Đang tải... (xem toàn văn)
XÁC ĐỊNH GENOTYPE CHỦNG VIRUS NEWCASTLE PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM DỰA TRÊN MỘT PHẦN GEN KHÁNG NGUYÊN F
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI XÁC ĐỊNH GENOTYPE CHỦNG VIRUS NEWCASTLE PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM DỰA TRÊN MỘT PHẦN GEN KHÁNG NGUYÊN F HÀ NỘI, 10/2016 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH GENOTPE CỦA NEWCASTLE VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM DỰA TRÊN MỘT PHẦN GEN KHÁNG NGUYÊN F Sinh viên Ngành Giảng viên hướng dẫn Đỗ Thị Hằng Công nghệ sinh học TS.Lê Thị Kim Xuyến Viện Công nghệ sinh học TS.Nguyễn Hữu Đức Học viện Nông nghiệp Việt Nam HÀ NỘI, 10/2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn kết luận văn trực tiếp thực Các số liệu kết công bố luận văn hoàn toàn trung thực, xác chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng Sinh viên -3- năm 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS.Lê Thị Kim Xuyến- Cán phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học- Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vàThầy giáoTS Nguyễn Hữu Đức – Phó Trưởng khoa Công nghệ sinh học, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Học viện Nông nghiệp Việt Namlà người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Tôicũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tớicác cán phòng Miễn dịch học tận tình bảo, động viên cho lời khuyên quý báu công việc sống Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tận tình bảo cho suốt trình học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến Bố, Mẹ toàn thể người thân gia đình bạn bè hỗ trợ, động viên, khuyến khích suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên -4- năm 2016 MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH -5- DANH MỤC BẢNG -6- DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT (Chữ viết tắt, kí hiệu chuyên ngành) Từ viết tắt NDV IGS PCR RNA DNA cDNA bp µl Tên đầy đủ Newcastle Disease Virus Intergenic Sequences Polymerase Chain Reaction Ribonucleotide Acid Deoxyribonucleic Acid Complementary Deoxyribonucleic Acid Base pair Microlitre -7- -8- PHẦN 1: MỞ ĐẦU Chăn nuôi gia súc, gia cầm từ lâu đóng vị trí quan trọng ngành chăn nuôi nước ta Trong năm gần đây, ngành chăn nuôi có thay đổi đáng kể có ảnh hưởng không nhỏ đến trình phát triển ngành nông nghiệp Việt Nam, góp phần cải thiện đời sống vật chất, nâng cao mức sống cho người dân thành thị nông thôn Tuy nhiên, bên cạnh thành tựu đạt được, chăn nuôi gia cầm gặp phải khó khăn khách quan thách thức không nhỏ bệnh tật gây ra, gây tổn hại nghiêm trọng kinh tế cho ngành chăn nuôi Một bệnh thường gặp gia cầm sở chăn nuôi bệnh Newcastle Bệnh gây virus Paramyxovirus serotype thuộc nhóm Paramyxovididae, chúng gây bệnh tích đường hô hấp, tiêu hóa tác động tới hệ thần kinh, bệnh thường nhiễm ghép với bệnh khác tỉ lệ chết cao Bệnh phát vào năm 20 kỉ XX bệnh mối đe dọa nguy hiểm ngành chăn nuôi gia cầm Việt Nam nói riêng giới nói chung Hiện nay, bệnh chưa có thuốc điều trị Biện pháp tốt để kiểm soát nguy bùng phát dịch bệnh thực an toàn sinh học sử dụng vacine phòng bệnh (Grace D., 2014) Với mục đích tìm hiểu đặc tính phân tử chủng virus Newcastle đương nhiễm Việt Nam, tiến hành thực đề tài “Xác định genotype chủng virus Newcastle phân lập Việt Nam dựa phần gen kháng nguyên F” Mục tiêu nghiên cứu - Xác định trình tự phần gen kháng nguyên F chủng virus Newcastle phân lập Việt Nam - Đưa phân tích, đánh giá đặc tính sinh học genotype xác định với genotype