và P dẫ ỉ ôi hoàn ứ ứ v PG Tôi cũ Đặ ứ e Đ Đ E z me P e P Đ d d ứ D ụ A ĐOA L e : "X d ụ d ụ - e e " VAST03/11-13 d P ứ Tô ặ ũ dẫ ỉ õ D ụ Ụ Ụ ụ L L ụ ụ D ụ D ụ D ụ ẽ Ở ĐẦU 1 L d ụ ứ ụ ứ Đ ỘI DU G ƯƠ G Ổ G UA ÀI LIỆU 1.1 12 121 e 122 e 123 ụ ụ 132 d 13 131 d (NSAID) ụ ứ De 1321 ụ 1322 ụ - like (TLR) 10 1323 ụ glucocorticoid (GR) 14 -1 e 18 in vitro 19 1 dụ e ỉ e e -kB (NF-kB dependent luciferase reporter assay) 19 dụ ụ dụ ụ ứ ƯƠ G d G 21 L 23 25 GUYÊ LIỆU À P ƯƠ G P ÁP G IÊ 2.1 Nguyên l ỨU 28 28 211 28 2.1.2 Hóa ch t 28 22 P ứu 29 221 e t a chu t (bone marrow-derived macrophage - BMDM) 29 2.2.2 G ứ e 2.2.3 Đ ứ LP 30 e d 30 2.2.4 Đ 22 d Đ 2.2.6 Đ 31 hi u qu ức ch d e ng tín hi u MAPK 31 de 2.2.7 ứ D D -PAGE) 32 33 2.2.8 P 33 2.2.9 X ƯƠ G 3.1 X L 311 34 U À LU d 35 in vitro ụ 35 e 35 312 G dụ ứ d LP 35 313 Đ d 31 38 d ụ L 39 31 d ụ 3.2 X e L 42 d 43 B 3.2.1 43 3.2.2 44 3.2.3 X 46 e 3.2.4 33 B e ứ 331 e e e 48 methyl ferulate 50 eứ e e 50 3.3.2 Methyl ferulate ức ch trình phospho c a y u t t phân bào b ng LPS kích thích thông qua thụ th TLR4 51 LU DA À ĐỀ G Ị 54 Ụ ÀI LIỆU P Ụ LỤ Á A Ô G Ì ỦA Á GI 55 56 62 DA H Ụ Á THUẬT GỮ V ẾT TẮT ASP Aspirin BMDM Bone marrow derived macrophage COX Cyclo - oxygenase DMSO Dimethyl sulfoxide ELISA Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assay GC Glucocorticoid GR Glucocorticoid receptor HPLC High performed liquid chromatography IL Interleukin kDa Kilo dalton LPS Lipopolysaccharide MAPK Mitogen activated protein kinase NF-kB Nuclear factor kappa, light chain enhancer of activated B cell NMR Nuclear magnetic resonance NSAID Non - steroidal anti - inflammatory drug OD Optical density PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis SDS Sodium dodecyl sulphate TLC Thin layer chromatography TLR Toll - like receptor α Tumor Necrosis Factor alpha DA H B 2.1 D 31 Đ B P ổ 1H 13 Á B G d ứ B Ụ dụ L d 29 e 38 47 DA H Ụ Á HÌ H VẼ, ĐỒ THỊ 11 ụ De L Hình 1.2 Hình 1.3 LP Hình 1.4 ụ 11 L 13 G d 15 ụ Hình 1.5 -1 B d 17 L Hìn Hình 1.9 18 dụ e e ỉ dụ ụ d G 22 dụ ụ - like (TLRs) 24 e Hình 3.1 e e -kB 21 35 Hình 3.2 LPS kích thích sinh TNFα, IL6, IL10 macrophage A TNFα; B IL6; C IL10 ứ Hình 3.3 e ứ 37 α LP e ặ d 40 Hình 3.4 K ứ e IL ứ LP e ặ d 41 Hình 3.5 K ứ e IL10 ứ LP d 3.6 e ặ 42 dụ ụ -like (TLR) 43 37 B 44 B P ổ 45 PL 10 e H×nh 3.11 C¸c 12 e 46 e 46 methyl ferulate e B e B e 49 e e 13 C AP 50 52 Hình 3.14 Methyl ferulate ức ch trình phospho c a p38 (P-p38) BMDM 53 Ở ĐẦU chọn đề tài ẩ ặ ặ ẩ d d ẫ ặ ẫ ụ é d dẫ … ũ ặ e D 000 2000 22 33 ứ dùn ũ d [6] d dụ ứ ứ d ụ ứ dụ dụ ẩ ụ ụ ứ e ẫ ĩ ứ ứ dụ ứ Nam, t ũ ứ Đ dụ ẩ 48 C e e e ặ nên viêm Tuy nhiên, B ũ ứ 3.2.4 Quy t ình tinh ch ch t h n i methyl ferulate e 3.11 C ,b B ẫ , e e dụ E dụ e e t B e e 49 B t rễ Bách b (2 kg) Chiết MeOH-H2O (4:1) Cất loại bỏ dung ôi C o chiết tổng (18 g) TLC C t i ic g (10 hân đoạn) Ether : acetone gradient (9:1) iể t a IL6, TNF, TLC Phân đoạn (820 mg) C t i ic g (10 hân đoạn) Hexane : ethyl acetate gradien (2:1) iể t a IL6, TNFα, TLC Phân đoạn Sắc kí điều chế Chất (8 mg) TLC HPLC Phân tích NMR Methyl ferulate (85 mg) mg) H×nh 3.11 c bước tinh ch thy u at t B ch 50 3 Bước đầu n hi n c u chế h n 3.3.1 Methyl ferulate viêm tế bào c chế ac opha ch t u at inh c c cytokine tiền i ứ e thy h n chuột ẳ cytokine e , ặ methyl ferulate macrophage chu