B GIO DC V O TO TRNG I HC s PHM H NI H NH NGC NGHIấN CU PHN LP V KH NNG LấN MEN CA MT S CHNG VI SINH VT TRONG MI TRNG Cể B SUNG TO XON (SPIRULINA sppO Chuyờn ngnh: Sinh thỏi hc Mó s: 60 42 01 20 LUN VN THC s SINH HC Ngi hng dn khoa hc: PGS TS nh Th Kim Nhung H NI, 2016 Trong quỏ trỡnh tỡm hiu, nghiờn cu v hon thnh lun thc s, tụi ó nhn c nhng li chi bo, hng dn tn tỡnh ca cỏc thy cụ giỏo, cỏc anh ch em v cỏc bn Vi lũng kinh trng v bit n sõu sc, tụi xin by t lng bit n ti: PGS.TS inh Th Kim Nhung - Ngi ó trc tip hng dn, dy bo, ng viờn v to mi iu kin thun li tụi hon thnh lun vón Tụi xn chõn thnh cm n cỏn b phũng Vi sinh trng HSP H Ni Bờn cnh , Ban gim hiu, Phũng sau i hc, cỏc Phũng, Ban trng HSP H Ni ó to cỏc iu kin thun li nht cho tụi quỏ trỡnh lm vic ng thi tụi cng xin chõn thnh cm n cỏc cỏn b ca Vin V sinh Dch t Trung ng ó giỳp tụi quỏ trỡnh chp nh mu hon thnh nghiờn cu ca mỡnh Cm n cỏn b S khoa hc cụng ngh - Tnh Vnh Phỳc ó giỳp tụi phõn tớch mu hon thnh lun ca mỡnh Cựng vi ú l s bit n chõn thnh ti nhng ngi thõn gia ỡnh, bn bố ó giỳp v ng viờn tụi sut quỏ trỡnh thc hin ti ny H Ni, thỏng 08 nm 2016 Hc viờn H nh Ngc Tụi xin cam oan õy l cụng trỡnh nghiờn cu ca riờng tụi, di s hng dn ca PGS.TS inh Th Kim Nhung Lun ny khụng cú s trựng lp vi cỏc ti khỏc H Ni, thỏng 08 nm 2016 Hc viờn H nh Ngc MC LC 1.1.2 1.1.1.1 Kim tra tớnh i khỏng ca nhúm vi sinh vt c tuyn chn lờn men Bng 3.19 nh hng ca pH n quỏ trỡnh lờn men cacỏc chng vi sinh vt tuyn chn Bng 3.20 nh hng ca nhit n quỏ trỡnh lờn menca cỏc chng vi sinh vt tuyn chn 59 Bng 3.21 ỏnh giỏ cht lng sn phm nc gii khỏtbng phng phỏp cm quan 67 BNG CH CI VIẫT TT TRONG LUN VN TCN VK : Trc cụng nguyờn : Vi khun NM TCVN : Nm men : Tiờu chun Vit Nam MT TP : Mụi trng : Thnh ph Nxb : Nh xut bn M U Lớ chn ti Cựng vi s phỏt trin ngy cng cao ca xó hi thỡ nghnh cụng nghip sn xut nc gii khỏt cng phỏt trin mnh m Vi xu hng ca thi i cỏc sn phm nc nc gii khỏt lờn men c lm t cỏc ngun nguyờn liu giỏ tr dinh dng cao ngy cng c a chung Hin trờn th trng xut hin nhiu loi nc gii khỏt vi nhiu hng v khỏc (nho, mn, tỏo, ) Tuy nhiờn, trờn thc tộ thỡ hu nh khụng cú cỏc sn phm nc gii khỏt lm t to xon To xon l mt loi vi to dng si xon mu xanh lc To xon ( Spiruina spp.) ó c nghiờn cu t nhiu nm Chỳng cú nhng c tớnh u vit v giỏ tr dinh dng cao Cỏc nh khoa hc trờn th gii ó coi to ( Sprulina spp.) l sinh vt cú ớch cho loi ngi T chc Y t th gii (WHO/OMS) cụng nhn to cSpiruina spp.) l thc phm bo v sc khe tt nht ca loi ngi th k 21 C quan qun lớ thc phm v dc phm Hoa Kỡ (FDA) cụng nhn nú l mt nhng ngun protein tt nht [17, 36, 39] Trờn th gii, sn phm t to xon ó c bit n dng l: thc phm, dc phm v m