Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm AH5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm AH5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm AH5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm AH5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm AH5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm AH5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm AH5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm AH5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm AH5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (luận văn thạc sĩ)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Trần Thị Tình NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM GIA CẦM A/H5N1 TRONG MẪU BỆNH PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN .10 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 .10 1.1.1 Phân loại học danh pháp .10 1.1.2 Hình thái cấu trúc virus cúm A/H5N1 12 1.1.3 Hệ gen protein virus A/H5N1 13 1.1.4 Chu trình tái virus cúm A/H5N1 16 1.1.5 Hiện tượng biến đổi kháng nguyên virus cúm A .18 1.1.6 Khả thích ứng vật chủ virus cúm A 19 1.1.7 Độc lực khả gây bệnh virus cúm A/H5N1 21 1.1.8 Sức đề kháng virus cúm A 22 1.2 CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 .23 1.2.1 Triệu chứng nhiễm cúm A/H5N1 23 1.2.2 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1 24 1.2.3 Điều trị nhiễm cúm A/H5N1 người 30 1.2.4 Kiểm soát lây nhiễm dự phòng .31 1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A/H5N1 Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 32 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .34 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 34 2.1.1 Mẫu vật 34 2.1.2 Hóa chất .34 2.1.3 Thiết bị .35 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.2.1 Chọn mẫu 35 2.2.2 K thuật mẫu bảo quản v vận chuyển mẫu .35 2.2.3 Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm 36 2.2.4 Thiết kế m i .37 2.2.5 Tối ưu phản ứng RT-PCR phát gen M, HA NA 39 2.2.6 Tối ưu phản ứng Multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 .45 2.2.7 Thử nghiệm phản ứng Multiplex RT-PCR mẫu bệnh phẩm 47 2.2.8 Điện di v phân tích kết 48 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .50 3.1 Thiết kế mồi 50 3.1.1 Thiết kế m i đặc hiệu cho gen M virus cúm A 50 3.1.2 Thiết kế m i đặc hiệu cho gen HA virus cúm A/H5N1 51 3.1.3 Thiết kế m i đặc hiệu cho gen NA virus cúm A/H5N1 .52 3.2 Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát gen M, HA NA .54 3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn m i .54 3.2.2 Tối ưu n ng độ m i 56 3.2.3 Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 57 3.2.4 Đánh giá độ nhạy phản ứng RT-PCR 58 3.2.5 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng RT-PCR 53 3.3 Tối ƣu phản ứng multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 63 3.3.1 Tối ưu nhiệt độ gắn m i 56 3.3.2 Tối ưu n ng độ m i 63 3.3.3 Tối ưu thời gian kéo d i chuỗi 64 3.3.4 Tối ưu số chu kỳ phản ứng 65 3.3.5 Đánh giá độ nhạy phản ứng multiplex RT-PCR 66 3.3.6 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng mu tip ex RT-PCR 66 3.4 Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 mẫu bệnh phẩm 61 Kết luận .67 Kiến nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO .75 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc virus cúm A Hình 1.2 Các phân đoạn gen protein virus cúm A/H5N1 Hình 1.3 Chu trình tái virus cúm A… 10 Hình 1.4 Các vật chủ tự nhiên khả lây nhiễm loài vật chủ virus cúm A 13 Bảng 2.1: Các thành phần phản ứng RT-PCR 33 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 33 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR .37 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR 38 Bảng 3.1: Cặp mồi phát gen M virus cúm A 43 Hình 3.1: Đặc điểm cặp mồi phát gen M virus cúm A .43 Bảng 3.2: Cặp mồi phát gen HA virus cúm A/H5N1 44 Hình 3.2: Đặc điểm cặp mồi phát gen HA virus cúm A/H5 .45 Bảng 3.3: