PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC Một mục tiêu di truyền y học hiểu biết sở di truyền Trên sở hiểu biết đó, tìm phương pháp nghiên cứu, phương pháp thăm dò, chẩn đoán, điều trị bệnh có hiệu Trong tiểu luận, trình bày số phương pháp chủ yếu nghiên cứu, chẩn đoán trị liệu di truyền Một thành tựu bật phát triển khoa học kỹ thuật ngày kỹ thuật phân tử Kỹ thuật phân tử phát triển ứng dụng mạnh mẽ nhiều lĩnh vực, đặc biệt giúp cho ngành Nông nghiệp, Y học có bước phát triển vượt bậc Trong tiểu luận, sâu trình bày kỹ thuật phân tử bản, mới, ứng dụng nhiều y học giúp cho việc chẩn đoán, phòng, chữa bệnh di truyền sản xuất tạo nhiều chế phẩm có chất lượng cao MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC 1.1 Những khó khăn Khi tiến hành nghiên cứu di truyền y học người ta gặp phải khó khăn chủ yếu sau: Rụng trứng sinh dục muộn, sinh sản chậm Tổ chức cấu trúc di truyền người phức tạp Không thể áp dụng thí nghiệm lai sinh vật người Số lượng cháu gia đình ngày Thời gian sống thời gian sinh trưởng người dài so với động vật thí nghiệm 1.2 Những thuận lợi Các đối tượng nghiên cứu bệnh nhân nên dễ quản lý, theo dõi Ngày người hiểu biết rõ đặc tính, hình thái, giải phẫu, sinh lý, sinh hoá Ngày có nhiều phương tiện kỹ thuật đại giúp cho việc nghiên cứu tính trạng người thuận tiện nhanh chóng xác MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Y HỌC 2.1 Phương pháp nghiên cứu phả hệ 2.1.1.Khái niệm: Là phương pháp nghiên cứu di truyền tính trạng nhiều người trọng dòng họ qua nhiều hệ đề xem xét: - Tính trạng trội hay lăn - Tính trạng gen hay nhiều gen quay định - Tính trạng có di truyền liên kết với giới tính hay không - Khả mắc bệnh hệ Trong số trường hợp xác định người dị hợp tử mang gen bệnh Phương pháp kết hợp với xét nghiệm khác cho phép rút lời khuyên di truyền xác hữu ích cho gia đình việc sinh kết hôn 2.1.2 Các bước tiến hành 2.1.2.1 Lập sơ đồ phả hệ Để lập sơ đồ phả hệ (phả hệ đồ) người ta sử dụng hệ thống ký hiệu quốc tế để biểu diễn với số lượng hệ gia đình bệnh nhân từ đến hệ theo nguyên tắc sau: Các cá thể thuộc hệ xếp hàng ngang theo thứ tự ngày sinh từ trái sang phải đánh dấu số Ả rập (1,2,3,4 ) Các hệ xếp theo chiều dọc theo thứ tự từ xuống đánh dấu chữ số La mã (I, II, III, IV ) phần đầu bên trái hàng Thế hệ nối với hệ đoạn thẳng vuông góc từ vạch kết hôn hệ trước xuống hệ sau Ngoài tiếp xúc với người bệnh phải tránh yếu tố tâm lý bất lợi họ khiến cho thông tin cung cấp cho bác sỹ bị sai lệch Một số ký hiệu thường dùng lập phả hệ Nam giới; Nữ giới; Không biết giới; Có thai; Người lành; Người bệnh; Người có hội chứng bệnh dấu hiệu bệnh lý không đầy đủ/ dị hợp tử mang gen lặn bệnh lý; Người lành mang gen lặn bệnh lý liên kết-X; Người chưa có thông tin thông tin không đầy đủ; 10 Người không kiểm tra kỹ bị bệnh người bệnh; 11 Đương sự; 12 Chết; 13 Chết non ( tuổi thiếu nhi); 14 Chết thai năm; 