I HC QUC GIA TP HCM TRNG I HC BCH KHOA PHAN TH HONG ANH NGHIấN CU QUY TRèNH TCH CHIT, TNG HP DN XUT V XC NH TNH CHT, HOT TNH CA TINH DU V CURCUMIN T CY NGH VNG (CURCUMA LONG L.) BèNH DNG Chuyờn ngnh: CễNG NGH HểA HC CC CHT HU C Mó s chuyờn ngnh: 62.52.75.05 TểM TT LUN N TIN S K THUT TP H CH MINH NM 2013 Cụng trỡnh c hon thnh ti: Trng i hc Bỏch Khoa HQG TP.HCM Ngi hng dn khoa hc PGS TS Trn Th Vit Hoa Ngi hng dn khoa hc GS.TSKH Trn Vn Sung Phn bin c lp 1: PGS TS Trn Lờ Quan Phn bin c lp 1: TS Trn Th Minh Phn bin 1: PGS TS Trn Thu Hng Phn bin 2: GS TS Nguyn Minh c Phn bin 3: PGS TS Nguyn Ngc Hnh Lun ỏn s c bo v trc Hi ng chm lun ỏn hp ti: Hp ti: Trng i hc Bỏch Khoa Vo lỳc: .gi ngythỏng nm Cú th tim hiu lun ỏn ti th vin: - Th vin Khoa hc tng hp TP.HCM - Th vin Trng i hc Bỏch Khoa HQG TP.HCM A GII THIU LUN N t Cõy Ngh vng Curcuma longa L thuc h gng (Zingiberaceae), c trng nhiu nhng vựng khớ hu núng m nh Trung Quc, n , Indonesia, Jamaica, Peru v Vit Nam C ngh t lõu ó c s dng rng rói lm gia v, cht bo qun v cht to mu thc phm Ngoi ra, c ngh cng l mt nhng phng thuc dõn gian hiu qu cha tr nhiu loi bnh nh vng da, cỏc bnh v gan, mt, u nht, viờm khp, cm cỳmTrong nhng thp k gn õy, rt nhiu cỏc nghiờn cu ó c cụng b v hot tớnh sinh hc v dc hc ca c Ngh vng cng nh cỏc thnh phn chit xut t c ngh, ú curcuminoid v tinh du ngh c chng minh l nhng thnh phn chớnh to nờn dc tớnh cao ca c Ngh vng Vit Nam cú ngun Ngh vng phong phỳ, phõn b nhiu tnh thnh nh Vnh Phỳc, Hi Dng, Hng Yờn, Ngh An, Qung Nam, ng Nai, Bỡnh Dng Thnh phn, hm lng curcuminoid v tinh du c Ngh vng cỏc vựng khỏc cú s thay i ln nh hng ca iu kin khớ hu, th nhng, iu kin trng trt, chm súc Vic nghiờn cu v c trng c Ngh vng ca mi vựng s giỳp ỏnh giỏ y hn giỏ tr s dng, t ú cú c s nh hng tt hn cho vic phỏt trin ngun Ngh vng nc Cỏc nghiờn cu v Ngh vng nc cho n ch yu mi ch trung mt s vựng Ngh vng phớa Bc nh Hũa Bỡnh, Vnh Phỳc, Hng Yờn Chớnh vỡ vy, gúp phn vo vic tỡm hiu thờm v cỏc ngun Ngh vng khỏc nc, ti ny, chỳng tụi chn i tng nghiờn cu l c Ngh vng Bỡnh Dng, vi ti Nghiờn cu quy trỡnh tỏch chit, tng hp dn xut v xỏc nh tớnh cht, hot tớnh ca tinh du v curcumin trớch t cõy Ngh vng (Curcuma longa L.) Bỡnh Dng Quy trỡnh phõn lp curcumin v tinh du t c ngh Bỡnh Dng c nh hng kho sỏt l trớch ly curcuminoid kt hp tỏch tinh du v khụng qua giai on loi bộo bng dung mụi hu c So vi nhng quy trỡnh hin s dng tỏch curcuminoid t c ngh, quy trỡnh ny s giỳp tn thu c ngun tinh du t c Ngh vng, gim lng dung mụi hu c s dng m m bo thu c curcuminoid t c ngh vi hiu sut v tinh khit cao Vi mc tiờu trờn, chỳng tụi hy vng s gúp phn tỡm mt quy trỡnh mi cú tớnh ng dng cao cú th m rng quy mụ sn xut ln hn Mt hng nghiờn cu th hai, quan trng v trng tõm ca cụng trỡnh ny l tng hp dn xut ca curcumin v kho sỏt hot tớnh sinh hc õy l mt hng nghiờn cu cng rt c quan tõm hin Curcumin mc dự ó c chng minh cú rt nhiu hot tớnh mnh v a dng, mt nhng nhc im ln ca curcumin l tớnh kh dng sinh hc (bioavailability) thp th hin s hp thu kộm, s chuyn húa nhanh v s o thi ln vo c th Vic tng hp dn xut v cht tng t curcumin l mt nhng hng nghiờn cu nhm ci thin hot tớnh v sinh kh dng ca curcumin Chớnh vỡ vy ti nghiờn cu ny, cỏc dn xut isoxazole v pyrazole curcuminoid c nh hng tng hp, kho sỏt thờm v mt s hot tớnh sinh hc cỏc dn xut ny so vi curcumin nh hot tớnh khỏng khun, khỏng oxy húa v khỏng ung th MC TIấU TI - Nghiờn cu quy trỡnh trớch ly curcuminoid v tinh du t c Ngh vng (Curcuma longa L.) Bỡnh Dng - Tng hp dn xut ca curcuminoid, - Kho sỏt hot tớnh sinh hc ca tinh du, cỏc curcuminoid v dn xut ểNG GểP CA LUN N Kho sỏt quy trỡnh tỏch curcuminoid kt hp tỏch tinh du t nguyờn liu ngh ti v ngh khụ ( m 10-12%) u im ca phng phỏp l tn thu c ngun tinh du t c ngh, trớch ly curcuminoid m khụng cn qua giai on loi bộo Curcuminoid thu c cú tinh khit cao (> 95%) v hiu sut trớch ly cao (7.8% trờn lng khụ tuyt i) cho thy tớnh kh thi ca phng phỏp trin khai quy mụ ln Tng hp 30 dn xut ca curcuminoid, gm 22 dn xut ca curcumin, dn xut ca demethoxycurcumin v dn xut ca bisdemethoxycurcumin Trong s ú cú 10 dn xut hon ton mi, cha tng c cụng b cỏc cụng trỡnh v ngoi nc Cỏc dn xut u c nh danh v xỏc nh cu trỳc bng cỏc phng phỏp phõn tớch ph MS, IR, NMR Dn xut methyl pyrazolecurcumincarboxylate (dn xut 19) th nghim gõy c t bo ung th tuyn tin lit PC3 th hin hot tớnh cao gp 38 ln curcumin ng thi cú chn lc rt tt vi ch s SI = 26 rt cú tim nng tip tc nghiờn cu phỏt trin thnh thuc i vi ung th tuyn tin lit CU TRC LUN N Lun ỏn gm 143 trang Ngoi phn m u v kt lun thỡ cũn chng nh sau: Chng 1: Tng quan (33 trang); Chng 2: Thc nghim (19 trang); Chng 3: Kt qu & bn lun (76 trang); Lun ỏn cú 50 bng, 36 hỡnh, th v 160 ti liu tham kho B NI DUNG LUN N CHNG 1: TNG QUAN Phn tng quan gm nhng ni dung sau - Tng quan v curcumin - Mt s tớnh cht húa lý ca curcumin - Hot tớnh sinh hc v tớnh kh dng sinh hc ca curcumin - Cỏc phng phỏp ci thin tớnh kh dng sinh hc ca curcumin - Cỏc nghiờn cu v tng hp dn xut ca curcumin v hot tớnh sinh hc ca cỏc dn xut - Gii thiu v tinh du, cỏc phng phỏp trớch ly curcuminoid v tinh du t c Ngh vng CHNG 2: THC NGHIM 2.1 Nguyờn vt liu v trang thit b 2.1.1 Nguyờn vt liu C Ngh vng c mua t Bỡnh Dng C Ngh vng mt s vựng khỏc dựng phn kho sỏt thnh phn tinh du c mua huyn Thng Nht (ng Nai), Qung Nam, Ngh An Cỏc húa cht cho phn ng tng hp c mua t Sigma Aldrich, Merck, Acros Organic vi tinh khit cao phự hp cho mc ớch tng hp 2.1.2 Trang thit b Curcuminoid sau phõn lp v cỏc dn xut sau tng hp c xỏc nh mt s tớnh cht húa lý (tớnh tan, im chy, ph UV-Vis, TLC, HPLC ) v nh danh, xỏc nh cu trỳc bng cỏc phng phỏp ph IR, MS, NMR iu kin phõn tớch nh sau: o im chy: mỏy Electrothermal 9100 (BM Hu c, khoa Húa, HBK TPHCM); Ph UV-Vis: mỏy JENWAY 6505 UV-Vis Spectrophotometer (B mụn Hu c, khoa Húa, HBK TPHCM); Phõn tớch HPLC (thc hin ti trung tõm o to v phỏt trin sc ký, TPHCM): ct sc ký pha o C18 (250ì4.6 mm, 5àm), pha ng acetonitrile :H3PO4 0.05% 55:45 (v/v), nhit ct 40oC, tc dũng 0.8 ml/phỳt v u dũ UV-Vis 422 nm; Ph MS: mỏy HP 5989 MS Engine (vin Húa hc, Vin KH v CN Vit Nam, H Ni); Phõn tớch 1H- v 13C-NMR: mỏy Bruker AV 500, 500 MHz cho 1H v 125 MHz cho 13C (Vin Húa hc, Vin KH v CN Vit Nam, H Ni) Mt s dn xut (4,5,6,10,14,19,20,21,22) c tng hp ti vin Eskitis, i hc Griffith, Brisbane, Queensland, Australia Quỏ trỡnh tng hp, tinh ch v phõn tớch c thc hin trờn cỏc thit b sau: Ph IR: mỏy Bruker Tensor 27 FT-IR spectrometer; Ph MS: mỏy Mariner TOF biospectrometer (ESI-TOF-MS); Ph HR-MS: mỏy Bruker Daltonics Apex II 4.7e Fourier transform mass spectrometer, kt ni vi ngun Apollo API (ESI-FTICR-MS); Ph 1H- v 13C-NMR: mỏy Varian Inova 500 MHz spectrometer, 500 MHz cho 1H v 125 MHz cho 13C; HPLC bỏn iu ch (semipreparative HPLC) (dựng cho giai on tinh ch): mỏy Hewlett Packard series 1100, ct Hypersil đ BDS C18 (5 mm, 250 ì 10 mm), dung mụi MeOH/H2O; LC-MS (dựng theo dừi phn ng) : mỏy Waters ZQ LC/MS detector vi phn mm Maslynx v4.1, ct HPLC Supercosil TM LC-ABZ C18 (5 àm, 50 ì 4.6 mm), dung mụi MeOH/H2O 2.2 Ni dung thc hin 2.2.1 Nghiờn cu trớch ly curcuminoid v tinh du t c Ngh vng Bỡnh Dng 2.2.1.1 Kho sỏt quy trỡnh trớch ly curcuminoid v tinh du t c ngh Kho sỏt tỏch curcuminoid kt hp tỏch tinh du cựng mt quy trỡnh nhm tn thu c ngun tinh du t c ngh, ng thi b qua giai on loi bộo gim thiu lng dung mụi s dng Trờn c s ú, chỳng tụi kho sỏt quy trỡnh (quy trỡnh v 2) trớch ly curcuminoid kt hp tỏch tinh du, ú vi quy trỡnh 1, tinh du c tỏch t nguyờn liu ngh ti ( m 80-85%) cũn quy trỡnh 2, tinh du c tỏch t nguyờn liu ngh khụ ( m 10-12%) trc trớch ly curcuminoid ỏnh giỏ tt hn hiu qu ca cỏc quy trỡnh trờn, chỳng tụi tin hnh mt quy trỡnh trớch ly curcuminoid (quy trỡnh 3) t nguyờn liu ngh khụ m khụng qua giai on tỏch tinh du Hiu qu ca cỏc quy trỡnh c ỏnh giỏ da trờn yu t: hiu sut trớch ly curcuminoid (% curcuminoid tinh thu c so vi lng nguyờn liu khụ tuyt i ban u) v tinh khit curcuminoid (hm lng curcuminoid mu c tớnh da theo phng phỏp lp ng chun) 2.2.1.2 Phõn tớch hm lng v thnh phn tinh du, curcuminoid thu c bng phng phỏp GC-MS, HPLC v LC-MS Tinh du sau tỏch c xỏc nh mt s tớnh cht húa lý v xỏc nh thnh phn bng phng phỏp GC-MS (thc hin ti trung tõm dch v KHCN sc ký Hi ng) Tinh du c ngh mt s vựng khỏc : ng Nai, Ngh An, Qung Nam cng c trớch ly v kho sỏt thnh phn cựng iu kin Hm lng curcuminoid mu curcuminoid thu c t quy trỡnh c xỏc nh bng phng phỏp HPLC ti trung tõm Dch v v Phõn tớch thớ nghim TPHCM T l thnh phn cỏc curcuminoid cú mu cng c xỏc nh bng HPLC-MS ti trung tõm o to v Phỏt trin sc ký TP HCM 2.2.1.3 Kho sỏt trớch ly curcuminoid bng phng phỏp un hi lu trc tip cú s h tr vi súng ỏnh giỏ hiu qu ca phng phỏp ny vic trớch ly curcuminoid, chỳng tụi cng tin hnh kho sỏt trớch ly curcuminoid bng phng phỏp un hi lu trc tip iu kin vi súng, so sỏnh vi phng phỏp trớch ly bng Soxhlet khụng cú vi súng 2.2.2 Nghiờn cu phõn lp thnh phn curcumin, DMC v BDMC t hn hp curcuminoid Bt curcuminoid thụ c kt tinh li ln hn hp methanol:nc 50oC Hn hp sau kt tinh c lc hỳt chõn khụng thu c cht rn Nc cỏi em cụ quay di ỏp sut thp thu c cht rn Sc ký ct cht rn v cht rn vi h dung mụi methanol: dichloromethane thu c cỏc thnh phn curcuminoid tinh khit Cỏc thnh phn c kim tra tinh khit, xỏc nh mt s tớnh cht húa lý, nh danh v xỏc nh cu trỳc bng cỏc phng phỏp lit kờ mc 2.1.2 2.2.3 Tng hp