g/ml hoặ i c v i methyl ferulate n 2,5, i chứng Asp dung môi mang (vehicle) DMSO 0,1% 30 phút ụ BMDM ứ 18 gi c v i LPS 100 ng/ml e kit ELISA 120 IL6 90 pg/ml pg/ml 120 60 2,5 g/ml 10 0 2,5 10 g/ml 120 IFN 90 pg/ml pg/ml 60 Asp 120 60 30 TNF 90 30 30 10 Asp IL 90 60 30 2,5 10 g/ml Hình 3.12 nh hưởn h n Asp i thy u at tế bào 2,5 10 g/ml n ac opha Asp inh cyto in tiền i chuột 51 12 ứ e IL e d IFN, TNF IL10 B ụ 31 ũ Wedelolactone [9] 3.3.2 Methyl ferulate c chế trình phospho yếu tố t phân bào LPS kích thích thông qua th th TLR4 e Protein p38 (mitogen-activated protein kinase - MAPK), e kinase ứ ẩ cytokine, ũ hay autophagy MAP ũ e MAPK (MAPK signal pathway) e d ặ ADN nhân e e 3.13) P e e ine viêm (inflammatory cytokine), lipopolysaccharide (LPS) Protein p38 MAPK ũ CSBP (Cytokinin Specific Binding Protein) tham gia ứ p38 MAPK p38-α (MAPK14), -β (MAPK11), -γ (MAPK12 / ERK6), (MAPK13 / SAPK4) P- d e ne e d e e ứ d tein p38 ứ -δ AP d ứ 52 dụ pamapimod ổ PH-797804 (COPD) [51] Hình 3 Con đư n tín hiệu MAPK dụ Trong e ẫ protein ẫ P-p38 ẩ ứ d ổ d ẫ ẩ ứ ẽ , ẳ e ẽ e P- 3 d ũ e We e dexame BMDM e 100 bào ti p tụ ứ p38 e d t Ở ẫ ứ ẳ P- c v i methyl ferulate (100 nM) ứ c 30 v i LPS (100 ng/ml) 18 gi Sau ly tâm, t c phá v Weste dụ m phá 31 ) e ẫ e ứ d P- 53 D ẫ ứ felulate hay dexamethasone ( d ẫ e ặ ổ ứ LPS kích thích thụ th TLR4 Đ e A Prote ức ch trình phospho c a y u t t phân bào methyl ferulate dụ e e ứ Đ ẳ methyl ferulate ứ e Raf, MEK ũ ứ hay d e d -kB… LPS P-p38 p38 MF D Hình 3.14 Methyl ferulate BMDM Đ ứ D V c chế trình phospho p38 (P-p38) ; Methyl ferulate; D Dexamethasone 54 ẾT UẬ VÀ ĐỀ GHỊ Kết u n -Đ d in vitro ụ L ; ii 100 :i e ứ e / d 60 e iii) ụ d ứ Đ α e ứ IL6, IL10 LP 100 ng/ml e D ứ (Stemona tuberosa Lour.) viêm L B e e -Đ e > 99% s dụ môi ; e dụ - B LP e e e :i trình : e ỉ e ứ - Methyl ferulate ứ e d :1; ii dung môi gradient ether: acetone (9:1) IL6, IFN, ũ B e e: e dụ e e (2:1); iii e TNFα, protein P-p38 MAPK Đề n h ferulate ụ ứ ụ kháng viêm L methyl e 55 DA H Ụ Á Ô G TRÌ H ỦA TÁ G P Đặ Dươn Th 2013 "X ụ l- e d L " Tạp c í Dược ọc 53 (443), tr - 14 macrophage 56 TÀ B ỆU THA 2003 H O Danh lục c c lo ực vậ V ệ a ập , XB õ 2001 Từ đ ể câ B uốc V ệ a , NXB Y h P P A 200 " ứ dụ e ee Premna corymbosa " Tạp c í Dược ọc, 48 (389), tr 22 - 24 Đặ D 200 " " Tạp c í óa ọc (5A), tr 81 - 90 ũ dù Đ Đ l ê cứu ba lo uốc V ệ b c b a u c c ĩ Stemona d D L Đ 2000 ữ câ uốc v vị P uốc V ệ a XB Y B P A 2010 " ứ dụ " Tạp Sapium sebiferum chí Dược ọc 50 (415), tr 36 - 39 P P X A A 2010 " ứ dụ Clerodendrum Chinese var simplex (Mold) " Tạp c í Dược ọc 50 (414), tr 20 - 23 SL Chen 2012 v ả cứu ô qua ê cứu k ả ụ ể Toll-like 4, L c ố vê câ ĩ ọ 57 Đ Đ Tiến Anh 10 Bhattacharjee R., Akira S (2005), "Toll-like receptor rignaling: emerging opportunities in human diseases and medicine", Current Immunology Reviews, 1, pp 81 - 90 11 Brown G D (2006), "Dectin-1: a signaling non-TLR pattern-recognition receptor", Nature, 6, pp 33 - 43 12 Chao W and Lin B (2010), "Isolation and identification of bioactive compounds in Andrographis paniculata (Chuanxinlian)", Chinese Medicine, pp - 17 13 Coghlan M J., Jacobson P B., Lane B., Nakane M., Lin C W., Elmore S W (2003), "A novel anti- fl defi with reduced side effects", Molecular Endocrinology, 17, pp 860 - 869 14 Cohen J (2002), "The