15 Sẩy thai; 16 Vợ chồng; 17 Hai vợ (hai chồng); 18 Vợ chồng giá thú; 19 Hôn nhân huyết thống; 20 Hôn nhân con; 21 Anh chị em bố mẹ; 22 Hai hôn nhân với hôn nhân; 23 Số không biết; 24 Không rõ để hay không; 25 Con nuôi (không huyết thống); 26 Con sinh đôi hợp tử; 27 Con sinh đôi hai hợp tử; 28 Không rõ kiểu sinh đôi hợp tử hay hai hợp tử; 29 Con hôn nhân; 30 hệ; 31 Anh chị em hệ 2.1.2.2 Phân tích phả hệ Đây bước quan trọng để xác định tính chất di truyền cách thức di truyền tính trạng bệnh lý Để làm công việc phải hiểu biết vận dụng qui luật di truyền kết hợp với việc tính toán thống kê để sử lý liệu từ phả hệ Hình 3.2: Một số sơ đồ phả hệ điển hình (A) Trội autosome; (B) Lặn autosome; (C) Lặn liên kết-X; (D) Trội liên kết-X; (E) Liên kết-Y Ví dụ: Nếu phả hệ, hệ thấy có người bị bệnh, khả mắc bệnh giới nam giới nữ nhau, gia đình có cha mẹ bị bệnh mà tỷ lệ bị bệnh 50%, nghĩ bệnh bệnh di truyền gen trội nằm nhiễm sắc thể thường gây Còn phả hệ thấy bệnh di truyền có tính chất cách quãng, trai bị bệnh nhiều gái, ông ngoại truyền bệnh cho cháu trai cho bệnh bệnh di truyền gen lặn nằm nhiễm sắc thể giới tính X gây 2.1.3 Kết nghiên cứu: -Đã xác định nhiều gen quy định tính trạng người gen trội hay lặn Ví dụ + Da đen, tóc quăn, môi dày, mũi cong, long mi cong tính trạng trội + Da trắng, tóc thẳng, môi mỏng, mũi cao, long mi ngắn tính trạng lăn - Xác định số gen gây bệnh nằm NST giới tính Ví dụ: + Bệnh mù màu, máu khó đông, tật dính ngón tay… gen lặn nằm X + Tật dính ngón tay 2-3, túm lông tai gen NST giới tính Y qui định - Xác định số tính trạng nhiều gen quy định Ví dụ: + Năng khiếu toán, âm nhạc, hội họa,… di truyền đa gen, song chịu ảnh hưởng môi trường xã hội 2.2 Phương pháp trẻ sinh đôi (đồng sinh) 2.2.1 Những đặc điểm giá trị phương pháp Phương pháp trẻ sinh đôi phương pháp dựa vào trẻ sinh đôi Đây phương pháp có hiệu để đánh giá vai trò yếu tố di truyền môi trừơng phát triển tính trạng người Phương pháp trẻ sinh đôi thường sử dụng để đánh giá hiệu phương pháp nuôi dạy trẻ, đánh giá chất lượng loại thực phẩm, loại thuốc 2.2.2 Các bước tiến hành 2.2.2.1 Chọn mẫu sinh đôi Các mẫu sinh đôi lựa chọn cách Một dân cư lựa trẻ sinh đôi trẻ sinh đôi chọn lấy cặp có tính trạng cần nghiên cứu Hai từ nhóm dân cư lựa trẻ có tính trạng cần nghiên cứu sau chọn cặp sinh đôi Cần ý thêm tiến hành nghiên cứu có đủ người cặp Còn có người loại bỏ hai 2.2.2.2 Chẩn đoán kiểu sinh đôi Đây bước quan trọng đòi hỏi xác cao Để chẩn đoán xác phải sử dụng nhiều tiêu so sánh hình thái, sinh lý, sinh hóa giới tính, màu tóc, màu mắt, màu da, dạng tóc kiểu phủ tóc, lông đầu thân, hình dạng miệng, mũi, tai, vân da bàn tay, hệ thống nhóm máu, protein huyết v.v Hình 3.3: Rau thai màng trẻ sinh đôi A Rau thai, màng nuôi màng đệm riêng; B Rau thai chung, màng đệm chung, màng ối riêng; C Rau thai màng đệm chung, màng ối dính Nếu tất tiêu so sánh người cặp sinh đôi