Cặp mồi phát gen NA virus cúm A/H5N1 46 Hình 3.3: Đặc điểm cặp mồi phát gen NA virus cúm A/N1 46 Bảng 3.4: Trình tự mồi lựa chọn để thực phản ứng RT-PCR… 47 Hình 3.4 Ảnh điện di kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng RT-PCR phát gen riêng biệt 49 Hình 3.5 Ảnh kết điện di tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng RT-PCR .50 Hình 3.6 Ảnh điện di kết tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 51 Bảng 3.5: Giá trị đo độ hấp thụ OD RNA gen M, HA NA 51 Hình 3.7 Ảnh điện di đánh giá độ nhạy phản ứng RT-PCR 52 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng RT-PCR phát gen M 53 Bảng 3.7: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát gen M .54 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng RT-PCR phát gen H5 54 Bảng 3.9: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát gen H5 54 Bảng 3.10: Thành phần phản ứng RT-PCR phát gen N1 55 Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát gen N1 55 Hình : Ảnh điện di tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiple RT-PCR 56 Hình 3.9 Ảnh điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng multiplex RT-PCR 57 Hình 3.10: Ảnh điện di tối ưu thời gian kéo dài chuỗi phản ứng multiple RT-PCR 58 Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiple RT-PCR 59 Hình 3.12: Th nghiệm đánh giá độ nhạy phản ứng multiplex RT-PCR… .59 Hình 3.13: Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiệu phản ứng multiple RT-PCR .60 Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR .60 Bảng 3.13: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR ……………………….61 Hình 3.14: ết th nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR m u bệnh ph m dương tính………………………………………………………………………………… 62 Hình 3.15: ết th nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số m u bệnh ph m………………………………………….63 Hình 3.16: ết th nghiệm phản ứng RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số m u bệnh ph m………………………………………………….…64 Bảng 3.14: So sánh kết xét nghiệm phản ứng RT-PCR multiplex RT-PCR m u bệnh ph m……………………………………………………………………… 64 Bảng 3.15: So sánh thời gian chi phí hố chất làm xét nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR RT-PCR………………………………………………………………65 CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair DEPC-treated water: Diethylpyrocarbonate treated water DNA: Deroxi ribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA: Etilendiamin tetraaxetic acid HA (H): Haemagglutinin LB: Luria-Bertani media M: Matrix protein NA (N): Neuraminidase NP: Nucleoprotein NS: Non-structural protein PA: Polymerase A protein PB: Polymerase B protein RT-PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction RNA: Ribonucleic acid TBE: Tris Base, Acid Boric, EDTA vRNP: Viral ribonucleoprotein LỜI CẢM ƠN! Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn hướng d n tận tình, chu đáo GS.TS Lương Xuân Hiến - Trường Đại học Y Thái Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Nam Thắng thầy cô Trung tâm dịch vụ Khoa học kỹ thuật Y dược - Trường Đại học Y Thái Bình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Tơi in chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Sinh học Trường Đại học khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội giảng dạy, giúp đỡ tơi suốt q trình học Cuối tơi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, thầy cô Bộ mơn Sinh học- Trường Đại học Y Thái Bình, gia đình, bạn bè tạo điều kiện cho tơi học động viên tơi suốt q trình học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2011 Học viên Trần Thị Tình MỞ ĐẦU Trong năm gần dịch cúm gia cầm virus A/H5N1 vấn đề quan tâm giới, đặc biệt nước châu Á Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc Kể từ cuối năm 2003 đến dịch cúm A/H5N1 gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm gây tử vong cho hàng trăm người Cả giới lo sợ trước nguy xảy đại dịch cúm người virus A/H5N1 giống vụ đại dịch cúm xảy