Đang tải... (xem toàn văn)
vi sinh vật (microorganisms) là những sinh vật nhỏ bé đến mức chỉ có thể thấy được chúng dưới kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử.
Bài 10 Nấm men A PHÂN LOẠI NẤM MEN B - CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM DÙNG ĐỂ ĐỊNH TÊN NẤM MEN Quan sát hình thái tế bào nấm men đo kích thước Nhuộm màu tế bào nấm men: - Thuốc nhuộm soudan III: - Thuốc nhuộm đen Soudan B (theo Burdon): - Thuốc nhuộm safranin: - Dung dịch nhuộm nhân tế bào: - Dung dịch lục malachit: Quan sát trình nảy chồi tế bào nấm men - Môi trường mạch nha - cao nấm men - glucoza - pepton: Quan sát khuẩn ty giả: - Môi trường khoai tây - glucoza: - Môi trường ngô: Quan sát bào tử bắn (Ballistoconidium, Ballistospore): - Môi trường bột ngô: Quan sát bào tử túi (ascospore): a Môi trường miếng thạch cao: b Môi trường miếng thạch cao cải tiến: c Môi trường Gorodkowa (1908) d Xử lý với tia tử ngoại: e Môi trường thạch nước f Môi trường Amano (1950) g Môi trường dịch tinh bột khoai tây 0,5% (Almeida Lacaza) h Mơi trường Kleyn: Quan sát đặc tính ni cấy Thí nghiệm xác định khả lên men loại đường Thí nghiệm xác định khả đồng hoá hợp chất cacbon khác nhau: 8.1 Phương pháp đánh giá khả sinh trưởng môi trường dịch thể: 8.2 Sinh trưởng môi trường thạch 8.3 Phương pháp dùng dấu Thí nghiệm xác định khả đồng hố nguồn nitơ 10 Thí nghiệm xác định khả hình thành hợp chất loại tinh bột: 11 Thí nghiệm xác định nhu cầu vitamin cho sinh trưởng nấm men: 12 Đánh giá sinh trưởng mơi trường có nồng độ đường cao 13 Đánh giá phát triển có mặt Cycloheximit 14 Xác định hoạt tính phân giải Urea (hay hoạt tính Ureaza) 15 Thí nghiệm làm đổi màu Diazonium blue B (DBB test) Môi trường Acetat (g/l) (M.C Clary et al., 1959) Môi trường thạch Gorodkowa (Dodder Kreger - van Rij, 1952) (g/l) Môi trường cao ngô (Lodder Kreger - van Rij, 1952) Môi trường thạch V-8 (Wicketam cộng sự, 1946) Môi trường pepton - cao men - glucoza (Vander Walt Codder, 1970) Thành phần môi trường tổng hợp (tinh khiết thành phần hố học) Mơi trường quan sát hình thái tế bào nấm men: Mơi trường nitơ sở: Môi trường carbon sở: 10 Mơi trường khơng có vitamin A PHÂN LOẠI NẤM MEN Thuật ngữ Nấm men (yeast, levure) tên chung để nhóm vi nấm thường có cấu tạo đơn bào thường sinh sôi nảy nở phương pháp nẩy chồi (budding) Nấm men không thuộc taxon phân loại định, chúng thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) ngành Nấm đảm (Basidiomycota) Nảy chồi cách sinh sản vơ tính điển hình nấm men Khi thành tế bào mở để tạo chồi (bud) Chồi phát triển thành tế bào tách khỏi tế bào mẹ từ cịn nhỏ khơng tách lớn tế bào mẹ Nhiều nhiều hệ dính vào tế bào nẩy chồi tạo thành cành nhiều nhánh tế bào giống xương rồng Chồi mọc theo hướng (nẩy chồi đa cực- multilateral budding) nẩy chồi hai cực (nẩy chồi theo hai cực- Bipolar budding) nảy chồi cực định (nẩy chồi theo cực – monopolar budding) Nấm men có hình thức sinh sản phân cắt vi khuẩn Có thể hình thành hay vài vách ngăn để phân cắt tế bào mẹ thành tế bào phân cắt (fission cells) Điển hình cho kiểu phân cắt nấm men thuộc chi Schizosaccharomyces Ở số nấm men thuộc ngành Nấm đảm, sinh dạng bào tử có cuống nhỏ (sterigmatoconidia) bào tử bắn (ballistoconidia hay ballistospore) Bào tử có cuống nhỏ thường gặp chi nấm men Fellomyces, Kockovaella Sterigmatomyces, chồi sinh nhánh nhỏ tách nhánh bị gẫy Bào tử bắn sinh gai nhọn tế bào nấm men bị bắn phí đối diện thành thục Nếu cấy nấm men sinh bào tử bắn thành hình zich zắc thạch nghiêng đĩa Petri sau thời gian ni cấy thấy xuất thành ống nghiệm nắp đĩa Petri có hình zích zắc khác hình thành bào tử bắn lên Bào tử bắn đặc điểm nấm men thuộc chi Bensingtonia, Bullera, Deoszegia, Kockovaella, Sporobolomyces Một số nấm men cịn có hình thức sinh sản vơ tính nữa, việc hình