giống chứng tỏ trẻ sinh đôi có nguồn gốc hợp tử (cùng trứng) Còn chúng không giống có giống mức độ giống không khác biệt nhiều so với anh chị em ruột khác gia đình điều chứng tỏ trẻ sinh dôi có nguồn gốc hợp tử (khác trứng) Mức độ giống, khác giúp chẩn đoán kiểu sinh đôi thực phiếu điều tra câu hỏi đối tượng, bố mẹ, người thân gia đình bố mẹ có hay nhầm lẫn không, thầy giáo, bạn lớp có hay lẫn hai người hay không v.v Đối với trẻ sơ sinh, chẩn đoán kiểu sinh đôi qua tính chất màng quanh thai: màng ối (trong), màng đệm (ngoài) Ở trẻ sinh đôi hai hợp tử có màng đệ riêng, màng ối thai riêng Tuy nhiên có trường hợp thai khác hợp tử làm tổ tử cung thành hàng, cạnh thai chung Trường hợp có màng ối riêng có màng đệm chung sinh đôi hai hợp tử Nếu có màng đệm riêng, màng ối riêng, rau thai chung sinh đôi hợp tử gặp (chiếm 25% số sinh đôi hợp tử 50% sinh đôi hai hợp tử) 2.2.2.3 Đối chiếu so sánh tiêu, rút kết luận đánh giá Đánh giá mức độ tương đồng: để đánh giá mức độ tương đồng tính trạng cặp sinh đôi người ta sử dụng công thức tính gọi công thức Alen- Smith: Kp = Ở C số cặp tương đồng; D số cặp không tương đồng theo tính trạng so sánh Thí dụ: Khi nghiên cứu tính trạng bệnh tâm thần phân liệt 50 cặp sinh đôi hợp tử (MZ) người ta thấy có 43 cặp, trẻ bị bệnh (tương đồng) cặp có trẻ cặp bị bệnh (không tương đồng) Theo công thức Alen- Smith ta tính mức độ tương đồng trường hợp là: KpMZ = = = 86 (%) Còn nghiên cứu tính trạng 50 cặp sinh đôi hai hợp tử ( DZ ), người ta thấy số cặp tương đồng 8, số cặp không tương đồng 42 ta có mức độ tương đồng trường hợp là: KpDZ = = 16 (%) Đánh giá vai trò yếu tố di truyền yếu tố môi trường: để xác định vai trò yếu tố di truyền phát triển tính trạng đó, người ta áp dụng công thức tính khác gọi công thức Holzinger: H= (%) Theo công thức ta tính vai trò yếu tố di truyền bệnh tâm thần phân liệt theo số liệu trên: H = = = 83 (%) Vì tính trạng người kết tương tác yếu tố di truyền (H) yếu tố môi trường (C) mức độ khác Bởi để xác định vai trò yếu tố môi trường trường hợp bệnh tâm thần phân liệt, ta có: H + C = 100% ; C = 100% - H = 100% - 83% =17% 2.3 Phương pháp vân da 2.3.1 Những đặc điểm giá trị phương pháp Phương pháp nghiên cứu vân da phương pháp nghiên cứu di truyền y học dựa đặc tính đường nét, hình thù bề mặt da đầu ngón tay lòng bàn tay Phương pháp có giá trị việc góp phần chẩn đoán sớm số bệnh lý người, lĩnh vực khoa học hình việc xác định trẻ sinh đôi Cơ sở khoa học phương pháp vân da chỗ hình thù đường nét vân da mang tính cá thể nghiêm ngặt chúng kiểm soát nhiều gen Trong trình phát triển cá thể, hoa vân tay hình thành từ tháng thứ sáu không bị biến đổi suốt đời Hình 3.4: Các delta đáy ngón a,b,c,d; Hình 3.5 Các đường vân A,B,C,D vùng lòng bàn tay (Th, Hy, kiểu vân lòng bàn tay I1,I2,I3,I4) gã ba trục t 2.3.2 Các bước tiến hành 2.3.2.1 Lấy mẫu in vân da giấy trắng 2.3.2.2 Phân tích mẫu in theo tiêu