Báo cáo thực tập giáo trình A MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây lúa (Oryza Sativa L) trồng cung cấp nguồn lương thực quan trọng loài người, với 40% dân số giới sử dụng lúa gạo làm thức ăn có ảnh hưởng đến đời sống 65% dân số giới Ở Việt Nam, việc áp dụng thành tựu lúa lai có kết to lớn Năng suất lúa lai so với lúa thường tăng từ 20% trở lên diện tích lúa lai ngày tăng Trước 10 năm, Việt Nam xuất lượng lúa gạo lớn đứng thứ hai giới (FAO, 2006) Sản xuất lúa lai Việt Nam có nhiều công nghệ giống tạo Chọn tạo giống lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá” Bệnh bạc lúa( Xanthomonas oryzae) loại bệnh phổ biến gây tác hại nghiêm trọng hầu hết nước, trung bình giảm 6-60% suất, tăng tỷ lệ hạt lép Ở nước ta bệnh gây hại nghiêm trọng đặc biệt giống lúa lai Vì định hướng phát triển lúa lai nước ta chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc Chính tiến hành nghiên cứu đề tài “ Chọn tạo giống lúa kháng bạc hệ thống lúa lai hai dòng” 1.2 Mục đích - Nghiên cứu bệnh bạc giúp hiểu rõ tác hại bệnh bạc với lúa - Nghiên cứu gen kháng bệnh bạc lúa nhằm mục đích chuyển gen kháng bệnh vào giống lúa phương pháp truyền thống có hỗ trợ công nghệ sinh học - Chuyên gen vào dòng bố, mẹ làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống lúa hệ thống lúa lai hai dòng B NỘI DUNG Báo cáo thực tập giáo trình I.CƠ SỞ LÝ LUẬN VỀ BỆNH BẠC LÁ LÚA (Xanthomonas oryzae Pv.oryzae) I.1 Giới thiệu bệnh bạc lúa Bệnh bạc lúa (Bacterial leaf blight of rice) phát Fukuoka, Nhật Bản vào khoảng năm 1884 – 1885 Sau có báo cáo xuất bệnh nhiều nước khác nhau, đặc biệt Châu Á (Nhật Bản, Trung Quốc, Philippin), Bắc Châu Úc, Mỹ Latin; Trung Mỹ Caribê (1975); Pakistan (1976); … Hiện nay, bệnh gây hại phổ biến hầu trồng lúa giới Ở nước ta, bệnh gây hại từ lâu giống lúa mùa cũ, đặc biệt từ năm 1965 – 1966 tới có năm bệnh phá hại cách nghiêm trọng vùng đồng giống lúa nhập nội có suất cao vụ xuân vụ mùa Theo số liệu thống kê cục Bảo vệ thực vật, từ năm 1999-2003 diện tích lúa bị hại bệnh bạc gây nước 108.691,4 (miền Bắc 86.429,2 ha; miền Nam 22.262,2 ha), diện tích bị hại nặng 156,76 diện tích trắng 80 I.2 Triệu chứng bệnh bạc lúa Năm 1960, Goto rằng: vi khuẩn Xanthomonas oryzae Pv.oryzae gây triệu chứng điển hình bệnh bạc lúa nhiệt đới: bạc lá, héo xanh ( Kresek hay Wilt) vàng nhợt Những nghiên cứu nhà lưới chứng tỏ: tượng héo bạc khác cách rõ ràng độc lập Héo bạc triệu chứng ảnh hưởng ban đầu nhiễm bệnh, triệu chứng vàng nhợt ảnh hưởng sau Theo Lê Lương Tề Việt Nam, bệnh bạc lúa phát sinh phá hại suốt từ thời kỳ mạ đến chín có triệu chứng điển hình thời kỳ lúa ruộng từ sau đẻ - trỗ, chín sữa Báo cáo thực tập giáo trình Trên mạ, triệu chứng thể không đặc trưng lúa, dễ nhầm lẫn với triệu chứng khác Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây triệu chứng mút mép mạ vết dài ngắn khác màu xanh vàng nâu bạc, dễ bị khô Trên lúa, triệu chứng bệnh thể rõ hơn, biến đổi nhiều tuỳ theo giống lúa điều kiện bên nói chung