization – APCI) a) Ion hóa phun điện tử (ESI) Kĩ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba trình sau: + Tạo thành giọt mang điện tích + Làm giảm kích thƣớc hạt, phân nhỏ hạt + Quá trình hình thành pha ion Nguyễn Thị Nhung 19 Trường ĐHKH Tự Nhiên Hình 2.2: Bộ kết nối phun điện tử Có chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dƣơng ion âm  Loại hình thành ion dƣơng o Phù hợp cho phân tích loại thuốc có tính bazo o Thƣờng hình thành nên ion [M+H]+ o Cũng hình thành ion [M+nH]n+ , [M+Na+]+  Loại hình thành ion âm o Thích hợp cho phân tích loại thuốc có tính axit o [M-H]- , [M-nH]nĐây kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao Kĩ thuật ứng dụng phân tích chất không phân cực nhƣ: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol, chất phân cực có khối lƣợng phân tử nhỏ b) Ion hoá hoá học áp suất khí (Atmospheric Pressure Chemical Ionization: APCI) Hỗn hợp khí đến vùng có áp suất khí quyển, xảy ion hoá hoá học va chạm với dòng ion dƣơng (H2, CH4, H2O ) âm để biến phân tử trung hòa thành ion phân tử hay mảnh ion qua bắn phá dòng electron mang lƣợng Mỗi phân tử khí tạo ion dƣơng khác làm tác nhân cho ion hóa hóa học Chất phân tích dung môi dạng lỏng đƣợc chuyển thành giọt nhỏ hóa nhiệt độ cao khoảng 500C Một điện cao từ – 5kV tạo Nguyễn Thị Nhung 20 Trường ĐHKH Tự Nhiên electrron ion hóa chất phân tích Đây kĩ thuật ion hóa mềm APCI đƣợc sử dụng để phân tích chất có khối lƣợng phân tử trung bình Kĩ thuật bắn phá chế độ: ion âm ion dƣơng  Bộ phận phân tích khối Là trái tim máy khối phổ, có nhiệm vụ phân tách ion có trị số m/z khác thành phần riệng biệt, có nhiều phân tích khối khác nhƣ: Bộ phân tích tứ cực, phân tích tứ cực chặp ba, phân tích bẫy ion, phân tích thời gian bay Hiện nay, có hai loại phân tích khối thƣờng đƣợc sử dụng nhất, là:  Bộ phân tích tứ cực bẫy ion (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) Bẫy tứ cực hoạt động theo nguyên lý phân tích khối tứ cực, có điểm khác ion đƣợc lƣu giữ đƣa dần khỏi bẫy Bằng cách thay đổi xoay chiều áp vào cực ion có tỷ số m/z khác vƣợt qua khoảng không để đến Detector  Bộ phân tích tứ cực chặp ba (triple Quadrupole Analyser) Gồm ba tứ cực ghép nối với Máy tứ cực gồm cực ghép song song nối với đôi đối diện nhau, tạo thành hai cặp, sau chúng nối với điện áp chiều tạo thành cặp dƣơng âm Ngoài điện áp chiều, hai cặp điện cực đƣợc nối với điện áp xoay chiều Tổ hợp điện áp đặc biệt điện áp xoay chiều thay đổi theo chu kỳ để quét khối lƣợng ion Nguyễn Thị Nhung 21 Trường ĐHKH Tự Nhiên Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực Một số ion có tỷ số m/z xác định cộng hƣởng với xoay chiều xác định thẳng qua khoảng không đến detector Trong ion khác không có quỹ đạo không ổn định va chạm với cực bị giữ lại Tuy nhiên để thu đƣợc tất ion ta quét điện áp theo chu kỳ từ zero đến điện áp định tăng dần sau lại trở lại zero, lần lƣợt ion vƣợt qua đƣợc tứ cực có khối lƣợng từ nhỏ đến lớn để đến detector Máy tứ cực chặp ba: Q0 Q1 Q2 Q3 Hình 2.4: Bộ phân tích khối ba tứ cực Trong đó: Q0: Nguồn ion mẹ Q1: Bộ tứ cực thứ nhất, có nhiệm vụ tách ion Lựa chọn ion mẹ với m/z định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2 Q2: Bộ tứ cực thứ hai, điều kiện áp suất cao, ion mẹ bị phân li va chạm với khí trơ có mặt nhƣ khí N2, Ar, He Bộ Q2 tạo phân ly ion mẹ Nguyễn Thị Nhung 22 Trường ĐHKH Tự Nhiên bị phân mảnh tạo ion nhỏ hơn, ion (daughter ions) Q2 không đóng vai trò lọc ion mà chấp nhận tất ion Q1 chuyển đến Sau tất ion đƣợc chuyển qua tách Q3 Q3: Bộ tứ cực thứ ba làm nhiệm vụ tách ion đƣợc chuyển từ Q2 để tới phận phát  Bộ phận phát Sau khỏi thiết bị phân tích khối lƣợng, ion đƣợc đƣa tới phần cuối thiết bị khối phổ phận phát ion Có hai loại phận phát phổ biến: phận phát nhân electron (electron multipler) phận phát nhân quang (photo multipler) Bộ phận phát nhân electron detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao Một ion đập vào bề mặt dinod làm bật electron Các electron thứ cấp sau đƣợc dẫn tới dinod tạo electron thứ cấp nhiều nữa, tạo thành dòng electron (1-106) Bộ phận phát nhân quang giống nhƣ thiết bị nhân electron, ion ban đầu đập vào dinot tạo dòng electron Các photon đƣợc phát nhân quang hoạt động nhƣ thiết bị nhân electron Số lƣợng photon tỷ lệ với cƣờng độ tín hiệu 2.2.3 Thẩm định phƣơng pháp 2.2.3.