Tổng số đường vân đầu ngón Công thức vân đầu ngón Cường độ vân đầu ngón Tần số loại vân Chỉ số Cummins Các kiểu vân vùng mô mô út Góc ngã ba trục atd Số lượng hình dạng rãnh lòng bàn Rút kết luận nhận xét so sánh kết nghiên cứu nhóm đối tượng khác Các kiểu vân đầu ngón: 1: vân cung Các miền quanh gan bàn tay (1-13) đơn giản; 2: vân cung lều; 3; vân số Cummins móc/búi/nút; 4,5,6: kiểu vân vòng đối xứng, vòng xoáy vòng móc kép Mức độ giống nếp vân da quan hệ huyết thống Quan hệ Mức độ giống Thực tế Lý thuyết Sinh đôi hợp tử 0,95 1,00 Sinh đôi hai hợp tử 0,49 0,50 Anh chị em ruột 0,5 0,50 Bố mẹ- 0,48 0,50 0,05 0,00 Không quan hệ huyết thống 2.4 Phương pháp nghiên cứu di truyền phân tử Các thành tựu to lớn năm gần lĩnh vực Di truyền học người, đặc biệt thành tựu giải mã gene người đạt nhờ sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử tách chiết, phân tích định tính định lượng nucleic acid; phương pháp lai phân tử: Southern blot, Northern blot, lai chỗ (in situ hybridization), ; phương pháp xác định trình tự nucleic acid; tạo dòng (cloning); xây dựng thư viện gene, thư viện cDNA; phương pháp PCR (polymerase chain reaction); Sinh tin (Bioinfomatics), 2.4.1.Các phương pháp tách chiết acid nucleic, phương pháp định tính định lượng 2.4.1.1.Các phương pháp tách chiết acid nucleic: 2.4.1.1.1.Phương pháp tách chiết DNA + Bước 1: phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô hỗn hợp, chất tẩy (SDS) proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA môi trường đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA Chất tẩy phân tử lưỡng cực, sẻ kết hợp với protein màng phân tử phospholipid làm phá vỡ cầu trúc màng Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ + Bước 2: loại protein: lắc mẫu dung dịch phenol: chloroform để biến tính protein đồng thời không hòa tan acid nucleic Protein bị biến tính sẻ không hòa tan pha nước có chứa acid nucleic sau li tâm sẻ tủa thành lớp nằm pha nước pha phenol : chloroform Thu hồi acid nucleic pha nước + Bước 3: thu hồi acid nucleic : thu hồi dạng tủa acid nucleic nhằm thu nhận acid nucleic dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi phân li enzyme cần hòa tan lại nước theo nồng độ mong muốn Có thể tủa ethanol isopropan ol 2.4.1.1.2.Tách chiết ARN Phương pháp tách chiết ARN toàn phần bao gồm bước tách chiết ADN: - Giải phóng ADN ARN khỏi màng tế bào - Tách bỏ phần protein - Tủa acid nucleic Bước tiếp theo: dịch chiết chứa acid nucleic ủ với ADN polimerase để phân hủy ADN Sau phân hủy dịch chiết chứa ARN nước; tủa ethanol, để thu ARN toàn phần mARN tách riêng Dựa vào cấu trúc phân tử có đuôi mARN có đuôi poly A tách mARN sắc ký lực cột oligo T –cellulose Hiện sử dụng kit ( mẫu thử chuyên dụng) sử dụng viên bi từ có mang oligo T bề mặt Thông qua liên kết bổ sung A=T mARN bám lên bề mặt viên bi từ Sau kỹ thuật li tâm thu lại viên bi tách mARN Kỹ thuật cho phép tách