thành bào tử đốt (arthroconidia hay arthrospore) Khi hình thành vách ngăn đầu nấm men dạng sợi, sau tách thành bào tử đốt Loại gặp nấm men thuộc hai ngành: Nấm túi Nấm đảm Thường gặp chi nấm men Galactomyces, Dipodascus (dạng vơ tính Geotrichum) Trichosporon Nấm men cịn tạo thành dạng tản (thallus) dạng khuẩn ty (sợi nấm- hyphae) hay khuẩn ty giả (giả sợi nấm – pseudohyphae) Dạng sinh sản hữu tính nấm men dạng bào tử túi (ascospore) sinh từ túi (asci) Có thể xảy tiếp hợp (conjugation) hai tế bào nấm men tách rời tế bào mẹ chồi Cịn có biến nạp trực tiếp tế bào sinh dưỡng (vegetative cell), tế bào biến thành túi không qua tiếp hợp (unconjugated ascus) Thường túi có hay đơi có bào tử túi Trong số trường hợp lại có 1-2 bào tử túi Bào tử túi chi Saccharomyces có dạng hình cầu, hình bầu dục; chi Hanseniaspora lồi Hansenula anomala có dạng hình mũ ; lồi Hansenula saturnus bào tử túi có dạng xồi có vành đai dạng Sao Thổ Một số bào tử túi có dạng kéo dài hay hình xoắn…Bề mặt bào tử túi nhẵn nhụi, xù xì có gai… Bào tử màng dày (hay bào tử áochlamydospore) dạng bào tử giúp nấm men vượt qua điều kiện khó khăn ngoại cảnh, khơng phải hình thức sinh sản Một số nấm men cịn sinh vỏ nhày Bên cạnh nhiều nấm men có ích loại nấm men dùng để sản xuất rượu trắng, rượu vang, bia, làm nở bột mỳ, tạo sinh khối giàu protein vitamin, sản xuất enzym, sản xuất acid citric từ khí thiên nhiên, sản xuất riboflavin (vitamin B2)… cịn có loại nấm men gây bệnh N= nhân; M= ty thể; Va= không bào; ER= mạng lưới nội chất; Ves= bào nang Bào tử bắn Phân cắt tế bào Nảy chồi Bào tử túi Bào tử màng dày Bào tử đốt Vỏ nhày nấm men Một vài loài nấm men gây bệnh người: Candida albicans Cryptococcus neoformans Để phân loại nấm men người ta phải tiến hành nghiên cứu đặc điểm sau đây: *Đặc điểm hình thái: tế bào, khuẩn lạc, kiểu nẩy chồi, dạng bào tử vơ tính hữu tính, khuẩn ty khuẩn ty giả *Đặc điểm sinh lý sinh hoá: - Lên men 13 loại đường - Đồng hóa 46 nguồn carbon Có thể dùng kít chẩn đốn nhanh ID 32C (Bio Mérieux SA, Marchy-l’Étoile…) - Tính chống chịu với 0,01% 0,1% cycloheximide (có thể bao gồm kit ID 32C) - Đồng hoá nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine, cadaverine dihydrochloride, creatine - Sinh trưởng thiếu hụt số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate, biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic acid - Sinh trưởng nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 37, 420C - Tạo thành tinh bột - Sản sinh acid từ glucoz - Thủy phân Urê - Phân giải Arbutin - Phân giải lipid - Năng lực sản sinh sắc tố - Sinh trưởng môi trường chứa 50% 60% glucoza - Hóa lỏng gelatine -Phản ứng với Diazonium Blue B - Phát triển môi trường chứa acid acetic 1% Để xác định lồi cịn cần phân tích thành phần acid béo tế bào, thành phần đường tế bào, phân tích hệ coenzyme Q, tỷ lệ G+C, đặc tính huyết miễn dịch, giải trình tự ADN lai ADN B - CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM DÙNG ĐỂ ĐỊNH TÊN NẤM MEN Quan sát hình thái tế bào nấm men đo kích thước Khi xác định hình thái kích thước tế bào nấm men người ta thường ni cấy nấm men môi trường thạch - mạch nha môi trường mạch nha dịch thể Nếu sử dụng mơi trường khác hình thái kích thước tế bào nấm men thay đổi, khơng phù hợp với hình thái kích thước tiêu chuẩn ghi bảng phân loại - Môi trường mạch nha: Lấy lúa đại mạch ủ cho nảy mầm (loại nhập dùng để làm bia), đem phơi khô xay nhỏ thành bột Cân 1kg bột này, thêm lít nước, giữ 600C để đường hố hết tinh bột (thử với dịch Lugol không thấy có màu xanh lam) Lọc lấy dịch thêm lòng trắng trứng trộn đều, đun sôi lọc lấy dịch Điều chỉnh nước để có nồng độ đường đạt 6o Baume Phân vào dụng cụ thuỷ tinh khử trùng Nếu làm mơi trường đặc thêm 2% thạch Tốt dùng mầm đại mạch, khơng dùng mầm lúa Nồng độ thích hợp