dn xut pyrazole v isoxazole ca curcuminoid Tng hp isoxazole curcumin (1) v isoxazole bisdemethoxycurcumin (24): O N O O HO-NH2 HCl HO HO OH R1 R2 OH R1 R2 (1) : R1=R2=OCH3: (24): R1=R2=H Tng hp pyrazole curcumin (2) v pyrazole bisdemethoxycurcumin (25) O N O NH NH2-NH2 H2O (2) HO OH R1 NH2-NH2 2HCl (25) HO R2 OH R1 R2 (2) : R1=R2=OCH3: (25): R1=R2=H Tng hp cỏc dn xut ca phenylpyrazole curcuminoid: R O O R HO N HO OH R1 N NH-NH2 HCl OH R2 R1 R2 (3) : R1=R2=OCH3 ; R=H (10) : R1=R2=OCH3 ; R= p-Br (23) : R1=OCH3 ; R2=H ; R=H (4) : R1=R2=OCH3 ; R= o-NO2 (11) : R1=R2=OCH3 ; R= p-I (26) : R1=R2=H ; R=H (5) : R1=R2=OCH3 ; R= o-CH3 (12) : R1=R2=OCH3 ; R= p-CH3 (6) : R1=R2=OCH3 ; R= o-F (7) : R1=R2=OCH3 ; R= m-F (13) : R1=R2=OCH3 ; R= p-CF3 (14) : R1=R2=OCH3 ; R= p-COOH (27) : R1=R2=H ; R=p-F (28) : R1=R2=H ; R=p-Cl (8) : R1=R2=OCH3 ; R= p-F (15) : R1=R2=OCH3 ; R= 2,4-di-F (9) : R1=R2=OCH3 ; R= p-Cl (16) : R1=R2=OCH3 ; R= 3,5-di-F (29) : R1=R2=H ; R=p-Br (30) : R1=R2=H ; R=p-CH3 Tng hp cỏc dn xut khỏc ca pyrazole curcumin: O N O R N R-NH-NH2 HO (17) : R= (18): R= HO OH OCH3 OCH3 O (19): R= CH3 O C N N S O (20): R= CH3CH2 O C OCH3 OH OCH3 (21): R= HO-CH2-CH2(22): R= CF3-CH2- Phng phỏp thc hin Hũa tan 50 mg curcuminoid (curcumin, demethoxycurcumin hoc bisdemethoxycurcumin) v lng thớch hp tỏc cht (t l mol ~1:1 1:2) vo methanol Kim tra v iu chnh pH ~ 2-5 (tựy phn ng, dựng acid acetic bng hoc HCl m c hoc CH3COONa) Thc hin phn ng 20-60 gi (tựy phn ng) nhit hi lu, cú khuy trn Theo dừi v xỏc nh im dng phn ng bng bn mng (TLC silica gel 60G F254 (Merck) hoc TLC aluminium oxide 60G, trung tớnh, F254 (Merck), hin mu bng ốn UV (254 nm/ 365 nm) hoc H2SO4 10% ethanol hoc hi I2, h dung mụi trin khai tựy vo phn ng Hn hp sau phn ng c cụ gim ỏp loi dung mụi, trớch ly vi ethyl acetate: nc Lp ethyl acetate c lm khan, cụ gim ỏp thu c sn phm thụ Sn phm c tinh ch bng sc ký ct hoc HPLC iu kin phn ng, phng phỏp tinh ch v hiu sut tng hp tng sn phm c trỡnh by c th bng 2.1 ca lun ỏn Cỏc sn phm c nh tớnh, nh lng, xỏc nh cu trỳc bng mt s phng phỏp phõn tớch nh o im chy, UV-Vis, ph MS, 1H- v 13C-NMR (1D, 2D), IR 2.2.4 Xỏc nh hot tớnh sinh hc ca tinh du, curcuminoid v cỏc dn xut curcuminoid tng hp c 2.2.4.1 Xỏc nh hot tớnh khỏng oxy húa (thc hin ti trung tõm Sõm v Dc liu TPHCM) a Phng phỏp quột gc t DPPH: Kh nng quột gc t DPPH c xỏc nh bng s gim hp thu bc súng =515nm, gc DPPH b kh bi cht khỏng oxy hoỏ (AH) Cht i chng: Vitamin C (acid L-ascorbic) b Phng phỏp MDA Kh nng c ch quỏ trỡnh peroxide hoỏ lipid ca cỏc cht nghiờn cu c ỏnh giỏ thụng qua vic xỏc nh hm lng malonyl dialdehyde (MDA) l sn phm ca quỏ trỡnh peroxide húa lipid mng t bo MDA phn ng vi acid thiobartiburic (TBA) to phc trimethin (mu hng) cú hp thu cc i bc súng =532nm Cng mu ca dung dch t l vi hm lng MDA Cht i chng: trolox (6-hydroxy-2,5,7,8tetramethylchroman-2-carboxylic acid) 2.2.4.2 ỏnh giỏ hot tớnh khỏng nm, khỏng khun phng phỏp MIC (Thc hin ti B mụn Vi sinh - Ký sinh, i hc Y dc Tp H Chớ Minh) Xỏc nh hot tớnh khỏng khun vi mt s dũng vi khun gram (+): Streptococcus hemolyticus, Staphylococcus aureus, gram (-): Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella dysenteria v hot tớnh khỏng nm Candida albicans theo phng phỏp pha loóng bn thch cỏc nng hot cht 15.625; 31.25; 62.5; 125; 250; 500;1000 àg/ml, xỏc nh nng c ch ti thiu MIC 2.2.4.2 ỏnh giỏ hot tớnh khỏng ung th a Hot tớnh gõy c t bo vi dũng t bo: HepG2, RD, Lu (Thc hin ti Phũng Sinh hc Thc nghim, Vin Hoỏ hc cỏc Hp cht Thiờn nhiờn, Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam) Xỏc nh hot tớnh khỏng ung th theo phng phỏp ca Skelan & CS (1990) v Likhiwitayawuid & CS (1993) Phng phỏp hin ang c ỏp dng ti Vin nghiờn cu ung th Quc gia ca Hoa K (NCI) v Trng i hc Dc, i hc Tng hp Illinois, Chicago, Hoa K Cht chun chng dng tớnh: Ellipticin pha DMSO b Hot tớnh gõy c t bo ung th tuyn tin lit PC3 (thc hin ti vin Eskitis (Eskitis Institute for Cell and Molecular Therapies), i hc Griffith, Australia) Phng phỏp thc hin: t bo ung th tuyn tin lit (PC3) v t bo thng NFF ngi (neonatal foreskin fibroblast nguyờn bo si bao quy u mi sinh) c nuụi mụi trng RPMI (mụi trng dựng nuụi cy t bo thng v t bo bch cu u ngi) c cung cp 10% FBS (fetal bovine serum huyt thai bũ) T bo c nuụi mụi trng to m cha 5% CO2 37oC Hot tớnh gõy c t bo c xỏc nh sau 72 gi s dng thớ nghim Alamar Blue xỏc nh s tng trng t bo (Alamar Blue proliferation assay) ng cong tng quan vi nng c phõn tớch dựng phng phỏp hi quy khụng tuyn tớnh v giỏ tr IC50 c xỏc nh bng chng trỡnh GraphPad Prism Paclitaxel (taxol) c dựng l cht chun dng tớnh quỏ trỡnh sng lc Giỏ tr SI (selective index) c xỏc nh