giữ lại mARN với khối lượng nhỏ Chú ý trình thao tác, tránh lẫn ADN ARN, ARN đối tượng khác vào dụng cụ Tránh enzym phá hủy ADN ARN cần nghiên cứu Đặc biệt ARN không bền dễ bị phân li ARN polimerase Sau tách chiết ADN kiểm tra độ tinh khiết ADN xác định tỉ lệ OD260/OD280 OD260/OD 230 = 1,7 – coi phương pháp điện di ADN 2.4.1.1.3.Phương pháp sắc ký + Sắc ký lực: poly U-Sepharose hay oligodTcellulose, dùng để tinh mARN + Sắc ký lọc gel dùng phân tách acid nucleic nucleotic tự sau trình tạo mẫu dò (probe) đánh dấu + Sắc ký hiệu suất cao: có độ phân giải cao dùng tinh oligonucleotide tổng hợp, plasmid, phân tách đoạn DNA + Sắc ký trao đổi ion vi cột để thu hồi lượng nhỏ DNA 2.4.1.2.Các phương pháp định tính định lượng thô acid nucleic 2.4.1.2.1.Phương pháp định lượng quang phổ kế Cho phép định lượng tương đối nồng độ acid nucleic có mẫu Nguyên tắc dựa vào hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm base Giá trị mật độ quang bước sóng 260 nm mẫu đo cho phép xác định nồng độ acid nucleic mẫu dựa vào mối tương quan đơn vi OD260nm tương ứng với nồng độ: + 50µg/ml cho dung dịch DNA sợi dôi + 40µg/ml cho dung dịch DNA hay RNA sợi đơn Định tính: độ dựa tỉ số OD260/OD280, tính chất acid nucleic (mạch đôi/đơn) (280nm bước sóng protein có mức độ hấp thụ cao 2.4.1.2.2.Phương pháp điện di Mục tiêu: + Định tính: diện, cấu hình phân tử, kích thước + Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng + chuẩn bị: thu hồi đoạn DNA (dùng tạo dòng) Nguyên tắc: dựa vào đặc tính, cấu trúc acid nucleic: tích điện âm đồng khắp bề mặt điện trường nên sẻ di chuyển cực dương điện trường Tính linh động phân tử di chuyển điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử nồng độ chất cấu thành gel Kiểu điện di: Agarose, Polyacylamide, điện li trường xung (PDGE – Pulse Field Gel Electrophoresis) a.Điện di gel polyacrylamide Được dùng để tách đoạn có kích thước nhỏ, 1000 cặp base Điện di theo phương thẳng đứng Độ phân giải cao, phân biệt trình tự cách nucleotide Phương pháp phát hiện: DNA phóng xạ tự gỉ, xanh methylene, ethidium bromide, protein – xanh coomassie nhuộm nitracte bạc ứng dụng: tinh oligonucleotic tổng hợp, xác định trình tự DNA, tách trình tự DNA có khoảng cách gần nhau, SDS – PAGE (phân tích protein) b Điện di gel agarose Gel agarose loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân tách đoạn có kích thước 0,5 – 20 kb Điện di theo phương nằm ngang Độ phân giải thay đổi nồng độ agarose hay loại agarose thay đổi Phát phóng xạ tự ghi, nhuộm ethidium bromicde Chất có khả gắn xen vào base acid nucleic sẻ phát huỳnh quang tia tử ngoại Ứng dụng: phát trình tự DNA, phân tích trình tự hỗn hợp DNA (Southern blot), chuẩn bị nguyên liệu 2.4.2.Các phương pháp lai phân tử 2.4.2.1.Cơ sở lai phân tử Khái niệm lai phân tử: + Khi phân tử DNA mạch đôi đun lên nhiệt độ vượt nhiệt độ nóng chảy Tm hai mạch sẻ tách rời phá vỡ liên kết