để ni cấy nấm men dùng phân loại 5,7o Baume Có tài liệu lại sử dụng nồng độ 5-80 Baume Nấm men nuôi cấy ống nghiệm thạch nghiêng ống nghiệm đựng ml môi trường dịch thể Ni cấy 25-300C ngày, sau lấy làm tiêu quan sát Muốn đo kích thước tế bào nấm men người ta thường sử dụng trắc vi thị kính) Số tế bào nấm men đo khơng 20 Chú ý phải đo tế bào trưởng thành không đo chồi nảy sinh Tế bào nấm men có hình thái kích thước khác tuỳ lồi, tuỳ chi Chúng có hình cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình chanh châu Âu, hình ống v.v Khi quan sát tế bào nấm men kính hiển vi phân biệt thành tế bào, tế bào chất, không bào (vacuole) hạt dị nhiễm (metachromatic granules) Thành tế bào nấm men thẫm so với ngun sinh chất, cịn khơng bào thường có hình trịn, màu nhạt Các hạt dị nhiễm thường bắt ánh sáng mạnh hơn, chúng lắc lư nguyên sinh chất theo chuyển động Brown Kích thước tế bào nấm men khác nhiều tuỳ loài thuỳ chi, tuỳ điều kiện sinh trưởng thay đổi khoảng 1-5 x 5-30àm hay có dài Kích thước tế bào loại nấm men thơng thường vào khoảng 4-5àm Nhuộm màu tế bào nấm men: Muốn quan sát tế bào nấm men cách tỷ mỷ người ta thường sử dụng loại thuốc nhuộm để nhuộm tế bào số phần tế bào nấm men Có thể dùng loại dung dịch thuốc nhuộm sau đây: - Dung dịch Lugol: Iot Iodua Kali Nước cất 2g 4g 100ml (Nghiền nhỏ I KI cối sứ sau dùng nước hồ tan dần) - Dung dịch xanh methylen (methylene blue) Xanh methylen Nước cất 1g 1000ml (Có thể pha thành dung dịch 1% sau lọc dùng nước cất pha loãng thêm 10 lần nữa) - Dung dịch fuchsin cacbolic: Fuchsin kiềm (basic fuchsin) 0,1g Cồn 900 10ml Dung dịch phenol 3% 90ml (Hoà tan fuchsin cồn, sau trộn vào dung dịch phenol) Có thể dùng que cấy, phết dịch ni cấy nấm men thành lớp mỏng phiến kính sau làm khô, cố định nhuộm đơn xanh methylen hay fuchsin cacbolic nhuộm tiêu vi khuẩn Thường người ta dùng lamelle (lá kính mỏng) để quan sát tế bào nấm men Lấy phiến kính nhỏ lên giọt thuốc nhuộm (xanh methylen chẳng hạn) Giọt thuốc nhuộm không nên to (về sau tràn khỏi lamelle), không nên nhỏ (tạo thành nhiều bọt khí đậy lamelle) Lấy nấm men ni cấy 2-3 ngày hồ vào giọt thuốc nhuộm Đặt cạnh lamelle sát vào phía giọt mẫu hạ từ từ lamelle xuống cho giọt mẫu tràn khắp lamelle Nếu tràn dùng giấy lọc thấm bớt Soi vật kính nhỏ trước, sau chuyển sang vật kính lớn Có thể vào mức độ bắt màu đậm nhạt để phân biệt tế bào sống tế bào chết Muốn quan sát hạt glycogen tế bào nấm men nhuộm dung dịch Lugol Tế bào có màu vàng nhạt cịn hạt glicogen có màu đỏ nâu Muốn quan sát giọt mỡ tế bào nấm men làm tiêu sau: Rỏ giọt formalin lên phiến kính, dùng que cấy lấy nấm men ni cấy 4872 hoà vào giọt formalin Để yên phút sau thêm giọt dung dịch thuốc nhuộm xanh methylen, lại thêm giọt thuốc nhuộm soudan III Đặt lamelle kính hiển vi quan sát ta thấy nguyên sinh chất tế bào nấm men bắt màu lam nhạt, khơng bào khơng bắt màu cịn giọt mỡ có màu đỏ hồng - Thuốc nhuộm soudan III: Soudan III 0,05g Cồn 90% 100ml Cũng nhuộm giọt mỡ phương pháp sau đây: Lấy thuốc nhuộm đen Soudan B (Soudan black B) cho vào ống nghiệm Dùng que cấy lấy nấm men hồ vào dịch thuốc nhuộm Giữ 20 phút Lấy khoảng vịng que cấy dịch thuốc nhuộm có nấm men phết lên phiến kính Làm khơ tự nhiên Nhuộm tiêu 30 giây dịch thuốc nhuộm safranin Rửa nước, đợi khơ soi kính Ngun sinh chất tế bào nấm men có màu đỏ nhạt cịn giọt mỡ có màu đen lam - Thuốc nhuộm đen Soudan B (theo Burdon): Soudan black B Cồn 70% 0,3g 100ml (Trộn đều, để 24 sử dụng Dùng vòng tháng) - Thuốc nhuộm safranin: Dịch safranin 2,5% (trong cồn 95%) Nước cất 10ml 100ml Muốn nhuộm nhân tế bào nấm men sử dụng phương pháp sau đây: Lấy giọt nước đặt lên phiến kính Dùng que cấy lấy nấm men hồ vào giọt nước dàn thành vết mỏng Làm khô tự nhiên Thêm vài giọt dung dịch picroformol, giữ vài phút sau rửa cồn 