phm Nm 1960, Spirulina spp mi bt u c bit n, loi to ny tin s Clement ngi Phỏp tỡnh c phỏt hin n h Sat Trung Phi Nm 1963 Vin du ho Phỏp ó bt u quan tõm n bỏo cỏo v loi bỏnh to Dihe c bit ú l to Spiruina platenss, h ó tin hnh nghiờn cu loi to ny phũng thớ nghim ri xõy dng quy trỡnh sn xut th T nm 1970 Cụng ty Soda - Texcoco va sn xut soda va sn xut to trờn din tớch khong 12 vi sn lng mi ngy l trờn tn to khụ Nm 1973, T chc Lng nụng quc t v T chc Y t th gii ó chớnh thc cụng nhn Sprulna spp l ngun dinh dng v dc liu quý, c bit ong chng suy dinh dng v chng lóo húa Ti n , mt nghiờn cu nm 1995 ó chng t vi liu lg Spiruina/ngy, cú tỏc dng tr ung th nhng bnh nhõn ung th thúi quen nhai tru thuc Nht Hiroshi Nakamura cựng Christopher Hill thuc Liờn on vi to quc t cựng mt s nh khoa hc bt u nghiờn cu Spirulina spp t nm 1968 Hin ong cỏc Vit Nam, sn phm t to xon ch yu uc bit n dui dng duc phm Trong nhng nm 1985 -1995 ó cú nghiờn cu thuc lnh vc cụng ngh sinh hc cp nh nuc nhu nghiờn cu ca GS.TS Nguyn Hu Thuc v cng s vi ti Cụng nghip nuụi trng v v x lý to Spirulina Tuy nhiờn, sn phm ny ch mi phỏt trin nhng nm gn õy v chua cú ti nghiờn cu quỏ trỡnh lờn men mụi trung cú b sung to xon Vỡ vy, vic nghiờn cu quỏ trỡnh lờn men dch to xon t ú ng dng vo chộ bin nuc gii khỏt to xon, s gúp phn lm phong phỳ cỏc sn phm nuc ung trờn th trung v tn dng cỏc ớch li t ngun duc liu ny n ngui tiờu dựng, chớnh vỡ vy tụi tin hnh: Nghiờn cu phõn lp v kh nng lờn men ca mt s chng vi sinh vt mụi trng cú b sung to xon (Spirulina spp.) Mc ớch nghiờn cu Phõn lp v tuyn chn uc chng vi sinh vt cú kh nng lờn men to ung mụi trung cú b sung to xon (Spirulina spp.) Nhim v nghiờn cu 3.1 Phõn lp chng vi khun, nm men cú kh nng lờn men to ung mụi trung cú b sung to xon (Spiruina spp.) 3.2 Tuyn chn uc chng vi khun, nm men cú kh nng lờn men to ung mụi trung cú b sung to xon (Spirulina spp.) 3.3 nh ca mụi trung dinh dung ti quỏ trỡnh lờn men to ung mụi trung cú b sung to xon (Spiruina spp.) 3.4 nh ca iu kin lờn men to ung mụi trung cú b sung to xon (Spirulna spp.) ng dng lờn men to ung mụi trung cú b sung to xon {Spirulina spp.) i tng v phm vi nghiờn cu 4.1 i tng nghiờn cu: chng vi khun lactic, vi khun acetic, nm men tuyn chn t mụi trng lờn men cú b sung to xon (Sprulna spp.) 4.2 Phm vi nghiờn cu: chng vi khun v nm men cú kh nng lờn men to nc gii khỏt mụi trng b sung to xon (iSpiruina spp.) í ngha khoa hc v ý ngha thc tin 5.1 í ngha khoa hc ng dng c s khoa hc ca quỏ trỡnh lờn men lactic, lờn men acetic, lờn men ru lờn men to ung mụi trng cú b sung to xon (Spiruina spp.) 5.2 í ngha thc tin To ung gii khỏt mụi trng cú b sung to xon (Spirulina spp.) úng gúp