H hai mạch + Sau hai mạch tách rời nhiệt độ phản ứng làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẻ bắt cặp trở lại, tượng gọi lai phân tử Đặc điểm lai phân tử: + Đặc hiệu tuyệt đối: tái bắt cặp xảy hai trình tự hoàn toàn bổ sung với + Các trình tự bổ sung DNA, RNA dẫn đến hình thành phân tử DNA – RNA, RNA – RNA hay phân tử lai DNA – DNA 2.4.2.2.Các kiểu lai phân tử 2.4.2.2.1.Lai pha lỏng Các trình tự cần lai nằm pha lỏng, dung dịch đệm Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm Phương pháp sử dụng để phát trình tự tương đồng loài hay cá thể 2.4.2.2.2.Lai chổ: trình tư acid nucleic cần tìm không tách chiết khỏi mô hay tế bào Quá trình lai với mẫu dò đánh dấu phát phân tử lai thực NST, tế bào hay lát cắt mô 2.4.2.2.3.Lai pha rắn Một tron hai trình tự cần lai cố định giá thể rắn ( màng lai) Phát phân tử lai thông qua mẫu dò (probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ Ba kỹ thuật lai pha rắn thông dụng Southern blot, Nothern blot Dot blot a.Southern blot Nguyên tắt Southern blot màng lai nitrocellulose có khả tiếp nhận DNA biết từ lâu sử dụng nghiên cứu lai acid nucleic khác vào thập niên 1950 1960 Đầu thập niên 1970, đời phương pháp điện di gel cho phép đoạn DNA cắt enzyme hạn chế phân tách dựa sở kích thước chúng Từ nước phát triển phương pháp chuyển đoạn DNA phân tách từ gel lên lai màng lai nitrocellulose Phương pháp Southern mô tả đại học Edingburgh vào năm 1975 Southern Blot bao gồm bước sau: - Cắt DNA enzym hạn chế thích hợp - Điện di sản phẩm cắt gel agarose - Làm biến tính DNA gel, DNA sợ kép sẻ tách thành DNA sợ đơn Chỉ DNA sợi đơn chuyển lên màng lai - Chuyển DNA biến tính lên màng lai ( màng nitrocellulose hay màng nylon) Việc chuyển DNA thường tiến hành hoạt tính mao dẫn khoảng vài tiếng dùng thiết bị thấm chân không Trong trình chuyển, vị trí đoạn DNA giữ nguyên không thay đổi - Lai DNA cố định màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu - Quá trình dựa nguyên tắc bổ sung DNA màng lai với mẫu dò Để đánh giá người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin vài mẫu dò phát quang sinh học - Định vi phân tử DNA – mẫu dò Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định Nếu sử dụng biotin/ streptavidin dùng phương pháp so màu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì phát phát quang b.Northern blot Sau Southern mô tả phương pháp Southern blot năm 1975, người ta dung phương pháp tương tự để xác định đoạn RNA đặc biệt gọi Northern blot Northern blot bao gồm bước sau: + RNA (RNA tổng số mRNA) phân tách điện di gel agarose + RNA sau phân tách chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ nguyên vị trí gel) + RNA cố định màng lai với mẫu dò DNA sợi đơn ( RNA ) có đánh dấu phóng xạ gắn với enzyme tạo thành phân tử lai RNA – DNA RNA - RNA sợi kép + Vị trí mẫu dò xác định phương pháp phóng xạ tự ghi đánh dấu phóng xạ Trong trường hợp mẫu