70% Ngâm tiêu vào dung dịch FeNH4(SO4).12H2O 3% 4-7 Lấy tiêu dùng nước rửa sau lại ngâm vào dịch thuốc nhuộm hematoxilin 10% 24 Lấy rửa nước lại ngâm vào dịch FeNH4(SO4).12H2O vừa màu lấy rửa nước, làm khơ soi kính Nguyên sinh chất tế bào nấm men có màu tro cịn nhân tế bào có màu đen - Dung dịch nhuộm nhân tế bào: + Dung dịch picroformol: Dung dịch acid picric bão hoà 75 phần Axetit acetic glacial phần Dung dịch fomol loãng 20 phần + Dung dịch ngâm FeNH4(SO4)2.12H2O FeNH4(SO4)2.12H2O Nước 3g 100ml + Dung dịch thuốc nhuộm hematoxilin Hematoxilin 1g Cồn 10ml Nước 90ml Hồ tan hematoxilin cồn, sau thêm nước, đậy nút để tháng sau sử dụng Để quan sát tế bào nấm men dùng dung dịch nigrozin 5% Khi tế bào khơng bắt màu, phân biệt rõ màu lam đen Để quan sát bào tử túi (tránh lầm với khơng bào) sử dụng số phương pháp nhuộm bào tử giới thiệu chương IV (phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập NXB KHKT 1971) Cũng nhuộm bào tử túi phương pháp sau đây: Rỏ giọt nước lên phiến kính Dùng que cấy lấy nấm men trộn vào giọt nước, dàn thành vết mỏng, để khô tự nhiên Cố định lửa đèn cồn, nhuộm dung dịch lục malachit Nhuộm phút, thường xuyên hơ lửa cho bốc (không đun sôi) Rửa nước nhẹ, nhuộm thêm 30 giây dung dịch safranin 0,5% nước Nang bào tử bắt màu xanh lục cịn tế bào dinh dưỡng có màu hồng - Dung dịch lục malachit: Lục malachit (malachite green) Nước 1g 100ml (khơng đun nóng) Quan sát q trình nảy chồi tế bào nấm men (sử dụng cho tế bào nấm men dinh dưỡng khơng có dạng sợi - non filamelletous vegetative cells) Cấy vòng que cấy tế bào nấm men ngày tuổi vào bình nón loại 100ml chứa 30ml môi trường dịch thể (môi trường nước chiết mạch nha, môi trường cao nấm men-peptonglucoza hay môi trường mạch nha - cao nấm men - glucoza - pepton) - Môi trường mạch nha - cao nấm men - glucoza - pepton: Cao mạch nha (malt extract) 3g Cao nấm men (yeast extract) 3g Glucoza 10g Pepton 5g Nước 1000ml Ni cấy bình nón 25-280C sau hai đến ba ngày tiến hành lấy mẫu quan sát Khi quan sát kính hiển vi cần phân biệt nấm men sinh sản theo cách nảy chồi hay phân cắt hai - Nếu nảy chồi chồi xuất đâu? hai đầu (hai cực) hay vị trí tế bào? Số lượng chồi tế bào mẹ? - Chồi sau phát triển có rời khỏi tế bào mẹ hay khơng? - Dạng kích thước tế bào? Chú ý: phương pháp phải dùng với môi trường xác định pha sinh trưởng logarit tế bào Quan sát khuẩn ty giả: Có số nấm men phát triển môi trường nuôi cấy lâu hay điều kiện thiếu oxy tạo thành tế bào dài, xếp nối tiếp nhau, gọi khuẩn ty (mycelium) Người ta phân biệt hai loại khuẩn ty: khuẩn ty giả khuẩn ty thật Khuẩn ty thật tế bào dạng sợi có vách ngăn, khuẩn ty giả tế bào dạng sợi khơng có vách ngăn Việc tạo thành khuẩn ty đặc điểm quan trọng phân loại nấm men Cũng có loại nấm men phát triển bình thường tạo thành khuẩn ty giả (pseudomycelium) Muốn kiểm tra việc tạo thành khuẩn ty người ta thường nuôi cấy nấm men môi trường pepton - glucoza, môi trường khoai tây - glucoza hay môi trường ngô - Môi trường thạch - pepton - glucoza: Pepton 10g Glucoza 20g Thạch 20g Nước 1000ml - Môi trường khoai tây - glucoza: Nước chiết khoai tây 10% 1000ml Glucoza 20g Thạch 20g Cách làm nước chiết khoai tây: cân 100g khoai tây gọt vỏ, rửa thái nhỏ, thêm 300ml nước, hấp áp lực 1at sau bổ sung nước cho đủ 1000ml - Môi trường ngô: cân 12,5g ngô, thêm 300ml nước đun cách thuỷ 600C giờ, lọc lấy nước Thêm nước cho đủ 300ml Sau thêm 3,8g thạch Hấp áp lực 1at 15 phút Lọc nóng qua bơng thấm nước phân vào ống nghiệm khử trùng áp lực 1at 15 phút Đổ môi trường vào hộp Petri Dùng que cấy, cấy nấm men thành cặp đường song song ngắn, chỗ Dùng panh lấy kính mỏng (thường xun ngâm cịn 70%) đốt nhẹ hết cồn, để nguội chút cẩn thận đặt nhẹ nhàng lên vết cấy Phải cấy để hai đường cấy song song chỗ có chiều ngang nằm gọn kính mỏng, hai