theo biu thc : SI = IC50(NFF)/IC50(PC3) CHNG 3: KT QU 3.1 Kt qu nghiờn cu trớch ly curcuminoid v tinh du t c ngh 3.1.1 Kt qu kho sỏt quy trỡnh trớch ly curcuminoid v tinh du Bng 3.1: Kt qu kho sỏt quy trỡnh tỏch curcuminoid v tinh du t c ngh Quy trỡnh (*) Vtinh du (ml)* 2.20 1.25 Ccur (%) 96.2 96.0 92.7 H (%) 7.80 6.54 7.85 : Tớnh trờn 200g ngh ti ( m 87%) Kt qu cho thy, quy trỡnh cho hiu qu tt nht, khụng ch thu c phn ln lng tinh du t bt ngh, hiu sut trớch ly curcuminoid cng khỏ tt (7.80%) tng ng so vi quy trỡnh trớch ly curcuminoid trc tip i t nguyờn liu khụ (quy trỡnh 3, 7.85%), ng thi tinh khit ca curcuminoid thu c cao (96.2%) iu ú cho thy tớnh kh thi ca quy trỡnh trớch ly curcuminoid kt hp tỏch tinh du khụng qua giai on loi bộo quy mụ sn xut cụng nghip, khụng nhng giỳp trớch ly hiu qu ngun Kt qu ny phự hp vi nhng nghiờn cu ó c cụng b trc õy v thnh phn tinh du ngh Vit Nam Tinh du ngh (Curcuma longa L.) Bỡnh Dng tỏch c cú mu vng nht, cú mựi thm hng cay c trng Cỏc ch s húa lý ca tinh du (bng 3.2) khụng khỏc bit nhiu so vi kt qu nghiờn cu t ti liu tham kho, tinh du cú ch s acid v x phũng thp, d tan ethanol 90% Kt qu phõn tớch HPLC cho nng mu curcuminoid thu c t quy trỡnh cú tinh khit khỏ cao 96.14% tinh khit ca curcumin thu c tng ng vi cỏc sn phm ang lu hnh trờn th trng (>95%) chng t tớnh kh thi ca quy trỡnh vic a vo sn xut quy mụ ln T l din tớch cỏc peak tng ng l 47708/214808/1282510 hay 3.1%, 13.9% v 83.0% Nu xem gn ỳng t l ny l t l lng ca cỏc curcuminoid mu thỡ cú th nhn thy curcuminoid thu c t ngh x c Bỡnh Dng cú thnh phn curcumin khỏ cao so vi mt s sn phm hin cú trờn th trng Hỡnh 3.1 Ph HPLC-MS mu curcuminoid thu t quy trỡnh 3.1.4 Kt qu kho sỏt trớch ly curcuminoid bng phng phỏp un hi lu trc tip cú s h tr ca vi súng Bng 3.3 Kt qu kho sỏt trớch ly curcuminoid theo phng phỏp Soxhlet v phng phỏp un hi lu trc tip cú s h tr vi súng Nng ethanol (% v/v) T l R/L (g/ml) Thi gian (gi) Hiu sut trớch ly (%) tinh khit curcuminoid (%) Phng phỏp Soxhlet 95 1/16 10.66 96.38 10 Phng phỏp un hi lu trc tip cú s h tr vi súng 95 1/11 0.5 9.54 94.39 So vi phng phỏp trớch ly Soxhlet thụng thng, phng phỏp trớch ly bng cỏch un hi lu trc tip cú s h tr ca vi súng th hin u im ni bt, ú l tit kim thi gian v nng lng nh vo vic rỳt ngn thi gian trớch ly (30 phỳt so vi 3gi) Tuy nhiờn, iu kin vi súng, cỏc thnh phn cú phõn cc cao dc liu cng b kớch hot mnh hn so vi thnh phn phõn cc thp, d b trớch ly cựng vi curcuminoid lm gim tinh khit v hiu sut trớch ly (Ccur~94.4%, H~9.5%) so vi phng phỏp Soxhlet thụng thng (Ccur~96.4%, H~10.7%) 3.2 Kt qu nghiờn cu phõn lp thnh phn curcuminoid 3.2.1 Kt qu quỏ trỡnh phõn lp cỏc thnh phn curcuminoid Hỡnh 3.5 (A) curcumin, (B) DMC, (C) BDMC Hỡnh 3.6 Sc ký HPLC ca (A) curcumin, (B) DMC, (C) BDMC 11 Hỡnh 3.7 Ph UV-vis (trong ethanol) ca (A) curcumin, (B) DMC, (C) BDMC Bng 3.8: Tớnh cht vt lý c trng ca cỏc curcuminoid Tớnh cht Hỡnh dng tnc (oC) max UV-Vis ethanol (nm) Rf * Curcumin DMC Tinh th hỡnh kim Tinh th hỡnh kim Mu vng ti Mu cam 179.5-183.5 168.5-170.2 BDMC Tinh th hỡnh kim Mu vng cam 213.2-215.5 426 422 418 0.53 0.31 0.18 * TLC (Silica gel 60G, F254; CH2Cl2:CH3OH:98:2 v/v) 3.2.2 Kt qu nhn danh v xỏc nh cu trỳc cỏc thnh phn curcuminoid Kt qu phõn tớch IR, MS, NMR phự hp vi cu trỳc ca thnh phn curcuminoid So vi kt qu NMR ó cụng b v cu trỳc cỏc thnh phn, kt qu ny phn ỏnh y hn cu trỳc thnh phn, c bit thnh phn bt i xng DMC O OH Curcumin: R1 = R2 = OCH3 Demethoxycurcumin(DMC):R1=H,R2= OCH3 HO OH R1 R2 Bisdemethoxycurcumin (BDMC):R1=R2 = H 3.3 Kt qu tng hp dn xut ca curcuminoid ó tng hp 30 dn xut ca curcuminoid, ú gm 22 dn xut ca curcumin, dn xut ca DMC v dn xut ca BDMC Tt c cỏc dn xut u c nh danh, xỏc nh cu trỳc bng cỏc phng phỏp ph IR, MS, NMR (1D v 2D) Cỏc dn xut ó tng hp gm: 12 N N O HO HO OH OCH3 NH OH OCH3 OCH3 OCH3 Dn xut 2: Pyrazole curcumin Dn xut 1: Isoxazole curcumin NO2 N N N HO HO OH OH OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 N Dn xut 4: N-(2-nitrophenyl)pyrazole curcumin Dn xut 3: N-Phenylpyrazole curcumin F CH3 N N N HO HO OH OCH3 OH OCH3 OCH3 OCH3 Dn xut 6: N-(2-fluorophenyl)pyrazole curcumin Dn xut 5: N-(2-methylphenyl)pyrazole curcumin F N F N HO N OH OCH3 OCH3 OH OCH3 OCH3 Dn xut 8: N-(4-fluorophenyl)-pyrazole curcumin Br Cl HO OCH3 N HO Dn xut 7: N-(3-fluorophenyl)pyrazole curcumin N N N N HO OH OCH3 OCH3 Dn xut 9: N-(4-chlorophenyl)pyrazole curcumin N OH OCH3 Dn xut 10: N-(4-bromophenyl)-pyrazole curcumin 13 I N CH3 N N HO HO OH OCH3 N OH OCH3 OCH3 OCH3 Dn xut 12: N-(4-methylphenyl)-pyrazole curcumin Dn xut 11: N-(4-iodophenyl)pyrazole curcumin CF3 N COOH N N HO OH OCH3 OCH3 HO OH