dò gắn với enzyme đem ủ với chất không màu Enyme liên kết với sẻ biến đổi thành sản phẩm màu nhìn thấy phát ánh sáng mà phát phim X quang cách trực tiếp c.Phương pháp Dot blot – Slot blot Lai theo phương pháp Dot blo phương pháp sàng lọc nhanh thường thực với mẫu dò ASO để phân biệt khác alen vị trí nu Phương pháp không cần điện di thạch mà thấm trực tiếp từ để xác định đoạn nu khác Quy trình thực kỹ thuật qua bước sau: + Bước 1: dung dịch ADN biến tính nhiệt độ hay dung dịch Kali để tách ADN sợi kép thành ADN sợi đ + Bước 2: Gắn ADN đích biến tính lên màng lai + Bước 3: đưa màng lai chứa ADN đích vào dung dịch chứa ADN dò + Bước 4: sau khoảng 20 – 24h ADN dò sẻ gắn vào ADN đích tạo thành chuổi kép + Bước 5: Rửa màng lai Để khô tự nhiên sau phân tích tự chụp phóng xạ Ngoài gắn ADN dò lên màng lai, ADN đích để dung dịch bước tương tự  Phương pháp lai chổ (In Situ Hybridization) Phương pháp lai chổ vừa phương pháp di truyền tế bào vừa phương pháp di truyền phân tử Phương pháp thường dùng lai NST kì NST nhân tế bào gian kỳ với ADN dò đánh dấu đồng vị phóng xạ phóng xạ huỳnh quang Quang sát có mặt đoạn ADN đích đoạn ADN lai tự chụp hình phóng xạ kính hiễn vi huỳnh quang Bằng phương pháp chuỗi nhẹ kappa globulin miễn dịch xác định có locus nhánh ngắn NST số  Phương pháp lập đồ đoạn Phương pháp dựa vào có mặt hay vắng mặt số vùng đặc biệt locus ADN lấy từ bệnh nhân có bất thường NST hay từ mẫu lai tế bào sô ma người gậm nhấm, mẫu có chứa đoạn ADN biết trước NST người Lập đồ đoạn đặc biệt có ích cho lập đồ NST X số lượng lớn bất thường NST X xác định  Thông tin khoảng cách hình thể Các đoạn ADN giới hạn đoạn ADN sau cắt enzim giới hạn lai với mâu đánh dấu tế bào phương pháp Southern blotting, bao gồm giai đoạn cắt ADN, tách ADN điện li, thấm ADN từ gel agarose điện li lên màng nitrocellulose nylon sau lai ADN đọc chụp hình phóng xạ đánh dấu đồng vị phóng xạ đọc theo phương pháp huỳnh quang đánh dấu nhuộm màu huỳnh quang Ngoài phương pháp người ta sử dụng phương pháp nghiên cứu mô học, phương pháp điều tra dịch tễ học phương pháp di truyền lâm sàng nghiên cứu Di truyền học người 2.5 Phương pháp di truyền tế bào 2.4.1 Những đặc điểm giá trị phương pháp Đây phương pháp dùng phổ biến để phát quan sát nhiễm sắc thể, qua xác định dị dạng nhiễm sắc thể, tượng lệch bội, tượng cấu trúc lại nhiễm sắc thể dẫn đến nhiều bệnh di truyền hiểm nghèo người Dùng mô gồm nhiều tế bào phân chia mạnh mô tuỷ xương , mô bào thai, mô tinh hoàn, khối u ác tính làm tiêu để phân tích, đánh giá nhiễm sắc thể Là phương pháp bắt buộc chẩn đoán phân biệt bệnh nhiễm sắc thể Là phương pháp sử dụng rộng rãi nghiên cứu tác nhân gây đột biến nhiễm sắc thể người Kỹ thuật lai tế bào soma kỹ thuật băng nhiễm sắc thể đời cho phép nghiên cứu chế ung thư, hoạt động gene trình phát triển cá thể góp phần tích cực vào việc lập đồ di truyền người 2.4.2 Các bước tiến hành Thu nhận