immunopathogensis of sepsis", Nature, 420, pp 885 - 991 15 Cuong T T., Yang C S., Yuk J M., Lee H M., Ko S R., Cho B G., Jo E K (2009), "Glucocorticoid receptor agonist compound K regulates dectin-1-dependent inflammatory signaling through inhibition of reactive oxygen species", Life Sciences, 85, pp 625 - 633 16 Elewaut D (2009), "Selective glucocorticoid receptor agonists in rheumatoid arthritis reality or fiction", European Musculoskeletal Review, 4(1), pp 24 - 25 17 Ferwerda B., McCall M B., Verheijen K., Kullberg B J., Van der Ven A J., Van der Meer J W., and Netea M G (2008), "Functional consequences of toll-like receptor polymorphisms", Molecular Medicine, 14, pp 346 - 352 58 18 Hoshino K., Takeuchi O., Kawai T., Sanjo H., Ogawa T., Takeda Y., Takeda K., and Akira S (1999), "Cutting edge: Toll-like receptor (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the LPS gen product", Journal of Immunology, 162, pp 3749 - 3752 19 Huang N., Hauck C., Yum M Y., Rizshsky L., Widrlechner M P., Mccoy J A., Dixon M P., Nicolau B J., Birt D F (2009), "Rosmarinic acid in ethanol extract inhibits lipopolysaccharide- induced prostaglandin E2 and nitric oxide in RAW 264.7 mouse macrophage", Agricultural Food Chemistry, 57, pp 10579 - 10589 20 Janeway C A., Medzhitov R (2002), "Innate immune recognition", Annual Review in Immunology, 20, pp 197 - 216 21 Jo E K (2010), "Innate immunity to mycobacteria: vitamin D and autophagy", Cell Microbiology, 12 (8), pp 1026 - 1035 22 Kino T., De Martino M U., Charmandari E., Mirani M., and Chrousos G P (2003), "Tissue glucocorticoid resistance/hypersensitivity syndromes" Journal of Steroid Biochemistry, 85, pp 457 - 467 23 Kurt-Jones E A., Popova L., Kwinn L., Haynes L M., Jones L P., Tripp R A., Walsh E E., Freeman M W., Golenbock D T., Anderson L J (2000), "Pattern recognition receptors TLR4 and CD14 mediate response to respiratory syncytial virus", Nature Immunology, 1, pp 398 - 401 24 Laemmli U K (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227, pp 680 - 685 25 Lee, M H., Yuk, J M., Shin, D M., Jo, E K (2009), "Dectin is inducibla and plays an essential role for mycobacteria - induced innate immune responses in airway epithelial cells", Journal of Clinical Immunology, 29 (6), pp 795 - 805 59 26 Lee S., Shin S., Kim H., Han S., Kim K., Kwon J., Kwak J H., Lee C K., Ha N J., Yim D., Kim K (2011), "Anti- inflammatory function of arctiin by inhibiting COX-2 expression via NF-kB pathways", Journal of Inflammation, 8, pp 16 - 24 27 Lemaitre B., Nicolas E., Michaut L., Reichhart J M., Hoffmann J A (1996), "The dorsoventral regulatory gen cassette spatzle/toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults", Cell, 86, pp 973 - 83 28 Mahajan R P., Patil S L., Mali R S (2006), "Convenient synthesis of (E)-Methyl O:-alkylferulates: Formal synthesis of e e O-geranylconiferyl e z ” Indian Journal of Chemistry, 45B, pp 328 - 331 29 Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., and Janeway C A Jr (1997), "A human homologue of the Drosophila toll protein signals activation of adaptive immunity", Nature, 388, pp 394 - 397 30 ’ e L A B E D e 200 " e e e toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer", Pharmacology Review, 61, pp 177 - 197 31 Paur I., Balstad T R., Kolberg M., pedersen M