OCH3 OCH3 Dn xut 13: N-(4trifluoromethylphenyl)pyrazole curcumin F N Dn xut 14: N-(4-carboxylphenyl)pyrazole curcumin F N N N N HO HO OH OH H3CO HO OCH3 N HO OCH3 N N S OH Dn xut 21: N-(2-hydroxyethyl)-pyrazole curcumin Dn xut 18: N-(2-benzothiazolyl)-pyrazole curcumin N OH H3CO N N OCH3 Dn xut 17: N-(2-pyridyl)pyrazole curcumin Dn xut 16: N-(3,5-difluorophenyl)pyrazole curcumin HO OH OCH3 OCH3 OCH3 N N O OH HO Dn xut 24: Isoxazole bisdemethoxycurcumin 14 NH OH Dn xut 25: Pyrazole bisdemethoxycurcumin Trong ú cú 10 dn xut hon ton mi (theo Scifinder ngy 28/1/2013) F d e c b f F a 3' HO 2' 5' 8' N 4' 10' 9' N 6' 7' OCH3 10 OH OCH3 Kt qu tớnh bng phn mm ChemBioDraw Ultra 12.0: Cụng thc phõn t: C27H22F2N2O4 Khi lng phõn t : 476.15 MS: m/z = 477.0 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, DMSO): 7.05 (s, 1H, H-1), 6.99 (d,J=17 Hz,1H,H-3), 6.52 (d, J=16Hz, 1H, H-3), 7.16(d, J=17Hz, 1H, H-4), 7.15(d, J=16Hz,1H,H-4), 7.21 (s,1H,H-6), 7.04 (s,1H,H6), 6.79(d, J=8 Hz,1H, H-9), 6.76(d, J=8Hz, 1H, H-9), 6.99(d, J=8 Hz,1H, H-10), 6.93 (d, J=8 Hz,1H, H-10), 3.78 (s,3H,C7-OCH3), 3.84 (s, 3H, C7-OCH3), 9.15(s, 1H, C8-OH),9.25(s, 1H, C8OH), 7.68(m, H-f), 7.31(m, H-e), 7.58 (m, H-c) C-NMR (125 MHz, DMSO): 161.9 (m), 156.7 (dd), 151.7, 147.8, 147.7, 147.5, 146.9, 143.9, 133.1, 130.9, 130.7(d), 128.2, 127.5, 123.5(d), Dn xut 15: 120.2, 117.1, 115.7, 115.5, 112.3(d), 111.1, 110.8, N-(2,4-difluorophenyl)pyrazole curcumin o Bt, vng nht; tnc:174.2-176.4 C; tan 105.3(t), 99.7, 55.7, 55.6 dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, methanol; max(ethyl acetate)=248nm; Rf=0.58 (TLC Silica gel 60G, F254, DCM/MeOH:90/10) HO 8' 9' 10' H-NMR (500 MHz, CDCl3): 6.82 (s,1H,H-1), OH 10 7.65 (d, J=16.5 Hz, 1H, H-3), 7.04 (d, J=16Hz, 7' 5' 4' 3' 2' H3CO OCH 1H, H-3), 7.08 (d, J=16.5Hz, 1H, H-4), 7.11 (d, 6' N N J=16Hz, 1H, H-4), 7.06 (d, J=1.5Hz, 2H, H-6, H6), 6.90 (d, J=8 Hz, 1H, H-9), 6.92 (d, J=8Hz, 2" O 1" O 1H, H-9), 7.04 (dd, J=8 Hz; 1.5Hz, 1H, H-10), Kt qu tớnh bng phn mm ChemBioDraw Ultra 12.0: 6.98 (dd, J=8.5Hz; 1.5Hz, 1H, H-10), 3.90 (s, Cụng thc phõn t: C23H23N2O6 3H, C7-OCH3), 3.94 (s, 3H, C7-OCH3), 5.80 (s, Khi lng phõn t : 422.15 1H, C8-OH), 5.83 (s, 1H, C8-OH), 4.09 (s, 3H, H2) Dn xut 19: Methyl pyrazolecurcumincarboxylate Rn, trng vng nht; tnc: 142-143oC; tan 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 154.0, 151.2, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, methanol; 147.3, 146.9, 146.8, 146.7, 146.4, 134.4, 133.9, Rf=0.13 (TLC Silica gel 60G, F254, DCM/MeOH:98/2) 129.0, 128.9, 121.6, 121.3, 117.3, 114.7, 114.6, HR-MS: m/z = 423.155262 [M+H]+ (kt qu tớnh toỏn 114.1, 108.5, 108.0, 102.9, 55.8, 56.0, 54.6 cho C23H22N2O6 l 423.155063) HO 8' 9' 10' OH H-NMR (500 MHz, CDCl3): 6.83 (s, 1H, H-1), 10 7.66 (d, J=16.5 Hz, 1H, H-3), 7.03 (d, 7' 5' 4' 3' 2' H3CO OCH3 J=16.5Hz,1H, H-3), 7.08 (d, J=16Hz, 1H, H-4), 6' N N 7.11 (d, J=16.5Hz, 1H, H-4), 7.06 (d, J=1.5Hz, 2" 1H, H-6), 7.07 (d, J=1.5Hz, 1H, H-6), 6.91 (d, O 1" O 3" J=8.5Hz, 1H, H-9), 6.92 (d, J=8.5Hz, 1H, H-9), Kt qu tớnh bng phn mm ChemBioDraw Ultra 12.0: 7.04 (dd, J=8 Hz; 1.5Hz, 1H, H-10), 6.99 (d, Cụng thc phõn t: C24H24N2O6 J=8Hz; 1.5Hz, 1H,H-10), 3.97 (s, 3H, C7-OCH3), Khi lng phõn t : 436.16 3.95 (s, 3H, C7-OCH3), 5.71 (s, 1H, C8-OH), 5.81 (s, 1H, C8-OH), 4.54 (q, J=7Hz, 2H, H-2), Dn xut 20: Ethyl pyrazolecurcumincarboxylate o 1.50(t, J=7Hz, 3H, H-1) Rn, trng vng nht; tnc: 151.5-152.5 C; tan dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, methanol; 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 153.9, 150.7, Rf=0.14 (TLC Silica gel 60G, F254, DCM/MeOH:98/2) 147.2, 146.8, 146.6, 146.3, 134.3, 133.8, 129.1, HR-MS: m/z = 437.168967 [M+H]+ (kt qu tớnh 129.0, 121.6, 121.3, 117.5, 114.7, 114.6, 114.4, toỏn cho C23H22N2O6 l 437.170713) 108.5, 108.0, 102.9, 64.3, 56.0, 55.8, 14.4 15 13 HO 8' 9' 10' 7' H3CO 5' 6' 10 4' 3' 2' N OH OCH3 N 1" F 2" F F Kt qu tớnh bng phn mm ChemBioDraw Ultra 12.0: Cụng thc phõn t: C23H21F3N2O4 Khi lng phõn t : 446.15 Dn xut 22: N-(2,2,2-trifluoroethyl)-pyrazole curcumin HR-MS: m/z = 447.152719 [M+H]+ (kt qu tớnh toỏn cho C23H22N2O6 l 447.152618) H-NMR (500 MHz, CDCl3): 6.70 (s, 1H, H-1), 6.69 (d, J=16 Hz, 1H, H-3), 6.95 (d, J=16.5Hz, 1H, H-3), 7.06 (d, J=16.5Hz, 1H, H-4), 7.05 (d, J=16Hz, 1H, H-4), 6.98 (d, J=1.5Hz, 1H,H-6), 7.07 (d, J=1.5Hz, 1H, H-6), 6.94 (d, J=8Hz, 1H, H-9), 6.90 (d, J=8.5Hz, 1H, H-9), 7.05 (dd, J=8 Hz;1.5Hz, 1H, H-10), 6.98 (d, J=8Hz; 1.5Hz, 1H, H-10), 3.92 (s, 3H, C7-OCH3), 3.96 (s, 3H, C7OCH3), 5.74 (br, s, C8-OH), 5.81 (br, s, 1H, C8OH), 4.75 (q, 2H, H-1) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): 