kỷ 20 Các nước giới tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại đại dịch cúm H5N1 xảy tương lai mua thuốc v thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành phương án phòng chống dịch, thực chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến dịch cúm gia cầm liên tục xảy hầu hết tỉnh thành toàn quốc Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết tiêu hủy Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đứng thứ giới (sau Indonesia) số người nhiễm tử vong virus A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 virus có khả biến đổi gen nhanh chóng hình thành nên chủng virus nên việc sử dụng vaccine để dự phịng thường khơng đạt hiệu cao Ở Việt Nam nay, dịch cúm A/H5N1 liên tục xảy gia cầm người, mức độ không trầm trọng giai đoạn trước khơng phát có biện pháp dập dịch kịp thời dịch trở nên bùng phát Khi có dịch cúm gia cầm phương pháp chẩn đốn nhanh nhạy v xác cần thiết cho việc điều trị kiểm soát v ngăn chặn kịp thời tránh ây an rộng cộng đ ng Để phát virus cúm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm người gia cầm, hầu hết phòng xét nghiệm áp dụng k thuật RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) Đây k thuật sinh học phân tử, cho phép phát virus với độ xác cao, thời gian làm xét nghiệm khoảng 4-6 thực Realtime RT-PCR 12-24 thực RTPCR điện di gel agarose Với RT-PCR thông thường, người ta phải thực ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao g m: phản ứng để xác định virus cúm A phản ứng xác định subtype H5 v phản ứng xác định subtype N1 Để đơn giản hóa q trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét nghiệm v tiết kiệm chi phí người ta ứng dụng k thuật multiplex RT-PCR, cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 với phản ứng RT-PCR thay phải làm ba phản ứng RT-PCR Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế xây dựng quy trình thực k thuật multiplex RT-PCR phức tạp nên hầu hết phòng xét nghiệm nước chưa áp dụng k thuật chẩn đoán cúm A/H5N1 Chính vậy, chúng tơi thực ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” Labo Trường Đại học Y Thái Bình với mục tiêu: Thiết kế lựa chọn m i phù hợp để thực phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ thời gian gắn m i, n ng độ m i Thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR phát A/H5N1 số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người v gia cầm Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1.1.1 Phân loại học danh pháp 1.1.1.1 Phân loại virus cúm Theo ủy ban Quốc tế phân loại virus (ICTV - International Committee on Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae g m type A, B C Chúng virus có vật liệu di truyền RNA sợi đơn âm [32] Sự phân biệt virus cúm A, B C dựa khác đặc tính kháng nguyên nucleoprotein (NP) v protein M1 (matrix protein) Ngoài ra, hệ gen virus cúm A B có đoạn RNA cịn virus cúm C có đoạn RNA [36] Trong type type A virus có giới hạn vật chủ rộng ưu h nh phổ biến gia cầm số động vật có vú ợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… người [32] Virus cúm A loại có độc lực mạnh nhất, có khả biến đổi gen lớn nguyên nhân chủ yếu gây vụ đại dịch cúm kỷ qua Dựa vào khác biệt đặc tính kháng nguyên hai glycoprotein haemagglutinin (HA) neuraminidase (NA), virus cúm A chia thành 16 subtype HA (H1-H16) subtype NA (N1-N9) Sự tái tổ hợp subtype HA v NA mặt ý thuyết tạo nhiều subtype khác độc tính v khả gây bệnh [2] Tất subtype HA NA diện chủng virus lưu hành loài thủy cầm hoang dã Tuy nhiên, có số subtype định thường xuyên lưu hành người H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11] Cúm A/H5N1 subtype có khả gây nhiễm cao virus cúm Các chủng virus cúm gia cầm xâm nhiễm v o nhiều oại động vật khác chim ợn ngựa hải cẩu cá voi v người Virus cúm B virus cúm C lưu hành chủ yếu người gây vụ dịch mức độ vừa v nhỏ 10 Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiple RT-PCR : Thang DNA chu n 100 bp; NC: Chứng âm; Số chu kỳ phản ứng ghi 3.3.5 Đánh giá độ nhạy phản ứng multiplex RT-PCR Phản ứng thực với mẫu chuẩn RNA cúm A/H5N1 có n ng độ khác từ 101 đến 1010 RNA/ v sử dụng 10 để điện di ge agarose Kết điện di gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide cho thấy phản ứng dương tính với cúm A/H5N1 tức quan sát băng DNA có kích thước 154 bp (M), 292 bp (NA) 371 bp (HA) mẫu có từ 10/µl RNA trở ên (hình 3.12) Hình 3.12: Th nghiệm đánh giá độ nhạy phản ứng multiplex RT-PCR M: thang DNA 100 bp; NC: Chứng âm; Số lượng RNA m u th ghi phía 3.3.6 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng multiplex RT-PCR Phản ứng tiến h nh với RNA số virus cúm khác (cúm ; cúm A/H1N1; cúm A/H5 v cúm A/H3 subtype N1) để kiểm tra độ đặc hiệu 66 phản ứng Kết điện di (hình 3.13) cho thấy phản ứng multiplex RT-PCR phát đ ng thời gen (154 bp - M, 292 bp - NA, 371 bp - HA) với RNA virus A/H5N1; phát gen (292 bp - NA, 154 bp - M) với RNA virus cúm A/H1N1; phát gen (371 bp - HA; 154 pb - M) với RNA virus cúm A/H5; phát gen (154 bp - M) với RNA virus cúm A/H3 không phát gen với RNA virus cúm B Ngo i thực phản ứng với vật iệu di truyền số o i khác (người, Escherichia coli, Mycobacteria tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gorrnorhea, Hepatitis B virus, Hepatitis C virus, Human immunodeficiency virus, Human Papillomavirus) phản ứng multiplex RT-PCR cho kết âm tính Điều chứng tỏ với cặp m i thiết kế phản ứng multiplex RT-PCR tối ưu đặc hiệu với virus cúm A subtype H5 subtype N1, khơng có phản ứng chéo với RNA lồi khác Hình 3.13: Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiệu phản ứng multiplexRT-PCR : thang DNA chu n 100 bp; NC: Chứng âm; 1: cúm A H5; 2: cúm A/H3; 3: cúm B; 4: cúm A H5N1; 5: cúm A/H1N1 Như sau tối ưu, th nh phần v điều kiện chu trình nhiệt phản ứng mu tip ex RT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1 : Thành phần phản ứng (bảng 3.12): Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR tự inh phẩ hể t h l) RNase free water 20.75 Qiagen Onestep RT-PCR buffer 5X 10 67 Nồng độ cuối 1X dNTP mix 10 mM each 0.4 mM each Diag MF 10 M 1.5 0.3 M Diag MR 10 M 1.5 0.3 M Diag H5F 10 M 2.5 0.5 M Diag H5R 10 M 2.5 0.5 M Diag N1F 10 M 0.4 M Diag N1R 10 M 0.4 M Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix RNase Inhibitor 40 U/l 0.25 10 U RNA template pg – g Tổng thể tích phản ứng 50 Chu trình nhiệt (bảng 3.13): Bảng 3.13: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR tự Nhiệt độ oC) hời gi n ố hu ỳ 50 30 phút 95 15 phút 94 30 giây 57 30 giây 72 30 giây 72 phút 45 3.4 Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 mẫu bệnh phẩm 68 Các mẫu bệnh phẩm tiến hành xử lý tách chiết RNA sinh phẩm QIAamp viral RNA mini spin protocol Sản phẩm RNA tách chiết đo OD 260 nm v 280 nm để xác định h m ượng RNA v xác định độ tinh RNA mẫu bệnh phẩm Kết đo OD cho thấy, tỷ lệ OD260/OD280 nằm khoảng 1.8-2.0, RNA tách chiết khơng lẫn protein Sau đó, RNA mẫu bệnh phẩm sử dụng để thực phản ứng multiplex RT-PCR phát gen M, HA NA virus cúm gia cầm A/H5N1 Đối với mẫu bệnh phẩm chưa biết chưa biết có nhiễm H5N1 hay khơng, thực phản ứng RT-PCR phát gen riêng rẽ để so sánh kiểm tra độ tin cậy phản ứng multiplex RT-PCR - Kết k thuật multiplex RT-PCR thử nghiệm 14 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1 (2 mẫu từ ngan mẫu từ vịt mẫu từ g v mẫu từ người) điện di (hình 3.14) cho thấy phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 14 mẫu bệnh phẩm Hình 3.14: ết th nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR m u bệnh ph m dương tính M: thang DNA chu n 100 bp; NC: Chứng âm; md: muscovy duck; ck: chicken; d: duck 1, 2, 3; h: human 1, 2, 3, 4, 5, Qua kết cho thấy, k thuật multiplex RT-PCR tối ưu hoá với cặp m i thiết kế đặc hiệu nhạy K thuật áp dụng để xác định virus cúm A/H5N1 đối tượng vật chủ khác nhau: gia cầm người - Kết thử nghiệm k thuật multiplex RT-PCR tối ưu phát có mặt virus cúm gia cầm A/H5N1 