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc - Khái niệm [5], [6] Tính đặc hiệu: khả phát chất phân tích có mặt tạp chất khác nhƣ: tiền chất, chất chuyển hóa, tạp chất Tính chọn lọc: khái niệm rộng tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích số nhiều chất trình - Xác định: Phƣơng pháp sắc kí lỏng khối phổ Nguyễn Thị Nhung 23 Trường ĐHKH Tự Nhiên Sử dụng phƣơng pháp xác nhận (confirmation method) cách tốt để đảm bảo tính đặc hiệu phƣơng pháp Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – indenfication point) phƣơng pháp khác để khẳng định chắn có mặt chất 2.2.3.2 Giới hạn phát (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) - Khái niệm [5], [6] Giới hạn phát (LOD): nồng độ khối lƣợng nhỏ đƣợc phát với mức tin cậy xác định Giới hạn định lượng (LOQ): nồng độ tối thiểu chất có mẫu thử mà ta định lƣợng phƣơng pháp khảo sát cho kết có độ xác mong muốn - Xác định: Dựa tỷ lệ tín hiệu nhiễu (S/N) Phân tích mẫu nồng độ thấp xuất tín hiệu chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N) Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu chất phân tích N: Nhiễu đƣờng LOD đƣợc chấp nhận nồng độ mà tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đƣờng nền, thông thƣờng lấy S/N=3 LOQ đƣợc chấp nhận nồng độ mà tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đƣờng nền, thông thƣờng lấy S/N=10 2.2.3.3 Xây dựng đường chuẩn - Khái niệm [5] Đường chuẩn: đƣờng biểu diễn phụ thuộc tuyến tính đại lƣợng đo đƣợc nồng độ chất phân tích - Xác định: Nguyễn Thị Nhung 24 Trường ĐHKH Tự Nhiên Đo dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi khảo sát phụ thuộc tín hiệu nồng độ Vẽ đƣờng thẳng tuyến tính biểu diễn phụ thuộc tín hiệu nồng độ chất phân tích 2.2.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi Độ lặp lại (độ chụm): mức độ gần giá trị riêng lẻ phép đo lặp lại đƣợc biểu diễn độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) [6] 𝑅𝑆𝐷 % = 𝑆= 𝑆 100 𝑥 𝑁 𝑖=1(𝑥𝑖 − 𝑥 )2 𝑁−1 Trong đó: - xi : Nồng độ tính đƣợc lần thử nghiệm thứ i - 𝑥 : Nồng độ trung bình tính đƣợc N lần thử nghiệm - N: Số lần thử nghiệm Độ phương pháp: khái niệm mức độ gần giá trị trung bình kết thử nghiệm giá trị thực giá trị đƣợc chấp nhận Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): tỷ lệ phần trăm giá trị thu đƣợc so với giá trị lý thuyết 𝑅 % = 𝐶 100 % 𝐶𝑥 Trong đó: - R: độ thu hồi (%) - C: Nồng độ chất phân tích mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL) Nguyễn Thị Nhung 25 Trường ĐHKH Tự Nhiên - Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL) 2.2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu Các kết đƣợc tính toán tự động theo phần mềm phân tích thiết bị (phần mềm Analyst 1.5.1, ABSciex) Xử lý kết phần mềm Minitab 14 2.3 Phƣơng tiện nghiên cứu 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 2.3.1.1 Thiết bị  Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS Shimadzu bao gồm: + Thiết bị sắc ký lỏng Shimadzu Mode 20 AD-UFLC + Đầu dò khối phổ: Triplequard 5500 AB Sciex (Mỹ)  Cột sắc ký: Acclaim 120- cột C18 3μm (150mm × 2.1mm × 3μm)  Máy lắc vortex  Máy đồng mẫu  Máy li tâm MIKRO 22R  Cân phân tích (có độ xác 0,1mg 0,01mg)  Cân kĩ thuật (có độ xác 0,01g)  Máy cất quay chân không Eyela 2.3.1.2 Dụng cụ  Pipet: 1, 2, 5, 