mi ca ti Phõn lp c 15 chng vi khun lactic, 10 chng vi khun acetic v chng nm men Tuyn chn s b c chng vi khun thuc ging Lactobacillus: L2, L5, L]], L4, L, L, L7, L]2, LJ4, chng vi khun thuc ging Acetobacter: G], G2, G3, G6, G7, G v chng nm men Saccharomyces cerevsae:N, N4, N7 La chn c chng gm: vi khun Lactobacillus L2, vi khun Acetobacter G] nm men Saccharomyces cerevsae Nj lờn men to ung mụi trng b sung to xon {Spirulina spp.) Tỡm c mụi trng dinh dng v iu kin lờn men thớch hp cho quỏ trỡnh lờn men to ung mụi trng b sung to xon {Spirulina spp.) t tiờu chun v an ton thc phm: hm lng ng Sacarose 100 (g/1), to xon (Spirulina spp.) (g/1), KH2PO4 l(g/l), MgS04.7H20 0,6(g/l), pH = 4,5, nhit 30c Xõy dng quy trỡnh lờn men to sn phm nc gii khỏt quy mụ phũng thớ nghim NI DUNG CHNG TNG QUAN TI LIU 1.1 Gii thiu v to xon (Spiruina spp.) 1.1.1 S lc v to xon (Spirulina spp.) To lam hay cũn gi l vi khun lam theo ting Hi Lp thỡ cyanos-blue l mt ngnh vi khun m cú kh nng hp thu nng lng qua quỏ trỡnh quang hp To xon (Spiruina spp.) l vi khun lam dng si thuc ngnh vi khun lam hay to lam To xon (Spiruina spp.) l mt loi vi to cú dng xon hỡnh lũ so, mu xanh lam vi kớch thc ch khong 0,25 mm Chỳng sng mụi trng giu bicarbonate (HCO 3") v kim cao (pH 8,5-9,5) Chỳng cú nhng c tớnh u vit v giỏ tr dinh dng cao Do hỡnh thỏi lũ so xon d nhn bit qua kớnh hin vi, ngi ta cng thng gi to ny l to xon To (Sprulna spp.) tip tc c nghiờn cu s dng nh thc n -v thuc tng lai kh nng phỏt trin cc k nhanh ca mt vi sinh vt n bo To (Spiruinaspp.) xut hin cỏch õy hn t nm Nú l vi khun lam c nh cú lch s lõu i hn to nhõn tht hoc thc vt bc cao ti t nm Hn ngn nm trc t tiờn ca nhng ngi Aztect Mexico ó bit thu hỏi (Sprulina spp.) t cỏc h kim tớnh, phi di ỏnh nng mt i v dựng lm thc phm Tờn gi (Sprulna spp.) nh to hc Deurben (ngi c) t nm 1927, da trờn hỡnh thỏi ca to l dng si xon c (spiralis) [23], 1.1.2 c im sinh hc ca to xon (Spirulina spp.) 1.1.2.1 Phõn loi To (Spirulina spp.) phõn b rt rng rói cỏc mụi trng khỏc v v cú th phỏt trin cỏc mụi trng cỏc loi to khỏc khụng th sinh sng Mt vi loi thuc chi Spirulina tiờu bin nh Sprulna platenss, Spirulna maxima, Spirulina geilleri F.geier Ngnh to lam sp lin sau ngnh vi khun v tỏch riờng vi cỏc nhúm to khỏc l vỡ: Cha cú nhõn rừ rt,khụng cú s sinh sn hu tớnh, cú cha sc t, tn n s, n bo hoc hỡnh si 1.1.2.2 c im sinh l To xon (Spirulina spp.) l mt loi vi to dng si xon mu xanh lc, ch cú th quan sỏt thy hỡnh xon si nhiu t bo n cu to thnh di kớnh hin vi Vy hm lng ng sacarose lOOg/l), hm lng nit hu c to xon 9(g/l), KH2PO4 l,0(gA), MgS4.7H 0,6(g/l), iu kin pH = 4,5, nhit 30Cl thớch hp lờn men to ung mụi trng b sung to