mẫu nghiên cứu trực tiếp từ tổ chức thể hay nuôi cấy tế bào thể Làm tiêu hiển vi nhiễm sắc thể kỳ trình phân chia hay nhân kỳ nghỉ Phân tích tiêu kính hiển vi theo tiêu nghiên cứu quốc tế Dựng Karyotype trường hợp điển hình 2.6 Phương pháp hóa sinh 2.5.1 Những đặc điểm chung giá trị phương pháp Là phương pháp nghiên cứu tiến hành nhờ giúp đỡ phương tiện máy móc kỹ thuật hoá chất chuyên dụng Là phương pháp cho phép phát khuyết tật gen thông qua sản phẩm bất thường chúng loại protide cấu trúc, protide enzym mà từ dẫn đén biểu bệnh lý Là phương pháp bắt buộc chẩn đoán bệnh di truyền chuyển hoá 2.5.2 Các bước tiến hành Bước nghiên cứu thăm dò với trắc nghiệm đơn giản nhằm phát trường hợp nghi ngờ dân cư Bước nghiên cứu chi tiết với trắc nghiệm xác phức tạp để phục vụ cho việc chẩn đoán xác định 2.7 Phương pháp thăm khám lâm sàng bệnh di truyền Nhiều bệnh di truyền không biểu quan, phần thể mà thường biểu dạng đa dị tật với thay đổi phần khác thể, thay đổi thể lực trí lực,vì bệnh án di truyền liên quan đến nhiều chuyên khoa y học Độ biểu gen phụ thuộc vào thời gian, mức độ biểu bệnh không giống thời điểm khác Chính thăm khám thời điểm không xác định bệnh, thăm khám thời điểm khác lại xác định Để xác định nguyên nhân, chế bệnh, cần tổ chức để thăm khám xét ngiệm thành viên bên gia đình người bệnh, xây dựng gia hệ để xác định quy luật, chế bệnh 2.8 Phương pháp tạp giao thực nghiệm Phương pháp tạp giao thực ngiệm phương pháp ngiên cứu di truyền học cổ điển di truyền học cổ điển phương pháp chủ yếu áp dụng cho động vật thực vật Cho hai loài hai chung giao phối với theo dõi tính trạng hệ Muốn phân tích quy luật di truyền, cần chọn hai mẫu sinh vật có vài tính chất đối lập để theo dõi tính trạng qua nhiều hệ Mẫu sinh vật cần có bốn điều kiện: 1- Đời sống ngắn -Sinh nhiều hệ -Cho nhiều biến dị 4 –Dễ trì Các vi sinh vật có đời sống ngắn nấm,nhất nấm Neurospora crassa thường dùng để ngiên cứu hoạt động gen Vi khuẩn virut gần sử dụng nhiều, lúa mạch ngô lương thực bậc cao ngiên cứu rộng rãi 2.9 Phương pháp nghiên cứu quần thể Bằng điều tra, xét ngiệm hàng loạt quần thể khác nhau,các nhà di truyền học xác định dược tần số tính trạng Ví dụ : tần số đột biến tự nhiên NST người bình thường, tần số mù màu, tần số bệnh Hb, từ tính tần số quần thể Có thể áp dụng phương pháp điều tra dịch tể học để đánh giá anh hưởng nhân tố môi trường đến bệnh tật di truyền Phương pháp tập được tiến hành hai nhóm quần thể: nhóm có tiếp xúc với yếu tố nguy gây bệnh, nhóm không tiếp xúc với yếu tố nguy gây bệnh, từ so sánh phân tích, đánh giá ảnh hưởng yếu tố nguy đến tần số đột biến biểu tần số bệnh di truyền, tần số dị tật bẩm sinh ỏ nhóm Phương pháp dựa vào phương trình Hardy - Weinberg, đánh giá tần số kiểu hình để tính mật độ gene quần thể liên quan đến bệnh di truyền Nó cho phép đánh giá hậu giao phối cận huyết theo dõi di truyền quần thể người mặt nguồn gốc