151.8, 146.9, Tinh th trng nht; tnc:161.5-162.7oC; tan 146.8, 146.6, 143.9, 134.3, 131.0, 129.6, 128.6, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, methanol; 123.1 (d), 120.9, 120.8, 117.9, 114.8, 114.5, Rf=0.18 (TLC Silica gel 60G, F254, DCM/MeOH:98/2) 111.0, 108.8, 107.9, 100.1, 56.0, 55.9, 50.4 (d) d c' c b b' a 3' 8' HO N 2' 5' 9' N 4' 10' 6' 7' 10 OH OCH3 Kt qu tớnh bng phn mm ChemBioDraw Ultra 12.0: Cụng thc phõn t: C26H22N2O3 Khi lng phõn t : 410.15 MS: m/z = 411.0 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, DMSO): 7.06 (s, 1H, H-1), 6.72 (d, J=16 Hz, 1H, H-3), 7.01 (d, J=16.5Hz, 1H, H-3), 7.17 (d, J=16.5Hz, 1H, H-4), 7.15 (d, J=16Hz, 1H, H-4), 7.21 (d, J=1.5Hz, 1H, H-6), 7.33 (d, J=9Hz, 2H, H-6, H-10), 6.67 (d, J=9Hz, 2H, H-7, H-9), 6.78 (d, J=8Hz, 1H, H-9), 6.98 (dd, J=8Hz; 1.5Hz, 1H, H-10), 3.84 (s, 3H, C7OCH3), 9.14 (s, 1H, C8-OH), 9.68 (s, 1H, C8OH), 7.53 (dd, J=8.5Hz; 1.5Hz, 2H, H-b, H-b), 7.57(t, J= 8Hz, 2H, H-c, H-c), 7.47 (t, J=7.5Hz, 1H, H-d) Dn xut 23: N-Phenylpyrazole 13 demethoxycurcumin C-NMR (125 MHz, DMSO): 157.9, 151.0, Bt trng; Tan chloroform, ethyl acetate, 147.9, 146.8, 142.3, 139.2, 132.4, 130.6, 129.3, methanol; Rf=0.42 (TLC Silica gel 60G, F254, 128.1, 128.4, 127.6, 127.2, 124.8, 120.1, 117.4, CHCl3/Acetone:50/50) 115.7, 115.6, 111.8, 109.8, 100.6, 55.6 d F MS: m/z = 399.16 [M+H]+ e c H-NMR (500 MHz, DMSO): 7.07 (s, 1H, H-1), f b a 6.94 (d, J=16.5 Hz, 1H, H-3), 6.75 (d, J=16.5 Hz, N N 1H, H-3), 7.17 (d, J=16.5Hz, 1H, H-4), 7.19 (d, 4' 10 10' J=16.5Hz, 1H, H-4), 7.36 (d, J=8.5Hz, 2H, H-6, 5' 9' 2' 3' H-10), 7.43 (d, J=8,5Hz, H-6, H-10), 6.77 (d, 8' 6' OH HO J=8,5Hz, H, H-7, H-9), 6.78 (d, J=8.5Hz, H-7,H7' 9), 9.5-9.8 (br, 2H, OH), 7,41(m, 1H, H-b), 7.31 Kt qu tớnh bng phn mm ChemBioDraw Ultra 12.0: (m, 1H, H-d), 7.61(m, 1H, H-e), 7.39 (m, 2H, HCụng thc phõn t: C25H19FN2O2 Khi lng phõn t : 398.14 f) Dn xut 26: N-(3-fluorophenyl)-pyrazole 13 C-NMR (125 MHz, DMSO): 162.1(d), 158.0, bisdemethoxycurcumin 157.5, 151.4, 142.6, 140.6(d), 132.9, 130.8, Bt vng nht; tnc:153-155oC; tan ethyl acetate, 131.0(d), 128.3, 127.9, 127.7, 127.2, 120.8, 116.8, methanol; Rf=0.29 (TLC Silica gel 60G, F254, 116.6, 115.7, 115.6, 114.4(d), 112.0(d), 101.1 DCM/MeOH:98/2) 16 F d c' c b' b a N 2' 4' 10' 5' 9' N 3' 8' HO 10 6' 7' OH Kt qu tớnh bng phn mm ChemBioDraw Ultra 12.0: Cụng thc phõn t: C25H19FN2O2 Khi lng phõn t : 398.14 MS: m/z = 399.13 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, CD3OD): 6,95 (s, 1H, H1), 6.91 (d, J=16.5 Hz, 1H, H-3), 6.24 (d, J=16.5 Hz,1H, H-3), 7.17 (d, J=16.5 Hz, 1H, H-4), 7.19 (d, J=16.5Hz, 1H, H-4), 6.76 (dd, J=8.5; 1.5Hz, 2H, H-7, H-9), 6.79 (dd, J=8.5; 2Hz, 2H, H-7, H-9), 7.29 (d, J=8.5Hz, 2H, H-6, H-10), 7.40 (d, J=8.5Hz, H-6, H-10), 7.73 (dd, J=9Hz; 5Hz, 2H, H-b, H-b), 7.44 (t, J=8.5Hz, 2H, H-c, H-c), C-NMR (125 MHz, CD3OD): 161.3(d), 159.4, 158.8, 153.3, 145.0, 134.7, 132.7, 130.9, 130.0, Dn xut 27: N-(3-fluorophenyl)-pyrazole 129.5(ovl), 129.3, 129.0, 129.0(d), 117.6, bisdemethoxycurcumin Bt vng nht; tan ethyl acetate, methanol; 117.3(d), 116.7, 116.6, 112.7, 101.0 Rf=0.37 (TLC Silica gel 60G, F254, hexane/EA:70/30) Cl d c' c b' b a N 2' 4' 10' 5' 9' N 3' 8' HO 10 6' 7' OH Kt qu tớnh bng phn mm ChemBioDraw Ultra 12.0: Cụng thc phõn t: C25H19ClN2O2 Khi lng phõn t : 414.11 Dn xut 28: N-(4-chlorophenyl)-pyrazole bisdemethoxycurcumin Bt vng rt nht; tnc: 250 251.2oC; tan ethyl acetate, methanol, ethanol; max (ethanol) = 365nm; Rf=0.36 (TLC Silica gel 60G, F254, hexane/EA: 70/30) Br d c' c b' b a 3' 8' HO 6' 7' N 2' 5' 9' N 4' 10' 10 OH Kt qu tớnh bng phn mm ChemBioDraw Ultra 12.0: Cụng thc phõn t: C25H19BrN2O2 Khi lng phõn t : 458.06 Dn xut 29: 4-bromophenylpyrazole bisdemethoxycurcumin Bt vng nht; tan ethyl acetate, methanol, ethanol; Rf=0.5 (TLC Silica gel 60G, F254, hexane/EA: 70/30) 17 13 MS: m/z = 414.93 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, CD3OD) 6.95 (s, 1H, H-1), 6.91 (d, J=16.5 Hz,1H, H-3), 6.65 (d, J=16.5 Hz, 1H, H-3), 7.17 (d, J=16.5 Hz, 1H, H-4), 7.18 (d, J=16.5Hz, 1H, H-4), 6.76 (d, J=8.5Hz, 2H, H7,H-9), 6.79 (d, J=8.5Hz, 2H, H-7,H-9), 7.30 (d, J=9Hz, 2H, H-6, H-10), 7.40 (d, J=8.5Hz, H-6,H10), 7.50 (d, J=8.5Hz, 2H, H-b, H-b), 7.58 (d, 2H, H-c, H-c) C-NMR (125 MHz, CD3OD): 159.4, 158.8, 153.6, 144.9, 139.4, 135.1,134.8, 132.8, 130.6, 130.0, 129.3, 129.0, 128.2, 117.6, 116.7, 116.6, 112.7, 101.4, 13 MS: m/z = 459.02 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, CD3OD) 6.95 (s, 1H, H-1), 6.90 (d, J=16.5 Hz,1H, H-3), 6.65 (d, J=16.5 Hz, 1H, H-3), 7.17 (d, J=16.5 Hz, 1H, H-4), 7.18 (d, J=16.5Hz, 1H, H-4), 6.76 (d, J=8.5Hz, 2H, H-7, H-9), 6.79 (d, J=9 Hz, 2H, H-7,H-9), 7.30 (d, J=8.5Hz, 2H, H-6, H-10), 7.39 (d, J=8.5Hz, H6,H-10), 7.49 (d, J=8.5Hz, 2H, H-b, H-b), 7.73 (m, 2H, H-c,H-c) C NMR (125 MHz, CD3OD): 159.4, 158.9, 153.6, 144.8, 139.8, 134.8, 133.7, 132.9, 130.0, 129.3, 129.0, 128.4, 122.9, 117.6, 116.7, 116.6, 112.7, 101.5 13 CH3 d c' c b' b a 3' 8' HO N 2' 5' 9' N 4' 10' 6' 7' 10 OH Kt qu tớnh bng phn mm ChemBioDraw Ultra 12.0: Cụng thc phõn t: C25H22N2O2 Khi lng phõn t : 394.17 Dn xut 30: 4-methylphenylpyrazole bisdemethoxycurcumin MS: m/z = 394.96 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, CD3OD) 6.92 (s, 1H, H-1), 6.90 (d, J=16.5 Hz, 1H, H-3), 6.62 (d, J=16.5 Hz,1H, H-3), 7.14 (d, J=16.5 Hz, 1H, H-4), 7.17 (d, J=16.5Hz, 1H, H-4), 6.74 (d, J=8.5Hz, 2H, H-7, H-9), 6.78 (d, J=8.5Hz, 2H, H-7,H-9), 7.26 (d, J=8Hz, 2H, H-6, H-10), 7.39 (d, J = 8Hz, H6,H-10), 7.38(m, 4H, H-b, H-b, H-c, H-c), 2.45 (s, 3H, Cd-CH3) C-NMR (125 MHz, CD3OD): 159.3, 158.8, 153.0, 144.7, 139.9, 138.1, 134.2, 132.5, 131.0, 130.1, 129.4, 129.2, 129.0, 126.8, 117.8, 116.7, 116.6, 113.1, 100.7, 21.2 13 Bt vng rt nht; tnc: 242.5 244oC; tan ethyl acetate, methanol, ethanol; max (ethanol) =365nm; Rf=0.33 (TLC Silica gel 60G, F254, hexane/EA:60/40) 3.4 Kt qu kho sỏt hot tớnh sinh hc: 3.4.1 Kt qu kho sỏt hot tớnh khỏng khun, khỏng nm v khỏng oxy húa ca tinh du ngh vng Bỡnh Dng: Bng 3.41 Nng c ch ti thiu MIC (àg/ml mụi trng) ca tinh du Ngh vng i vi mt s chng vi khun, vi nm Tinh du ngh Vi khun Streptococcus hemolyticus Staphylococcus aureus Salmonella Vi nm Microsporum gypseum Trichophyton mentagrophytes Candida albicans MIC (àg/ml) ng Qung Nai Nam Ngh An 250 250 500 125 62.5 125 125 31.25 125 62.5 31.25 125 3.125 3.125 9.76 3.125 3.125 1.953 3.125 3.125 1.953 3.125 3.125 1.953 Bỡnh Dng Tinh du Ngh vng Bỡnh Dng cng nh Ngh vng cỏc vựng ng Nai, Qung Nam v Ngh An cú kh nng khỏng mnh vi cỏc chng vi nm Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans 18 Bng 3.42 Giỏ tr IC50 th nghim hot tớnh khỏng oxy húa theo phng phỏp DPPH v MDA ca tinh du ngh vng Bỡnh Dng v cỏc vựng khỏc STT Hot cht Tinh du ngh Bỡnh Dng Tinh du ngh ng Nai Tinh du ngh Qung Nam Tinh du ngh Ngh An Curcumin Vitamin C Trolox IC50 (àg/ml) Pp DPPH 29.17 39.30 45.40 52.42 72.74 44.70 - IC50 (àg/ml) Pp MDA DMC > BDMC > curcumin 19 3.5 Kt qu kho sỏt hot tớnh khỏng oxy húa 3.5.1 Hot tớnh trung hũa gc t DPPH: 2000 1800 1600 IC50 (àM) 1400 1200 1000 800 600 400 200 Hỡnh 3.11 Hot tớnh quột gc t DPPH (so sỏnh IC50) ca curcumin, DMC, BDMC v mt s dn xut ca curcumin v BDMC Hot tớnh quột gc t DPPH ca curcumin > DMC > vitamin C > BDMC (hỡnh 3.11) DMC, BDMC v cỏc dn xut ca DMC (23) v BDMC (24, 25, 27, 29) u cú hot tớnh thp hn so vi curcumin v cỏc dn xut ca curcumin chng t vai trũ rt ln ca nhúm OCH3 c ch trung hũa gc t DPPH ca curcumin 3.5.2 Hot tớnh khỏng oxy húa theo phng phỏp MDA: 214 85.3 89.9 382 Trolox 3FPHC (7) PHC (3) HC (2) IOZ (1) BDMC 114.5 166 2,4DFPH C (15) IC50(àM) 97 DMC Curcumin Dn xut Bng 3.45 Hot tớnh khỏng oxy húa theo phng phỏp MDA ca curcuminoid v dn xut 111.1 3265 Kh nng khỏng peroxide húa lipid ca curcuminoid v cỏc dn xut u cao hn nhiu so vi cht i chng trolox, nhiờn cỏc dn xut u th hin hot tớnh thp hn curcumin 20 3.6 Kt qu kho sỏt hot tớnh gõy c t bo 3.6.1 Hot tớnh gõy c t bo vi dũng t bo HepG2, RD, Lu Bng 3.46 Hot tớnh gõy c t bo vi dũng t bo HepG2, RD, Lu ca curcuminoid v cỏc dn xut STT Ký hiờu mõu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Chng (+) Curcuminoid Curcumin DMC BDMC (1) - IOZ (2) - HC (3) - PHC (4) - 2NPHC (5)- 2CH3PHC (6) - 2FPHC (7) - 3FPHC (8) - 4FPHC (9) - 4ClPHC (10) - 4BrPHC (11) - 4IPHC (12) - 4CH3PHC (13)-4CF3PHC (14) - 4CPHC (15)-2,4DFPHC (16)-3,5DFPHC (17) - PyCur (18) - HBTC (19) MHC (20) EHC (21) - HEHC (22) - CF3HC (23) - PHDMC (24) - IOZBC (25) - HBC (27)- 4FPHBC (28)-4ClPHBC (29)- 4BrPHBC (30)-4CH3PHBC IC50 (àg/ml) HepG2 Lu RD 0.4 0.5 0.2 ND 4.41 2.91 ND >5 2.9 ND 3.9 2.51 ND 2.5 3.03 >5 >5 1.92 >5 >5 1.56 2.0 4.4 1.6 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 2.39 >5 >5 >5 >5 3.41 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 4.78 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 2.91 >5 >5 4.72 >5 3.35 4.44 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 4.68 4.5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 IC50 (àM) HepG2 Lu RD 1.62 2.03 0.81 7.88 7.43 9.84 5.26 4.29 4.55 5.22 6.11 9.91 10.06 11.76 - ND ND ND 10 - 11.54 8.12 3.64 7.45 8.44 7.04 11.31 - Ngoi tr, phenylpyrazole curcumin (3) th hin hot tớnh gõy c vi c dũng t bo, nhỡn chung, kt qu cho thy cỏc dn xut to thnh