giới - Xây dựng mối quan hệ nguồn gốc phả hệ với genotype công bố giới -9- PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương bệnh Newcastle Bệnh Newcastle hay gọi bệnh gà rù, bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan nhanh gà, loại virus thuộc nhóm Paramixo gây Bệnh gây xáo trộn hư hại đường tiêu hóa, hô hấp, thần kinh Bệnh mối nguy hiểm thường trực cho ngành chăn nuôi gia cầm Bệnh gây chết với tỉ lệ chết lên đến 100% (Doyle, 1985) 2.1.1.Lịch sử địa dư bệnh Lịch sử bệnh Năm 1926, bệnh Newcastle xảy quần đảo Java (Indonesia) Newcastle- upon- type (Anh) Theo Doyle (1985), nhà khoa học tiến hành giải phẫu mô tả bệnh, bệnh có tỉ lệ chết cao, có lên tới 100% Riêng California (Mỹ), bệnh xảy vào năm 1930 (Alexander, 1988) gọi bệnh “viêm não phổi”, bệnh có tỉ lệ chết thấp, tới 15%, với biểu hô hấp nhẹ, có triệu chứng thần kinh khác hẳn với bệnh Doyle mô tả Sau đó, vào năm 1941, 1946, 1951, số lượng lớn ổ dịch virus Newcastle lại xuất Mỹ thiệt hại 52 triệu đôla Bệnh tiếp tục bùng phát mãnh liệt vào năm 1977, 1979 1980 Năm 2002, bệnh lại quay lại California Nevadan, đến tháng năm 2003 có 1,2 triệu gia cầm bị bệnh buộc phải tiêu hủy để ngăn ngừa bệnh lây lan (OIE, 2005) Tại Venezuela, Mexico tỉ lệ chết gà trưởng thành tới 100% (Brandly, 1965) Năm 1966, bệnh xảy Iran với thể cấp tính Bệnh lây lan vào châu Á từ Tây Âu qua Trung Đông (Lancaster Alexader, 1975) Ở châu Âu, năm 1990 vụ dịch xảy năm đầu thập kỉ 70 diễn với quy mô nhỏ lẻ có chương trình vaccine để tiêm chủng cho gà (Alexander et al., 1998) Tình hình bệnh giới Virus Newcastle (Newcastle Disease Virus-NDV) báo cáo lây nhiễm động vật từ chim, bò sát người, có 241 loài chim đại diện cho 27 tổng 50 lớp Chim Hầu tất loài chim dễ bị lây nhiễm, nhiên -10- 2.4 Phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) Hiện nay, phương pháp PCR ứng dụng chẩn đoán tác nhân gây bệnh, vi sinh vật phát xét nghiệm khác Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Karry Mullis cộng (Mỹ) phát minh năm 1985 Đây phương pháp invitro sử dụng cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn từ trình tự DNA đặc biệt dựa hoạt động enzyme polymerase Phương pháp PCR dựa hoạt động DNA polymerase trình tổng hợp DNA từ mạch khuôn Tất DNA polymerase cần mồi, đoạn DNA ngắn (20-30 nucleotide) có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn (template) Đoạn mồi sau kéo dài nhờ hoạt động Taq DNA polymerase để hình thành mạch DNA hoàn chỉnh Nguyên lý phản ứng PCR: PCR phản ứng hóa sinh phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm trình chép DNA với tham gia loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt, có đoạn ngắn DNA sợi làm mồi, dùng đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi bổ sung với Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm ba giai đoạn: - Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ mạch đôi (chuỗi xoắn kép) - thành dạng mạch đơn Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung Giai đoạn kéo dài chuỗi (extension): tổng hợp chuỗi DNA giống DNA gốc Kết cuối phản ứng PCR sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết, ta có 2n phân tử DNA mạch kép nằm đoạn mồi Như vậy, kết đoạn DNA định trước “nhân lên” với lượng lớn (Lê Thanh Hòa, 2002; Lê Thanh Hòa, 2006) Các thành phần tham gia phản ứng PCR Khuôn DNA (nucleic acid đích, chuỗi acid nucleic) Phản ứng Pcr tối ưu xảy DNA thật tinh sạch, nhiều kĩ thuật chẩn đoán PCR đạt kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm với việc sử dụng enzyme DNA -22- polymerase cho hiệu cao (khoảng