xon (Spirulina spp.) 3.5 ng dng lờn men to ung mụi trng b sung to xon (Spirulina spp.) Chn nhúm 1: Vi khun Lactobacillus L2, vi khun Acetobacter Gj nm men Saccharomyces cerevsae N] lờn men to ung mụi trng b sung to xon Spirulina v kim tea an ton thc phm theo TCVN 3.5.1 Lờn men to ung mụi trng b sung to xon Spirulina spp.) Lờn men to sn phm nc gii khỏt vi cht lng tt, an ton cn phi s dng cỏc loi nguyờn liu, hm lng ging b sung (vi khun, nm men) ỳng loi v t l, m bo yờu cu v sinh Chỳ ý: Dch to c b sung ng hoc dch to c b sung ng KH2PO4, MgSệ4.7H20 ó kh trựng ngui sau ú mi b sung ging nu khụng s lm cht ging Khụng dựng cỏc loi dng c bng st lờn men nờn dựng bỡnh thy tinh, s hoc plastic Giai on 1: Ch bin dch to ng v lờn men Bc 1: Ch bin dch to Pha ch thnh dch to vi t l to : nc = 9(g) bt to: 1000 (ml) nc Bc 2: B sung ng, KH2PO4, MgS04.7H20ó kh trựng v lm ngui Mc ớch: l h thp nhit ca dch to, hn chộ s xõm nhp ca vi sinh vt v thun tin cho quỏ trỡnh phi trn, trỏnh lm mt hng v c trng ca sn phm ng thi b sung 100(g/l) ng vo dch to v KH2PO4 l,0(g/l), MgS04.7H20 0,6(g/l) Bc 4: Lờn men õy l quỏ trỡnh lờn men hiu khớ nờn rt d nhim vi sinh vt l v c bit l nm mc Do ú cn dch lờn men vo bỡnh thy tinh tht sch, lau khụ v y kớn bng khn vi ó tit trựng dch to xon cú b sung ng ó ngui vo, b sung dch ging t l 20% (YK: NM = 1:1) vo dch lờn men, ni thoỏng mỏt vũng ngy l c Giai on 2: Hon thin v thu sn phm Bc 1: Thu dch v lc dch lờn men Sau quỏ trỡnh lờn men kt thỳc thu ly dch lờn men em lc Lc dch lờn men: mc ớch loi b cn, xỏc vi sinh vt sau quỏ trỡnh lờn men, lm dch lờn men, tng cht lng cm quan Bc 2: Phi trn v b sung dch qu B sung thờm dch qu: Chui, mớt, xoi nhm to mựi hng thm Sau thu nhn dch lờn men, chỳng tụi b sung t 0,2% dch chui chớn, dch mớt, dch xoi cho mựi thm nh nhng Bc 3: Thanh trựng, thu sn phm Mc ớch: Kt thỳc quỏ trỡnh lờn men, dit vi sinh vt gõy hi, tng thi gian bo qun sn phm Sau trựng nc gii khỏt s c úng chai, bo qun t lnh thi gian tun Hỡnh 3.10 Ba mu lờn men to nc gii khỏt cú b sung to xon (Spirulina spp.) 3.5.2 Kim tra cht lng sn phm - Tụi ó gi mu kim tra cỏc ch tiờu vi sinh v hm lng mt s kim loi nng sn phm Kt qu: Sn phm t mu lờn men t cỏc ch tiờu cht lng v an ton thc phm theo quy nh - Thnh phn dinh dng sn sau lờn men l tt cú hm lng nhiu loi axitamin quý tng lờn nh: Alanin, valin S li khun ng rut: Khong 10xl06li khun HM- I WVJ-1i n,!; )2iM7ilÊZ - K ẫT O IJ T H N GM M S 041A/KQ-KT& I KM , ^ iỏi khỏt (Lờn men lactic dch to XO& I I Tờn mu th: Nc giai Kna* t Ky hiu uiõ MA-001/12 .