đầu dài kính mỏng chút (để sau dễ quan sát) Cần ý bề mặt thạch phải thật khơ, đậy kính mỏng, phải tránh bọt khí, đậy xong phải tránh di chuyển làm xơ lệch kính mỏng Cũng tiến hành theo phương pháp sau đây: đổ môi trường vào hộp Petri, đợi nguội 600C, dùng panh lấy phiến kính (lamelle) đặt nhẹ vào để cho có lớp môi trường bám vào tạo thành lớp mỏng mặt phiến kính Lấp ba phiến kính phủ môi trường đặt vào hộp Petri khác Trong hộp Petri có đựng nước vơ trùng giá thuỷ tinh hình chữ U (các phiến kính đặt thẳng góc so với giá thuỷ tinh) Cấy nấm men thành ba vết phiến kính Phải cấy ba vết cách để vết đặt vừa kính mỏng (các vết cấy song song với chiều rộng phiến kính) Sau đặt kính cách nhẹ nhàng cẩn thận ta đậy hộp Petri lại nuôi cấy 25-300C 4-5 ngày Lấy quan sát vết cấy kính hiển vi Một vài phịng thí nghiệm làm theo cách sau: nhỏ mơi trường thạch nóng lên bề mặt phiến kính, láng để tạo thành lớp thật mỏng Sau khô bề mặt, cấy đường dọc theo lam Lấy kính mỏng đặt lên đường cấy Đặt phiến kính vào đĩa Petri cho nước vơ trùng để tránh khơ mơi trường Quan sát kính hiển vi vài ngày Với phương pháp dễ dàng quan sát thấy việc tạo thành khuẩn ty số loại nấm men Quan sát bào tử bắn (Ballistoconidium, Ballistospore): Lấy 10-15ml môi trường nước chiết mạch nha, môi trường khoai tây - glucoza hay môi trường bột ngô đưa vào đĩa Petri thạch đông (nhớ làm khô vô trùng mặt thạch) lấy que cấy để cấy nấm men theo hai đường vng góc sau úp ngược lên đĩa Petri khác chứa môi trường không cấy nấm men Trong đĩa Petri chứa lamelle vô trùng, để 200C sau tuần bào tử bắn tạo thành khuẩn lạc đĩa Petri chứa mơi trường phía lấy phần lamelle mang bào tử bắn để đưa quan sát kính hiển vi - Mơi trường bột ngơ: Cân 60 gam bột ngơ hồ vào 500ml nước sôi Đun sôi tiếp Lọc qua vải Thêm nước cho đủ 1000ml, thêm 20g thạch Đun cho tan thạch phân vào dụng cụ thuỷ tinh Khử trùng nồi áp lực 120 phút 30 phút Cũng phát bào tử bắn theo cách khác sau: Cấy loại nấm men nghi ngờ có hình thành bào tử bắn lên môi trường thạch - mạch nha (trên đĩa Petri hay ống nghiệm thạch nghiêng) Sau ngày nuôi cấy mặt thủy tinh đối diện với vết cấy có hình ảnh mờ giống hệt với hình dáng vết cấy Đó bào tử bắn bắn lưu lại phía đối diện vết cấy Hoặc cấy nấm men theo đường thẳng zich zăc vào đĩa Petri chứa môi trường bột ngô, để 200C sau thời điểm 3, 5,7,10, 15 ngày Úp ngược đĩa Petri lên phiến kính sạch, để qua đêm Quan sát bào tử bắn phiến kính kính hiển vi Quan sát bào tử túi (ascospore): Một số nấm men có khả hình thành bào tử hữu tính gọi bào tử túi (ascospore hay asconidium) Bào tử túi có khả bảo vệ nấm men chống lại với nhiều ảnh hưởng có hại điều kiện ngoại cảnh Thường quan sát thấy bào tử túi nấm men môi trường nuụi c?y lõu Có thể việc tích luỹ số sản phẩm trao đổi chất kích thích q trình tạo thành bào tử túi Trong tế bào loại nấm men sinh bào tử túi thường tạo thành số lượng bào tử túi định Khi chứa bào tử túi tế bào gọi túi (asci, số - ascus) Thường túi có bào tử, số lồi có 1-2 bào tử, số lồi lại có tới bào tử Bào tử túi nấm men có hình dạng khác nhau, đặc điểm thường dùng phân loại nấm men Saccharomyces cerevisiae nhiều lồi nấm men khác có bào tử túi hình cầu hay hình trứng Hansenula anommala, Hanseniaspora có bào tử túi hình bán cầu, phía có mép vành mũ, Pichia membranaefaciens có bào tử túi vơ quy tắc (có thể có hình trứng, dài, tam giác, bầu dục, bán cầu ), Hansenula saturnus có hình bào tử túi hình xồi, có vành đai nhỏ Bào tử túi Schawanniomyces occidentalis có hình dạng tương tự bề mặt có gai Một số loại nấm men lại có bào tử túi dài, có hình xoắn Thường thường nấm men tạo thành bào tử túi sau 5-10 ngày nuôi cấy môi trường thạch mạch nha Muốn quan sát việc lấy nấm men làm tiêu soi tươi không cần nhuộm màu Mục đích việc quan sát bào tử túi phải trả lời ba