K., Austenaa L M., Jacobs D R., Blomhoff R (2010), "Extract of oregano, coffee, thyme, clove, and walnuts inhibits NF- kappaB in monocytes and in transgenic reporter mice", Cancer Prevention Research, (5), pp 653 - 663 32 Peter J., Barnes D M., Michael K (1997), "Nuclear factor-kB- A pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases", The New England Journal of Medicine, (336), pp 1066 - 1071 60 33 Ramasubramaniaraja R (2011), "Inflammation and medicinal herbs", International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 9, pp - 34 Rassa J C., Meyers J L., Zang Y., Kudaravalli R., and Ros S R (2002), "Murine retrovi- rues activate B cells via interaction with toll- like receptor 4", The Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99, pp 2281 - 2286 35 Riedemann N C., Guo R F., Ward P A (2003), "Novel strategies for the treatment of sepsis", Nature Medicine, 9, pp 17 - 24 36 Schäcke H., Zollner T M., Döcke W D., Rehwinkel H., Jaroch S., Skuballa W., Neuhaus R., May E., Zügel U., Asadullah K (2009), "Characterization of ZK 245186, a novel, selective glucocorticoid receptor agonist for the topical treatment of inflammatory skin diseases", British Journal of Pharmacology, 158, pp 1088 - 1103 37 Schnare M., Rollinghoff M., and Qureshi S (2006), "Toll- like receptors: sentinels of host defence against bacterial infection", International Archives of Allergy and Immunology, 139, pp 75 - 85 38 Schoepe S., Schäcke H., Asadullah K (2011), "Test systems for the determination of glucocorticoid receptor ligand induced skin atrophy", Dermato- Endocrinology, 3, pp - 39 Shin D M., Jeon B Y., Lee H M., Jin H S., Yuk J M., Song C H., Lee S H., Lee Z W., Cho S N., Kim J M., Friedman R L., Jo E K (2010), "Mycobacterium tuberculosis Eis regulates autophagy, inflammation, and cell death through redox-dependent signaling", PLoS Pathogens, 6(12), pp 1001 - 1230 40 Sun L., Zhao Y (2007), "The biological role of dectin in immune response", International Reviews of Immunology, 26, pp 349 - 364 61 41 Tanaka A., Kato A., Tsuchiya T (1997) "Isolation of methyl ferulate e ” Journal of The American Oil Chemists Society, 48, pp 95-97 42 Vane J and Botting R (1987), "Inflammation and the mechanism of action of anti-inflammatory drugs", The FASEB Journal, 1(2), pp 89 - 96 43 Jadhav V.M., Thorat, R.M., Kadam, V.J., Sathe, N S (2009), "Eclipta alba Linn- "Kesharaja": A Review", Journal of Pharmacy Research, 2(8), pp 1236 - 1241 44 Yang C S., Ko S R., Cho B G., Shin D M., Yuk J M., Li S., Kim J M., Evans R M., Jung J S., Song D K and Jo E K (2008), "The ginsenoside metabolite compound K, a novel agonist of glucocorticoid receptor, induces tolerance to endotoxin- induced lethal shock", Journal of Cellular and Molecular Medicine, 12, pp 1739 - 1753 45 http://www.appaliedhealth.com/index.php?option=com_content&view=ar ticle&id=108401&Itemid=212 46 http://circ.ahajournals.org/content/126/11_suppl_1/S222/F7.expansion.ht ml 47 http://doctorstevesbanjo.com/nfkappab 48 http://jimlund.org/blog/?m=200910 49 http://kids.britannica.com/comptons/art-143720/Macrophages-theprincipal-phagocytic-components-of-the-immune-system-ingest 50 http://www.nature.com/nri/journal/v6/n1/fig_tab/nri1745_F3.html 51 http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01321463 62 PHỤ Ụ