10, 20 mL  Bình định mức: 5, 10, 50, 100 mL  Ống li tâm 50 mL  Bình cô quay 50 mL, 100 mL  Vial loại 1,8 mL  Ống đong, phễu, giấy lọc Nguyễn Thị Nhung 26 Trường ĐHKH Tự Nhiên  Micropipet loại 200 µL, 1000 µL, 5000 µL thay đổi thể tích đƣợc đầu côn tƣơng ứng 2.3.2 Dung môi, hóa chất Các loại hoá chất sử dụng thuộc loại tinh khiết phân tích - Methanol, acetonitril (Merck) - Acid formic, acid acetic, natri hydroxyd, acid trichloracetic (TCA) (Merck) - Nƣớc cất lần - Chất hấp phụ C18, GCB đƣợc cung cấp công ty Agilent, Mỹ - Tất dung dịch (trừ trƣờng hợp sử dụng nguyên trạng dung môi loại tinh khiết sắc ký) đƣợc lọc qua màng lọc 0,45 µm trƣớc đƣa vào hệ thống sắc kí * Chuẩn bị dung dịch chuẩn - Chuẩn STX, NEO, GTX-1 vật liệu chuẩn đƣợc chứng nhận NCR, Canada - Các chuẩn PSP đƣợc sử dụng Canada chuẩn vật liệu chứng nhâ ̣n - Chuẩ n STX da ̣ng Saxitoxin Dih ydrochloride nồ ng đô ̣ 66,3 µmol/L, khố i lƣơ ̣ng phân tƣ̉ 372,2g/mol, tƣơng đƣơng với hàm lƣơ ̣ng 24,7 µg/mL - Chuẩ n Neo nồ ng đô ̣ 65,6 µmol/L, khố i lƣơ ̣ng phân tƣ̉ 315,1g/mol, tƣơng đƣơng với hàm lƣơ ̣ng 20,5 µg/mL - Chuẩ n GTX -1 nồ ng đô ̣ 60,4 µmol/L, khố i lƣơ ̣ng phân tƣ̉ 411,4g/mol, tƣơng đƣơng với hàm lƣơ ̣ng 24,8 µg/mL Dung dịch chuẩn trung gian 1000 ng/mL: Lấ y chin ́ h xác mô ̣t thể tić h các chuẩ n STX, NEO, GTX-1lầ n lƣơ ̣t là 40,5; 48,8; 40,3 µL và thêm 870 µL TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Nhung 27 Trường ĐHKH Tự Nhiên TIẾNG VIỆT Đào Việt Hà – Viện Hải Dƣơng Học Nha Trang (2000), Hàm lượng độc tố vi tảo paralytic shellfish poisoning (PSP toxin) nghêu Meretrix lyrata số vùng nuôi trọng điểm khu vực Cần Giờ Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, NXB Khoa học kỹ thuật Từ Vọng Nghi (2007), Hóa học phân tích, phần 1: Cơ sở lý thuyết phương pháp hóa học phân tích, NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp tách, Bài giảng Đại học Khoa học Tự Nhiên – ĐHQGHN Trần Cao Sơn, Phạm Xuân Đà, Lê Tị Hồng Hảo, Nguyễn Thành Trung (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng chuyên đề thống kê hoá phân tích, Bài giảng Đại học Khoa học Tự Nhiên – ĐHQGHN Nguyễn Đình Triệu, Nguyễn Đình Thành (2001),Các phương pháp phân tích vật lý hóa lý, NXB Khoa học kỹ thuật TIẾNG ANH Cusick K D., Sayler G S (2013), "An overview on the marine neurotoxin, saxitoxin: Genetics, molecular targets, methods of detection and ecological functions", Marine Drugs, 11(4), pp 991-1018 Deeds J R., Landsberg J H., Etheridge S M., et al (2008), "Nontraditional vectors for paralytic shellfish poisoning", Marine Drugs, 6(2), pp 308-348 10 Dell’aversano C., Hess P., Quilliam M A (2005), "Hydrophilic interaction liquid chromatography–mass spectrometry for the analysis of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins", Journal of chromatography A, 1081(2), pp 190-201 Nguyễn Thị Nhung 28 Trường ĐHKH Tự Nhiên 11 Diener M., Erler K., Hiller S., et al (2006), "Determination of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins in dietary supplements by application of a new HPLC/FD method", European Food Research and Technology, 224(2), pp 147-151 12 Etheridge S M (2010), "Paralytic shellfish poisoning: seafood safety and human health perspectives", Toxicon, 56(2), pp 108-122 13 European Commission, (2004), “Commission Regulation (EC) No 853/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 laying down specific hygiene rules for food of animal origin”, Official Journal of the European Union, L226, 22 - 82 14 Faber S (2012), "Saxitoxin and the induction of paralytic shellfish poisoning", Journal of Young Investigators, 23(1), pp 1-7 15 FAO (2004), Marine biotoxins, pp 5-49, Rome 16 Gerssen A (2009), The analysis of lipophilic marine toxins, Wageningen University, pp.2-5 17 Gerssen A., Pol-Hofstad I E., Poelman M., et al (2010), "Marine toxins: Chemistry, toxicity, occurrence and detection, with special reference to the Dutch situation", Toxins, 2(4), pp 878-904 18 Harju K., Rapinoja M L., Avondet M.