câu hỏi sau đây: Nấm men có hình thành bào tử túi hay khơng Bào tử túi hình thành từ tế bào dinh dưỡng khơng xảy tiếp hợp trước sau có tiếp hợp hai tế bào dinh dưỡng; xảy sau có tiếp hợp tế bào mẹ tế bào (tế bào nảy chồi) Nghiên cứu hình dạng bào tử số lượng bào tử túi Cách tiến hành: Nấm men ‘trẻ’ sau nuôi cấy qua đêm đưa vào môi trường malt - cao nấm men - glucoza - pepton để 2-3 ngày sau đưa chuyển vào mơi trường sinh bào tử Giữ 250C ngày quan sát kính hiển vi Nếu khơng quan sát thấy bào tử lại tiếp tục giữ quan sát tuần tuần liền Các môi trường hình thành bào tử sử dụng môi trường: V-8-agar, Gorodkowa-aga, acetat-agar, malt-yeast-glucoza, pepton-agar, malt-acetat-agar Tuy nhiên thường sử dụng môi trường sau: a Môi trường miếng thạch cao: Lấy hai phần bột thạch cao trộn với phần nước làm thành bột nhão sau đổ vào khn làm giấy da bị hay giấy thiếc (đường kính 1-1,5cm, cao 1,5-2cm) Dùng dao làm cho nhẵn bề mặt Sau thạch cao đông ta loại bỏ khuôn giấy cho vào hộp thủy tinh đặc biệt gọi hộp Koch Cũng làm miếng thạch cao hình trịn sau cho vào hộp Petri Đổ nước ngập 2/3 chiều dày miếng thạch cao sau đưa khử trùng (1200C 30 phút) Cấy nấm men tươi (từ thạch nghiêng nuôi cấy 48 tuổi) Giữ 250C vài ngày, lấy làm tiêu quan sát bào tử túi Tsetlin (1913) đề nghị trước cấy nấm men sang môi trường miếng thạch cao nên chuẩn bị nấm men tươi mơi trường có thành phần sau: Nước cất: 100 ml Glucoza: 5g KH2PO4: 0,2g CaCl2: 0,05g MgSO4: 0,05g FeSO4: 0,001g (NH4)2SO4: 0,5g b Môi trường miếng thạch cao cải tiến: Cách tiến hành bề mặt miếng thạch cao làm ẩm nước mạch nha lỗng dung dịch có chứa 2% manitol 0,5% KH2PO4 c Môi trường Gorodkowa (1908) Nước thịt: 1g Pepton: 1g NaCl: 0,5 g Glucoza: 0,25 g Thạch: 2g Nước: 100ml d Xử lý với tia tử ngoại: Cấy nấm men lên môi trường Gorodkowa (môi trường c) chiếu tia tử ngoại theo thời gian khác nhau: 5, 10, 15 phút Sau tiếp tục ni cấy quan sát bào tử túi e Môi trường thạch nước: Môi trường môi trường nghèo có nước thạch, khơng bổ sung thêm chất dinh dưỡng khác f Môi trường Amano (1950) Amano đề nghị dùng phương pháp sau: Cấy truyền hai lần nấm men môi trường thạch thịt pepton, lấy nấm men nuôi cấy 24 cấy sang môi trường sau đây: Glucoza: Axetat Na không ngậm nước: 0,4 g 1,4 g Thạch: 20 g Nước: 1000 ml g Môi trường dịch tinh bột khoai tây 0,5% (Almeida Lacaza) Cấy nấm men lên môi trường nuôi cấy 370C, sau quan sát bào tử túi theo thời điểm thích hợp h Mơi trường Kleyn: Natri glutamat (hay asparagin, pepton, glixin): 0,25g Glucoza: 0,062g NaCl: 0,062g Natri axeta: 0,5g KH2PO4: 0,012 g K2HPO4: 0,02g Biotin (có thể không cần): 2 Dịch hỗn hợp I: ml Thạch: 2g Nước: 100 ml Cách pha dịch hỗn hợp I: MgSO4 - 0,4g; CuSO4 - 0,002g; FeSO4 - 0,2g; MnSO4 - 0,2g; NaCl 0,4g; nước cất - 100ml) Chú ý: Quan sát bào tử túi đặc điểm quan trọng phân loại, nhiên số trường hợp khó phát thấy bào tử túi Điều ngun nhân sau: - Mơi trường sinh bào tử túi khơng thích hợp - Chủng nghiên cứu dị tản (heterothalic) hay đồng tản (homothalic) - Bào tử túi khó phát người làm phân loại thiếu kinh nghiệm - Nấm men nghiên cứu thuộc loại không sinh bào tử túi (anascoporogenous) Quan sát đặc tính ni cấy Để quan sát đặc tính ni cấy nấm men người ta thường cấy nấm men lên môi trường dịch thể, môi thường thạch nghiêng môi trường thạch đĩa (hoặc dùng chai Roux) Cấy nấm men vào ống nghiệm đựng 3ml môi trường mạch nha 10-150 Baling (xem phần “Quan sát hình thái tế bào nấm men đo kích thước”) Ni cấy 250C sau 24 giờ, 48 giờ, 72 198 lấy quan sát Cần quan sát xem nấm men có phát triển bề mặt dịch thể hay khơng Nếu có chúng tạo thành váng phủ kín, váng phủ khơng kín hay tạo thành vòng quanh thành ống nghiệm Nấm men có lắng xuống quan sát xem cặn có dạng xốp, dạng nhày hay dạng rắn Quan sát xem chất dịch hay trở nên đục Dùng tay