khụng lm ci thin ỏng k 21 hot tớnh gõy c t bo ung th ca curcumin vi dũng t bo ung th kho sỏt l HepG2, RD, Lu 3.6.2.Hot tớnh gõy c t bo vi t bo PC3: Bng 3.47 Giỏ tr IC50(àM) v SI th nghim hot tớnh gõy c t bo vi dũng t bo ung th tuyn tin lit PC3 v t bo lnh NFF Hp cht Paclitaxel (Taxol) Curcumin BDMC 2NPHC (4) 2CH3PHC (5) 2FPHC (6) 4BPHC (10) 4CPHC (14) MHC (19) EHC (20) HEHC (21) CFHC (22) PC3 NFF SI 0.002 0.013 6.5 19 14 28 16 46 0.5 15 13 23 12 29 22 23 98 13 31 18 1.21 0.86 1.04 5.0 3.7 1.44 2.13 26.0 8.00 2.07 1.38 Curcuminoid v cỏc dn xut th hin hot tớnh gõy c t bo ung th tuyn tin lit PC3 mnh Nhiu dn xut th hin hot tớnh cao hn so vi curcumin cho thy cỏc dn xut pyrazole ó giỳp ci thin hot tớnh gõy c t bo ung th tuyn tin lit ca hp cht ny Trong ú ni bt l dn xut MHC (19) cú hot tớnh gp 38 ln curcumin, chn lc SI = 26 cao hn 22 ln so vi curcumin (SI = 1.21) cho thy tim nng ca dn xut 19 ny l rt ln vic tip tc nghiờn cu phỏt trin thnh thuc khỏng ung th tuyn tin lit Ngoi ra, MHC cng tha rule of five ca Lipinski, nờn cú th d oỏn tớnh kh dng sinh hc theo ng ung khỏ tt CHNG KT LUN ti ó thc hin c mt s ni dung sau: Kho sỏt quy trỡnh tỏch curcuminoid kt hp tỏch tinh du t nguyờn liu c Ngh vng (Curcuma longa L.) Bỡnh Dng u im ca quy trỡnh l tn thu c ngun tinh du t c ngh, trớch ly curcuminoid m khụng cn qua giai on loi bộo bng dung mụi hu c Curcuminoid thu c cú tinh khit cao (96.2%) v hiu sut trớch ly cao (7.80% tớnh trờn nguyờn liu khụ tuyt i) cho thy tớnh kh thi ca phng phỏp trin khai quy mụ ln Tinh du thu c chim 1.1 % trờn 22 o o o o o nguyờn liu ti ( m 87%) Cỏc thnh phn chớnh ca tinh du gm turmerone (38.91%), ar-turmerone (19.71%) v curlone (22.42%) Kho sỏt trớch ly curcuminoid theo phng phỏp Soxhlet v phng phỏp un hi lu trc tip cú s h tr ca vi súng Phng phỏp trớch ly cú h tr vi súng giỳp rỳt ngn thi gian trớch ly nhiờn hiu sut trớch ly v tinh khit curcuminoid thu c u thp hn so vi phng phỏp Soxhlet Nghiờn cu quy trỡnh phõn lp thnh phn curcumin, demethoxycurcumin v bisdemethoxycurcuminoid t hn hp curcuminoid nh danh, nh tớnh v xỏc nh cu trỳc ca cỏc thnh phn thu c Tng hp 30 dn xut ca curcuminoid, gm 22 dn xut ca curcumin, dn xut ca demethoxycurcumin v dn xut ca bisdemethoxycurcumin Trong ú cú 10 dn xut hon ton mi (dn xut 15, 19 ,20, 22, 23, 26, 27, 28, 29, 30), cha tng c cụng b cỏc cụng trỡnh v ngoi nc Cỏc dn xut u c nh danh, xỏc nh cu trỳc bng cỏc phng phỏp ph MS, IR, NMR Kho sỏt hot tớnh khỏng khun, khỏng nm, khỏng oxy húa v khỏng t bo ung th ca curcuminoid v cỏc dn xut: Curcuminoid v cỏc dn xut th hin hot tớnh khỏng khun, khỏng nm khỏ thp vi cỏc chng vi khun, vi nm kho sỏt Curcuminoid v cỏc dn xut u th hin hot tớnh quột gc t DPPH cao hn so vi cht i chng vitamin C, nhiờn cỏc dn xut to thnh khụng giỳp lm tng ỏng k hot tớnh bt gc t DPPH ca curcumin Curcuminoid v cỏc dn xut u th hin hot tớnh khỏng peroxide húa lipid cao hn so vi cht i chng trolox, nhiờn hu ht cỏc dn xut u th hin hot tớnh thp hn so vi curcumin Th nghim hot tớnh gõy c t bo ca curcuminoid v cỏc dn xut trờn dũng t bo: ung th gan HepG2, ung th phi Lu v ung th mng tim RD cho thy: ngoi tr phenylpyrazole curcumin, (3) th hin hot tớnh vi dũng t bo kho sỏt, isoxazole curcumin (1) v pyrazole curcumin (2) th hin hot tớnh gõy c t bo HepG2 cao hn curcumin, cỏc dn xut cũn li u cú hot tớnh thp hn so vi curcumin Curcuminoid v cỏc dn xut th hin hot tớnh mnh th nghim gõy c t bo ung th tuyn tin lit PC3 Trong s ú, dn xut methyl pyrazolecurcumincarboxylate (dn xut 19) cú hot tớnh cao gp 38 ln curcumin, chn lc rt tt ( SI =26) rt cú tim nng tip tc nghiờn cu phỏt trin thnh thuc i vi ung th tuyn tin lit 23 DANH MC CC CễNG TRèNH CễNG B Phan Th Hong Anh, Lờ Xuõn Tin, Trn Th Vit Hoa, Trn Vn Sung, Tng hp v xỏc nh hot tớnh sinh hc ca cỏc dn xut isoxazol, pyrazol v phenylpyrazol curcumin, Tp Chớ Húa Hc, 47 (4A), 1-6, 2009 Phan Th Hong Anh, Lờ Xuõn Tin, Trn Th Vit Hoa, Trn Vn Sung, Synthesis and biological activities of two novel curcumin derivatives: 2hydrozinobenzothiazolcurcumin and 2,4-difluorophenylhydrazinocurcumin, Tp Khoa hc v Cụng ngh, 48 (2A), 192-199, 2010 Phan Th Hong Anh, Lờ Xuõn Tin, Nguyn Th Mc Phong, Trn Th Vit Hoa, Trn Vn Sung, Phan Thanh Sn Nam, Nghiờn cu phõn lp thnh phn v hot tớnh ca cỏc curcuminoit trớch t c ngh vng (Curcuma longa L.), Tp Húa hc, 48(4), 397-403, 2010 Phan Th Hong Anh, Trn Th Vit Hoa, Trn Vn Sung, Synthesis and biological activities of some derivatives of phenylhydrazinocurcumin, Tp Húa hc, 49(5), 647-651, 2011 Phan Th Hong Anh, Trn Th Vit Hoa, Trn Vn Sung, Tng hp v xỏc nh hot tớnh sinh hc mt s dn xut ca bisdemethoxycurcumin, Tp Húa hc, 50(4), 488-492, 2012 24