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm chết bị bệnh vụ dịch cúm: 69 Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 gel agarose 2% mẫu bệnh phẩm (hình 3.15) cho thấy mẫu chứng âm không bị nhiễm, mẫu dương tính (số 1, 3, 5, 6, 9) lên band (371 bp- HA, 292 bp- NA, 154 bp- M) tương đương với band chứng dương Các mẫu âm tính (số 2, 4, 10) khơng xuất band Hình 3.15: ết th nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số m u bệnh ph m M: Thang DNA chu n 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương; 1-10: M u bệnh ph m Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát gen M, HA NA mẫu bệnh phẩm (hình 3.16) cho thấy: Các mẫu âm tính (khơng xuất band nào) mẫu dương tính (xuất band phản ứng RT-PCR với cặp m i hình 3.16 A, B, C) mẫu âm tính v dương tính phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đốn Như vậy, khẳng định kết phản ứng multiplex RT-PCR ho n to n đáng tin cậy V khẳng định độ nhạy v độ đặc hiệu phản ứng không đổi kết hợp m i phản ứng (A) 70 (B) (C) Hình 3.16: ết th nghiệm phản ứng RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số m u bệnh ph m A: RT-PCR phát gen M; B: RT-PCR phát gen HA; C: RT-PCR phát gen NA M: Thang DNA chu n 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương; 1- 10: M u bệnh ph m Trong 30 mẫu bệnh phẩm thử nghiệm, k thuật multiplex RT-PCR RT-PCR phát mẫu dương tính (30%) với virus cúm gia cầm A/H5N1, 21 mẫu âm tính (70%) với virus cúm gia cầm (bảng 3.14) Kết k thuật multiplex RT-PCR phát đ ng thời gen có độ nhạy v độ đặc hiệu khơng thay đổi so với phản ứng RT-PCR phát gen riêng biệt Độ đặc hiệu phản ứng 100 độ nhạy cao, phát phản ứng có từ 10 virus trở lên Bảng 3.14: So sánh kết xét nghiệm phản ứng RT-PCR multiplex RTPCR m u bệnh ph m Kỹ thuât xét nghiệ Dương t nh Âm tính Tổng Multiplex RT-PCR 21 30 RT-PCR 21 30 Tỷ lệ 30% 70% 100% 71 So sánh thời gian chi phí làm xét nghiệm k thuật multiplex RTPCR RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 (bảng 3.15) cho thấy: thời gian hoàn thành xét nghiệm với phản ứng RT-PCR khoảng 9.5 giờ, chi phí hết 600 ng n đ ng; thời gian hoàn thành xét nghiệm với phản ứng multiplex RT-PCR khoảng 6.5 giờ, chi phí hết 320 ng n đ ng Như vậy, phản ứng multiplex RT-PCR rút ngắn thời gian làm xét nghiệm tích kiệm chi phí hố chất đến nửa so với phản ứng RT-PCR Bảng 3.15: So sánh thời gian chi phí hố chất làm xét nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR RT-PCR Xét nghiệm Các bƣớc làm xét nghiệm RT-PCR Xử lý mẫu tách chiết RNA Thực phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát Tổng Xử lý mẫu tách chiết RNA Thực phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát Tổng Multiplex RT-PCR Thời gian (giờ) Chi phí (ngàn đồng) 150 420 1.5 9.5 30 600 150 140 1.5 6.5 30 320 Thảo luận Trong năm gần dịch cúm gia cầm virus cúm A/H5N1 xảy nhiều nước đặc biệt nước khu vực Đông Nam Á Không gây bệnh gia cầm virus cúm A/H5N1 ây nhiễm v gây bệnh người với tỉ ệ tử vong cao Theo Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam nước có số người tử vong cúm A/H5N1 đứng thứ giới sau Indonesia Ở nước ta dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy v b ng phát úc n o Khi dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát, việc điều trị, kiểm soát v ngăn chặn khẩn cấp dịch cúm lan rộng vơ quan trọng Do việc xây dựng k thuật chẩn đoán nhanh, nhạy v xác virus cúm A/H5N1 cấp thiết để sàng lọc số ượng lớn loại virus Trong k thuật phân tử chẩn đoán virus cúm phản ứng multiplex RT-PCR xem tốt cho kết nhanh, nhạy xác tiết kiệm chi phí hố chất cho 72 xét nghiệm (Ellis et al., 1997; Fan et al., 1998; Osiowy, 1998; Grondahl et al., 1999; Liolios et al., 2001; Xie et al., 2006; Bellau-Pojul et al., 2005 and Thontiravong et al., 2007) Trong nghiên cứu k thuật multiplex RT-PCR với cặp m i cho phép phát đ ng thời trình tự đặc hiệu virus cúm A (trên gen M) subtype H5 (trên gen HA) v subtype N1 (trên gen NA) xây dựng th nh công K thuật