đập khẽ vào đáy ống xem cặn có lên hay khơng (nếu cặn xốp dễ lên, cặn rắn khó lên) Dùng que cấy khều cặn, cặn nhày dễ khều lên tảng, khơng khó khều Nếu có váng cần quan sát xem bề mặt váng nào, khô hay ướt, phẳng mịn hay nhăn nheo cần quan sát xem váng dày hay mỏng Để quan sát phát triển nấm men môi trường thạch nghiêng ta cấy nấm men lên trường thạch - mạch nha 12-150 Baling sau để tủ ấm 25-300C Quan sát ngày nuôi cấy thứ thứ 14 Chú ý quan sát xem bề mặt vết cấy trơn nhẵn hay xù xì, ướt bóng hay khơ, có nếp nhăn hay khơng, màu sắc nào, mép thẳng hay mép cưa v.v Để quan sát khuẩn lạc ta đem môi trường thạch - mạch nha môi trường gelatin - mạch nha phân vào hộp Petri hay bình Roux, bình Kolle Dùng que cấy có đầu nhọn cấy nấm men thành chấm Trước cấy cần làm khô bề mặt (lớp thạch nên đổ dầy khoảng 5mm) Nuôi cấy 250C 14 đến 30 ngày Lấy quan sát khuẩn lạc lớn Cần ý miêu tả: - Kích thước khuẩn lạc (vẽ hình) - Chiều dày khuẩn lạc (phải vẽ hình cắt ngang khuẩn lạc) - Có tạo thành vịng đồng tâm hay khơng? - Có hình tia phóng xạ hay khơng? (từ tâm đến hay từ đến mép?) - Giữa khuẩn lạc lồi lên, lõm xuống hay phẳng? - Bề mặt trơn, nhẵn, bóng, ướt hay xù xì, ráp, có cấu tạo nhung hay gai, có nếp nhăn hay khơng? - Màu sắc khuẩn lạc 7 Thí nghiệm xác định khả lên men loại đường Khả lên men loại đường tiêu quan trọng sử dụng để phân loại nấm men Trong thí nghiệm người ta thường sử dụng môi trường nước chiết giá đậu hay môi trường chiết nấm men 0,5% - Cách làm môi trường nước chiết giá đậu: cân 200g giá đậu thêm 1000ml nước Đun sôi 30 phút Lọc lấy dịch thêm nước cho đủ 1000ml - Cách làm môi trường nước chiết nấm men: cân 200g men bia ép (hay 100g men bia khô) thêm 1000ml nước Hấp nồi hấp áp lực 15 phút nhiệt độ 1200C Lọc nóng qua nhiều lớp giấy lọc Lại lọc nguội tới Thêm nước cho đủ 1000ml Cũng dùng cao nấm men với nồng độ sử dụng 0,5% Cách tiến hành: - Sử dụng ống nghiệm có kích thước 180 x16 mm Đặt ngược ống Durham (50x6mm) (miệng ống Durham chạm đáy ống nghiệm) - Phân 10-15ml môi trường sở (0,5% cao nấm men) chứa nguồn đường khác nhau, nồng độ 50mM (tương đương 1%) riêng với rafinoza 100mM (tương đương 2%) Riêng ống kiểm tra khơng có nguồn đường ống đối chứng D-glucoza Các ống nghiệm chứa môi trường khử trùng sau cấy vào 100μl (khoảng giọt) dung dịch huyền phù nấm men có mật độ 107 tế bào/ml, để 250C sau tuần - Quan sát việc tạo CO2 đáy ống Durham để biết nấm men có hay khơng có khả lên men nguồn đường Có nấm men phát triển bề mặt dịch huyền phù chúng có khả đồng hố nguồn đường - Chú ý: Theo phương pháp số trường hợp CO2 tạo thấp phải xác định điện cực CO2 hay dùng áp kế Warburg Trong điều kiện có q lượng đường dùng làm thí nghiệm cịn hút môi trường chứa đường (và cấy nấm men) vào micropipet (hút đến 1/10ml) Đầu pipet sau gắn vaselin (đã trộn thêm với parafin) Nuôi cấy 25-300C ngày quan sát xem có bọt khí sinh hay khơng, mức mơi trường bị đẩy xa nhiều hay Các thí nghiệm tiến hành glucoza Nếu nấm men có khả lên men glucoza làm tiếp thí nghiệm với loại đường khác Mỗi ngày quan sát kết lên men lần, quan sát 10 ngày liền Thí nghiệm xác định khả đồng hoá hợp chất carbon khác nhau: Đây đặc điểm sinh lý quan trọng dùng phân loại Có phương pháp chủ yếu dùng phương pháp đánh giá khả sinh trưởng môi trường dịch thể mơi trường đặc Tuy nhiên cịn sử dụng phương pháp dùng dấu môi trường đặc 8.1 Phương pháp đánh giá khả sinh trưởng môi trường dịch thể: - Sử dụng ống nghiệm có kích thước 100x15mm Các ống nghiệm chứa 1,8 ml môi trường nitơ sở (Nitrogen base) carbon 0,2 ml nguồn carbon 10X Các ống thí nghiệm chứa 1% nguồn carbon nghiên cứu khác (tương đương 50mM), đồng thời làm ống nghiệm kiểm tra âm (khơng có nguồn carbon nào) ống kiểm tra dương dùng nguồn carbon D-glucoza - 46 nguồn carbon gồm: glucoza, galactoza, L-sorboza, sucroza, maltoza, xenlobioza, trelaloza, lactoza, melibioza, raffinoza, melezitoza, inulin, tinh bột tan, D-xyloza, L-arabinoza, D- arabinoza, D-riboza, L-rhamnoza, D-glucosamin, N-acetyl-D-glucosamin, methanol, ethanol, glycerol, erythritol, ribitol, galactitol, D-mannitol, D-glucitol, a- metyl-D-glucosid, salicin, glucono-d-lacton, D-gluconat, 2-ketogluconat, 5-ketogluconat, DL-lactat, succinat, citrat, inositol, hexandecan, saccharat, xylitol, L-arabinitol, propan 1,2 diol, butan 2,3 diol, Dglucuronic acid, D-galacturonic acid - Giống gốc chuẩn bị môi trường thạch - pepton - glucoza - cao men - malt để qua đêm Sau tế bào lấy pha môi trường nitơ sở đạt tới mật độ tế bào 25x106/ml (hay mật độ A640 = 1,0) - Sau lấy 100l cấy vào ống mơi trường chuẩn bị sẵn, sau để tĩnh hay lắc tay lúc (hàng ngày) Cũng lắc nghiêng máy lắc ngang (góc lệch 15-400) hay lắc trịn với nấm men có độ lắng cao Đánh giá sinh trưởng thường dùng mắt so với hai ống dương âm cách đặt miếng bìa trắng vạch đường đen đặt đằng sau ống nghiệm để so sánh Tuy nhiên dùng phương pháp so màu để so sánh với đường chuẩn vẽ từ sinh khối khô (cách thường dùng với tế bào nấm men có tế bào kết dính với nhau) Thí nghiệm kéo dài tuần đến tuần 8.2 Sinh trưởng môi trường thạch ống nghiệm có chứa 15ml mơi trường thạch nitơ sở 450C sau thêm 0,5 ml dịch huyền phù tế bào nấm men chuẩn bị mô tả lắc cho (tránh tạo bọt) Các bước phải thao tác nhanh để thạch không bị đông nấm men không bị chết Sau đổ tồn đĩa Petri vơ trùng để 370C sau 30 phút cho đơng thạch Có thể sau úp ngược để 370C 90 phút để khơ mặt thạch Sau đặt từ 2-5mg loại đường (nguồn carbon) nghiên cứu lên bề mặt thạch gần mép đĩa Petri Thông thường đĩa dùng loại đường khác như: Đĩa thạch chia làm góc, góc khơng cho nguồn carbon (tuy nhiên phải làm thí nghiệm kiểm tra với D-glucoza) Theo dõi kết sau 48 đến tuần 8.3 Phương pháp dùng dấu Đĩa Petri gốc chứa môi trường malt - cao men - glucoza - pepton - thạch chứa khoảng 25 khuẩn lạc nấm men nghiên cứu khác Sau dùng dấu nhung vơ trùng in lên đĩa thạch có nguồn carbon khác (0,5% = 25 mM) (chú ý đánh dấu vị trí đĩa để khỏi bị nhầm lẫn) Một lần in từ đĩa gốc in lên 10 đĩa khác bắt đầu đĩa đối chứng âm (không chứa nguồn carbon nào) cuối đĩa đối chứng dương (chứa D-glucoza) Chú ý thạch sử dụng phải loại thạch tốt không chứa thành phần carbon dễ bị đồng hố Theo dõi thí nghiệm từ 48 đến tuần Thí nghiệm xác định khả đồng hố nguồn nitơ Có khoảng 1/4 chủng nấm men có khả sử dụng nitrat đặc điểm cần cho phân loại Tuy nhiên thành phần khác nitrite, ethylamine, L-lysine, sunfat amơn, cadaverine cần cho thí nghiệm phân loại Phương pháp tiến hành thí nghiệm tương tự nghiên cứu với việc sử dụng hợp chất carbon với môi trường dịch thể môi trường đặc dùng môi trường carbon sở (carbon base) phải nuôi nấm men môi trường carbon sở ngày trước cấy vào nguồn nitơ Do nitrit độc cho nấm men dễ hình thành mơi trường acid pH mơi trường phải điều chỉnh đến 6,5 Dùng phương pháp đánh giá sinh trưởng phù hợp cho việc nghiên cứu khả sử dụng nitrit ethylamin Trong lượng nitrogen dùng nên 2-5mM (0,05-0,1%) Tuy nhiên quan sát thấy sinh trưởng mức độ thấp ống kiểm tra (khơng có nitơ) lượng NH3 khí hồ tan vào mơi trường ... hình thức sinh sản Một số nấm men cịn sinh vỏ nhày Bên cạnh nhiều nấm men có ích loại nấm men dùng để sản xuất rượu trắng, rượu vang, bia, làm nở bột mỳ, tạo sinh khối giàu protein vitamin, sản... Dạng sinh sản hữu tính nấm men dạng bào tử túi (ascospore) sinh từ túi (asci) Có thể xảy tiếp hợp (conjugation) hai tế bào nấm men tách rời tế bào mẹ chồi Cịn có biến nạp trực tiếp tế bào sinh. .. creatine - Sinh trưởng thiếu hụt số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate, biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic acid - Sinh trưởng