- ti - Sớỡ biờn bn th nghim: BB.4la.l5 n v lớnh Mc quy inh * Tờn chi bộn mg/l < 0,05 KPHT 12 H eoli CFU/ml 3- Colt fro m CFU/ml [4 Pseoomonas j CFU/xnl Khụng Cể Khụng cú CFU/ml Khụng cú Khụng c aeruginosa Streptococci faecal Khụng cú Kl qu 10 Khụng cú Khụng cú Phong phỏp th TCVN 8126:2009 TCVN 7924-1:2008 TCVN 6848:2007 ISO 16266:2006 TCVN 6189-2:1996 I^Ngl-h ằmỏu: 04/ ] 2/2015 Sf1 lng ớrtuớ 01 I - Ngy th nghim: 04/12/2015 rinii trng nii.: MU ng Irongchỳ nha trng, khụng I I TH NGHIM VIấN PH TRCH vp 0ZJ i Bnh PhrnNgc Thch _ Vnh Ytingy 10 thỏng 12 nm 2015 ^ (fTRUNG TAMV^\ -fhf KYTHUAI-f 11 I v TiTKinr ziLv I -KPHT: ú^lZVhớnỡhlyng ộn' tờn mu ghi lheySu cu cựa khỏch hng phm dú nớỡnn khụng cõn) C /. curofins N VI PHAP THNGHIM KT QU TH Sac Ky Hai04/02/2016 Dang PHNG 04/02/2016 UNIT TEST METHOD s/ Wo.:16022283/KQ STT/ CH TIU TH NGHIấM Tộn khỏch hng / Customer a chi / No PARAMETER Adress Nng lng nhn mu/ Date of receiving Ngy m Protein Ngy thc hin/ (') Testing dale Tờn NaBộo m/ me () of sample Tinh trng pz Canxớ (Ca) (') mu/ State oớsample Ghi chỳ/ Noe I5 rt~ Magie (Mg) (*) Kali (K) n - TESTREPORT Acid aspartic (Tng) g/100 mL AOAC 994,12 (GC FID) Alanin (Tng) g/100 mL g/100 mL AOAC 994.12 (GC-FID)DIRECTOR GENERAL AOAC 994 12 (GC-FID1 I a Valin (Tng) KẫT QU RESULT Calculation Dch to xon cha lờn men lactic based on Kcl/100g 4.32 carbohydrate, protein and H NH NGC - TRNG THPT LIấN SN Dng lng ng chai fat nha : Trng THPT Lin Sn - Lp Thch - Vnh Phỳc FAO, 14/7, 1986, Page 221 0.57 Ngy tr kt qu/ Date ofissue : 20/02/2016 Mó 5I Code: 16020406/16020151 Trang/ Page: Khụng phỏt hiờn (LOD ớ/1 214 % FACT 14/7, 1986, Page =0.1) mg/Kg AOAC 968.08 mod 106 mg/Kg AO AC 968.08 mod 49.7 mg/Kg AOAC 969,23 mod 220 Hỡnh 3.11 Kt qu kim tra vi sinh ỏnh giỏ sn phm nc gii khỏt TNG GIM C 0.05 0.03 0.02 Hong I Ph trỏch k thut Technical Manager Dr, Phm Th nh SZI iỹ? COMPANY LIMITED Ks 9872 Distrrci HCMC.viataam wL eurafin?! BM-5.11/02 Lnban hnh: 03 Ngy hiu lc; 10/07/2015 16 u i.) *jfo sMớ-a bitmj.u nt:llMA-OC iiru ửfcfll ằ 15 Viyn^--V! SuL lirỗrnjf Bl ' !,s giy Uli - '.c'!*'l-'cmlh KSfjiõ 1 71 TMchl w*IItliLtitf y.jôi PlUFOMg pMp 11* 1H *&***! ' *"* sl.rn v ; nhn niớu,- Mr.ib Ducs IWS-*dB nhớt, ớiimf 4'JJ' 71 jAnọt FAQ, 1-4J? iW h* MpHo* " ' , V èèI.A' ni- tlunn s*ợ put fiiio 50.* mói _w AOACW80(èQèl> ' diô j;"U'lm! ùjs 1C |K" _mgHỹ. "S jifioini ftfcụ LC-MSM* r.c-Ms Ms jỗ'lOQnml Hit ôĂHIf.M ớ/^c,ớnc Ylớ-N : Bớu l'tlHớlB FIJI.1 TBtJH , è OU n il 7ifh Ijigù !jÊ5x-- fbọngOf ỡm 2C.16 ;fr- ẻT AO? tiblcM -H l.C-.Mo MS uO" FAO 14.7 ựm " J l.OLẻ-U.I FAO, I4J0 :m 1I1 m AACWS.OSfợOll) AAC68 0ô.l>ILJ iM AOAC9?,èS(6I1> I Hỡnh 3.12 Kt qu ỏnh giỏ sn phm nc gii khỏt trc lờn men Wf 5m^Wh^, T Bỡnh , ru s ' pVil s SUô That 11 , ỏ khch â6Ăc '& JọBi iửw ' Ê gi s w jfa nA jĂM w>*Ă