-A., et al (2015), "Optimization of Sample Preparation for the Identification and Quantification of Saxitoxin in Proficiency Test Mussel Sample using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry", Toxins, 7(12), pp 4868-4880 19 Lawrence J F., Niedzwiadek B (2001), "Quantitative determination of paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish by using prechromatographic oxidation and liquid chromatography with fluorescence detection", Journal of AOAC International, 84(4), pp 1099-1108 20 Llewellyn L., Dodd M., Robertson A., et al (2002), "Post-mortem analysis of samples from a human victim of a fatal poisoning caused by the xanthid crab, Zosimus aeneus", Toxicon, 40(10), pp 1463-1469 Nguyễn Thị Nhung 29 Trường ĐHKH Tự Nhiên 21 Mattarozzi M., Milioli M., Bianchi F., et al (2016), "Optimization of a rapid QuEChERS sample treatment method for HILIC-MS analysis of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins in mussels", Food Control, 60, pp 138-145 22 Mons M., Van Egmond H., Speijers G (1998), Paralytic shellfish poisoning: A Review RIVM Report No 388802 005 23 Oikawa H., Fujita T., Satomi M., et al (2002), "Accumulation of paralytic shellfish poisoning toxins in the edible shore crab Telmessus acutidens",Toxicon, 40(11), pp 1593-1599 24 Oshima Y (1995), "Post-column derivatization liquid chromatographic method for paralytic shellfish toxins", Journal of AOAC International, 78(2), pp 528-532 25 Usleber E., Schneider E., Terplan G (1991), "Direct enzyme immunoassay in microtitration plate and test strip format for the detection of saxitoxin in shellfish", Letters in applied microbiology, 13(6), pp 275-277 26 Van De Riet J M., Gibbs R S., Chou F W., et al (2009), "Liquid chromatographic post-column oxidation method for analysis of paralytic shellfish toxins in mussels, clams, scallops, and oysters: single-laboratory validation", Journal of AOAC International, 92(6), pp 1690-1704 27 Wiberg G., Stephenson N (1960), "Toxicologic studies on paralytic shellfish poison", Toxicology and applied pharmacology, 2(6), pp 607 615 28 Wiese M., D’agostino P M., Mihali T K., et al (2010), "Neurotoxic alkaloids: saxitoxin and its analogs", Marine Drugs, 8(7), pp 2185-2211 29 Windust A.J, J L C Wright, and J L McLachlan, “The effects of the diarrhetic shellfish poisoning toxins, okadaic acid and dinophysistoxin-1, on the growth of microalgae,” Mar Biol., vol 126, no 1, pp 19–25, 1996 30 Yu H., Lim K S., Song K C., et al (2013), "Comparison of MBA and HPLC Post column Oxidation Methods for the Quantification of Paralytic Nguyễn Thị Nhung 30 Trường ĐHKH Tự Nhiên Shellfish Poisoning Toxins", Fisheries and aquatic sciences, 16(3), pp 159164 31 Zhuo L., Yin Y., Fu W., et al (2013), "Determination of paralytic shellfish poisoning toxins by HILIC–MS/MS coupled with dispersive solid phase extraction", Nguyễn Thị Nhung Food chemistry, 31 137(1), pp 115-121 Trường ĐHKH Tự Nhiên 32 ... dựng phƣơng pháp xác định đồng thời số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC - MS/ MS - Sơ đánh giá số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ tiêu thụ Hà Nội... Xác định đồng thời số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ sắc ký lỏng khối phổ LC -MS/ MS Phƣơng pháp đại, có độ tin cậy xác cao Mục tiêu thực đề tài luận văn là: - Xây dựng phƣơng pháp xác. .. - Hệ số độc: Trong nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt STX độc tố Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên mạnh ta quy ƣớc có hệ số cao Độc tố có độ mạnh thứ hai GTX-1 đến NEO Độc tố gây độc độc tố GTX-2