multiplex RT-PCR thực theo phương pháp bước (phản ứng phiên mã ngược phản ứng khuếch đại thực tube phản ứng) nên giảm thiểu tối đa nguy ngoại nhiễm Mặt khác, thời gian làm xét nghiệm giảm đáng kể so với phương pháp hai bước (phản ứng RT PCR thực tube riêng biệt) k thuật RT-PCR phát gen riêng biệt Kết thử nghiệm cho thấy k thuật multiplex RT-PCR đặc hiệu với virus cúm A/H5N1 v có độ nhạy cao có khả phát mẫu thử có từ 10 virus trở ên So với k thuật RT-PCR phát gen riêng biệt đô nhạy độ đặc hiệu phản ứng multiplex không bị giảm Thử nghiệm 14 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A/H5N1 (8 mẫu thu thập từ gia cầm v mẫu từ người) phản ứng multiplex RT-PCR khuếch đại th nh công gen H5 N1 v M virus Như k thuật n y ứng dụng để phát nhiễm cúm A/H5N1 người v gia cầm Các cặp m i thiết kế đặc hiệu với gen M, HA NA chủng virus cúm phân lập từ vật chủ khác nên k thuật multiplex RT-PCR cịn d ng để phát nhiễm cúm A/H5N1 số động vật có vú khác K thuật multiplex RT-PCR thiết kế với cặp m i có ưu điểm vượt trội như: đơn giản hóa bước q trình xét nghiệm giảm thời gian nghiệm v tiết kiệm khoảng 50 m xét chi phí hóa chất phục vụ cho xét nghiệm Tuy phản ứng multiplex realtime RT-PCR cho kết nhanh, nhạy v xác u cầu có máy móc đại chi phí tốn Do vậy, k thuật multiplex RT-PCR xây dựng thuận tiện cho nhiều phịng thí nghiệm nước ta 73 Kết luận Đã thiết kế cặp m i đặc hiệu với gen M HA v NA d ng để phát virus cúm gia cầm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm phản ứng mutiplex RT-PCR Đã xây dựng th nh công k thuật multiplex RT-PCR cho phép phát nhanh virus cúm A/H5N1 với độ nhạy v độ đặc hiệu cao v áp dụng để phát nhiễm cúm A/H5N1 gia cầm v người K thuật multiplex RT-PCR đặc hiệu với virus cúm A/H5N1 khơng có phản ứng chéo với o i khác K thuật có khả phát mẫu thử có từ 10 RNA trở ên Kiến nghị Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu vào xét nghiệm cúm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm gia cầm v người đề xuất kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng quy trình phản ứng multiplex RT-PCR vào phát virus cúm A/H5N1 số ượng lớn mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm v người bị bệnh vụ dịch cúm Ứng dụng quy trình multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 mẫu thu thập từ gia cầm khoẻ mạnh v mơi trường nơi có dịch cúm xảy để đánh giá ưu h nh virus cúm gia cầm 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Quang Anh (2006), Báo cáo tình hình cúm gia cầm Việt Nam, Hội nghị phòng chống dịch cúm gia cầm Bộ Nông nghiệp phát triển Nơng thơn Lê Thanh Hịa Đinh Duy Kháng Phan Văn Chi Nông Văn Hải Trương Nam Hải, Lê Trần Bình (2004), “Virus cúm A gia cầm mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người” Tạp chí Công nghệ Sinh học 2(1): 1-18 Lê Văn Năm (2004) “ ệnh cúm g ” Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(1): 81-86 Tô Long Th nh (2004) “ ệnh cúm o i chim” Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(2): 53-58 Tiếng Anh Abdel-Ghafar AN, Chotpitayasunondh T, Gao Z, Hayden FG, Nguyen DH, et al, 2008, “Update on avian influenza A (H5N1) virus infection in humans” N Engl J Med, 358, pp 261-73 Apisarnthanarak A, Kitphati R, Thongphubeth K, Patoomanunt P, et al, 2004, “Atypical avian influenza (H5N1)” Emerg Infect Dis, 10, pp 1321- Baigent SJ, McCauley JW (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalklength of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue cu ture” Virus Res, 79(1-2): 177-185 Beare AS and Webster RG (1991), “Replication of avian influenza viruses in humans” Arch Virol., 119, pp 37-42 Beigel JH, Farrar J, Han AM, Hayden FG, Hyer R, de Jong MD, Lochindarat S, Nguyen TK, Nguyen TH, Tran TH, Nicoll A, Touch S, Yuen KY (2005), “Avian influenza A (H5N1) infection in humans” N Engl J Med, 353, pp 1374- 85 10 Bloomberg News articles (2006), Two Bird Flu Gene Mutations Might Lead to Faster Human Spread, Published 11 Butler D (2006), “Alarms ring over bird flu mutations”, Nature, 439, pp 248-9 12 CDC (2009), Interim guidance on the planning for the use of surgical masks and respirators in health care settings during an influenza pandemic 75 13 Chan PK (2002), “Outbreak of avian influenza A (H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997”, Clin Infect Dis, 34(suppl 2):S58- S64 14 Chen H, Smith GJ, Li KS, Wang J, Fan XH, et al (2006), “Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control” Proc Natl Acad Sci USA, 103, pp 2845- 50 15 Chen H G Deng Z Li G Tian Y Li and P Jiao (2004) “The evolution of H5N1 inf uenza viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci USA, 101: p 10452-10457 16 Chotpitayasunondh T, Ungchusak K, Hanshaoworakul W, et al (2005), “Human disease from inf uenza A (H5N1)” Emerg Infect Dis, 11, pp 201- 17 Conenello G, Zamarin D, Perrone L, Tumpey T and Palese P (2007), “A Single Mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 Influenza A Viruses Contributes to Increased Virulence”, PLoS Pathog, 3(10), pp 1414-21 18 De Jong MD, Bach VC, Phan TQ, Vo MH, Tran TT, Nguyen BH, Beld M, Le TP, Truong HK, Nguyen VV, Tran TH, Do QH, Farrar J (2005), “Fatal avian influenza A (H5N1) in a child presenting with diarrhea followed by coma” N Engl J Med, 352, pp 686-91 19 De Jong MD, Simmons CP, Thanh TT, Hien VM, Smith GJ, Chau TN, Hoang DM, Chau NV, Khanh TH, Dong VC, Qui PT, Cam BV, Ha DQ, Guan Y, Peiris JS, Chinh NT, Hien TT, Farrar J (2006), “Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia” Nat Med, 12, pp 1203- 07 20 De Jong MD, Tran TT, Truong HK, Vo MH, Smith GJ, Nguyen VC, Bach VC, Phan TQ, Do QH, Guan Y, Peiris JS, Tran TH, Farrar J (2005), “Oseltamivir resistance during treatment of influenza A (H5N1) infection” N Engl J Med, 353, pp 2667-72 21 Drake J W (1993), “Rate of spontaneous mutation among RNA viruses”, Proc Natl Acad Sci U S A, 90(9): 4171-4175 22 Duan L, Bahl J, Smith G, et al (2008), “The development and genetic diversity of H5N1 influenza virus in China, 1996-2006” Virology, 380, pp 243-54 23 Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, et al (2006), “Evolution of the receptor binding phenotype of inf uenza A (H5) viruses” Virology; 344:432-438 76 24 Greninger A (2004), The Definition and Measurement of Dangerous Research 25 Guan Y, et al (2004), “H5N1 influenza: A protean pandemic threat”, PNAS, 101(21), pp 8156-61 26 Guan Y, et al (2002), “Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR” Proc Natl Acad Sci USA, 99, pp 8950–5 27 Hamada S., Suzuki Y., Suzuki T., et al (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A virus to human-type receptors”, Nature, 444(7117), pp.378-82 28 Harder T C and Werner O (2006), “Avian Influenza”, Influenza, Report 2006 29 Hatta M., et al (2007), Growth of H5N1 Influenza A Viruses in the Upper Respiratory Tracts of Mice, PLoS Pathog 30 Hoa, L.T., D.D Khang, P.V Chi, N.V Hai, T.N Hai, N.T.B Nga, and L.T inh (2006) “Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during 2004 – 2006” Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture, p 68-71 31 Hui DS (2008), “Review of clinical symptoms and spectrum in humans with influenza A/H5N1 infection” Respirology, 13(suppl 1):S10-S13 32 International Committee on Taxonomy of Viruses Index of Viruses (2009), Orthomyxoviridae, In: ICTVdB - The Universal Virus Database, version B#chen-Osmond, C (Ed), Columbia University, New York, USA 33 Julkunen I, Pyhala R, Hovi T, 1985, Enzyme immunoassay, complement fixation and hemagglutination inhibition tests in the diagnosis of influenza A and virus infections” Purified hemagglutinin in subtype-specific diagnosis, J Vir.Methods 10, 75-84 34 Kandun IN, Wibisono H, Sedyaningsih ER, Yusharmen, Hadisoedarsuno W, et al (2006), “Three Indonesian clusters of H5N1 virus infection in 2005” N Engl J Med, 355, pp 2186-94 77 35 Katz JM, Lim W, et al (1999), “Antibody response in individuals infected with avian influenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among household and social contacts”, J Infect Dis, 180, pp 1763-70 36 Lamb RA and Krug RM (2001), “Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Rep ication” Fields Virology, 4th Edition, (D.M Knipe and P.M Howley, eds), pp 1487-1531 37 Lamb RA (1989), Genes and proteins of the influenza viruses In: Krug R M, editor The influenza viruses 1st ed New York, N.Y: Plenum Press 38 Le, Q., M Kiso, K Someya, Y Sakai, T Nguyen, K Nguyen, N Pham, H Nguyen, S Yamada, Y Muramoto, T Horimoto, A Takada, H Goto, T Suzuki Y Suzuki and Y Kawaoka (2005) “Avian flu: isolation of drugresistant H5N1 virus” Nature, 437(7062): p 1108 39 Lee C W., Suarez D., Tumpey T., et al (2005), “Characterization of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Viruses Isolated from South Korea”, Journal of Virology, 79(6), pp 3692-3702 40 Luong G and P Pa ese (1992) “Genetic ana ysis of inf uenza virus”, Curr Opinion Gen Develop, 2: p 77-81 41 Ng EK, Cheng PK, Ng AY, Hoang TL, and Lim WW (2005), “Influenza A H5N1 detection” Emerg Infect Dis., 11, pp 1303-5 42 Rowe T, Abernathy RA, Hu-Primmer J, et al (1999), Detection of Antibody to Avian Influenza A (H5N1) Virus in Human Serum by Using a Combination of Serologic Assays, J Clin Microbiol, 37(4), pp 937- 43 43 Sastre A (2006), Antiviral Response in Pandemic Influenza Viruse, CDC, vol 12 number 44 Senne, DA, Panigrahy, B, Kawaoka, Y, Pearson, JE, Suss, J, Lipkind, M, Kida, H and Webster, RG (1996) “Survey of the hemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses: amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potentia ” Avian Diseases, 40: 425-437 78 45 Swayne DE and Halverson DA (2007), Diseases of Poultry: Influenza, 12th edn Ames, IA: Blackwell Publishing Professional 46 Takano R, Nidom CA, Kiso M, Muramoto Y, Yamada S, Sakai-Tagawa Y, Macken C, Kawaoka Y (2009), “Phylogenetic characterization of H5N1 avian influenza viruses isolated in Indonesia from 2003-2007” Virology, 390, pp 13-21 47 Tran TH, Nguyen TL, Nguyen TD, Luong TS, Pham PM, et al (2004), “Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam”, N Engl J Med, 350, pp 1179-88 48 Uiprasertkul, M., R Kitphati, P Puthavathana, R Kriwong, A Kongchanagul, K Ungchusak, S Angkasekwinai, K Chokephaibulkit, K Srisook N Vanprapar and P Auewaraku (2007) “Apoptosis and pathogenesis of avian inf uenza A (H5N1) virus in humans” Emerg Infect Dis, 13(5): p 708-712 49 WHO inter-country-consultation, influenza A/H5N1 in humans in Asia: Manila, Philippines, 6-7 May 2005 50 World Health Organization (2009), Continuing progress towards a unified nomenclature system for the highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses 51 Xu C, Dong L, Xin L, Lan Y, Chen Y, Yang L, Shu Y (2009), “Human avian influenza A (H5N1) virus infection in China” Science, 52, pp 407–11 52 Yamada S, Suzuki Y, Suzuki T, Le MQ, Nidom CA, Sakai-Tagawa Y, Muramoto Y, Ito M, Kiso M, Horimoto T, Shinya K, Sawada T, Kiso M, Usui T, Murata T, Lin Y, Hay A, Haire LF, Stevens DJ, Russell RJ, Gamblin SJ, Skehel JJ, Kawaoka Y (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses human-type receptors” Nature, 444(7117): 378-382 79 80 ... dụng k thuật chẩn đốn cúm A/H5N1 Chính vậy, chúng tơi thực ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình phát nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain. .. phát virus cúm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm người gia cầm, hầu hết phòng xét nghiệm áp dụng k thuật RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) Đây k thuật sinh học phân tử, cho phép phát. .. RT-PCR mẫu bệnh phẩm Để kiểm tra khả ứng dụng k thuật multiplex RT-PCR chuẩn hoá vào phát cúm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm, thực phản ứng mẫu bệnh phẩm xác định dương tính với cúm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm thu