vết bệnh có đặc điểm điển hình sau đây: - Vết bệnh mép lá, mút lan dần vào phiến lan thẳng xuống gân chính, số trường hợp vết bệnh có bắt đầu phiến - Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng thẳng, mô bệnh xanh tái, vàng lục, cuối cháy khô có màu nâu xám - Thông thường ranh giới mô bênh với mô khỏe phiến rõ rệt., có giớ hạn theo đường gợn sóng vàng không vàng, có đường viền màu nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng Có thể vào đặc điểm triệu chứng để phát bệnh Tuy nhiên nhiều vết bệnh cũ biến đổi nhiều theo giống điều bên ngoài, mạ nhầm lẫn với tượng khô đầu sinh lý I.3 Nguyên nhân gây bệnh bạc lúa I.3.1 Nguồn gốc bệnh bạc lúa Báo cáo thực tập giáo trình Khi xuất Nhật Bản, người ta cho bệnh có nguồn gốc sinh lý, đất chua gây nên Đến Takaishi (1908) Boukara (1911) tìm thấy vi khuẩn giọt dịch lây bệnh lại cho nguyên nhân gây bệnh giải đáp Vi khuẩn gây bệnh bạc nhiều tác giả nghiên cứu đặt nhiều tên khác nhau: Pseudomonas oryzae Uyeda et Ishiyama Phytomanas oryzae Magrou Xanthomonas campeitris p.v oryzae Xanthomonas kresek Schure Xanthomonas oryzae (Ishiyama) Dowson Hiện vi khuẩn biết đến với tên Xanthomonas oryzae Pv.oryzae (Ishiyama) I.3.2 Nguyên nhân gây bệnh I.3.2.1 Đ ặc điểm vi khuẩn bạc Vi khuẩn hình gậy hai đầu tròn, có lông roi đầu, kích thước 12 x 0,5-0,9 µm, sống môi trường có khuẩn lạc hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, vi khuẩn nhuộm gram âm, khả khử NO3, dịch hoá gelatin, không tạo NH3, indol, có khả tạo H2S Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng 26 – 30oC, nhiệt độ tối thiểu – 5oC, tối đa 40oC Nhiệt độ gây chết 53oC 10 phút, sống phạm vi pH 5,7 – 8,5, thích hợp pH 6,8 – 7,2 Vi khuẩn xâm nhiễm qua thuỷ khổng, lỗ khí mút đặc biệt qua vết thương xây xát Khi tiếp xúc với bề mặt có màng nước ướt, vi khuẩn dễ Báo cáo thực tập giáo trình dàng di động tiến vào bên lỗ khí, qua vết thương mà sinh sản nhân lên số lượng qua bó mạch dẫn lan rộng Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc phát triển vi khuẩn, mặt bệnh tiết giọt keo vi khuẩn thông qua va chạm lúa nhờ mưa gió mà truyền lan tới lá, khác để tiến hành lây nhiễm lặp lại nhiều đợt sinh trưởng Cho nên loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp, song tùy thuộc vào mưa gió, giông bão xảy vụ mùa mà bệnh truyền lan với phạn vi không gian rộng, giọt keo vi khuẩn với số lượng nhiều, nguyên nhân quan trọng làm bệnh sau đợt mưa gió vào cuối vụ lúa xuân suốt vụ mùa nước ta I.3.2.2 Nguyên nhân gây bệnh Về nguồn bệnh bạc lá, tác giả Nhật Bản cho nguồn bệnh tồn chủ yếu số cỏ dại họ Hoà thảo, nói cách khác số cỏ dại ký chủ phụ vi khuẩn X oryzae Ở nước ta phát thấy vi khuẩn hại lúa ký chủ cỏ dại, tàn dư rơm rạ bệnh, lúa chét, cỏ môi, cỏ lồng vực, cỏ gừng bò,…(Lê Lương Tề, 1980) Mỗi vùng khác có khác thành phần số lượng chủng X.oryzae: Nhật Bản xác định chủng, Philippine xác định chủng, Indonesia xác định chủng, miền Bắc Việt Nam xác định chủng với nhiều Isolates Về nguyên nhân gây bệnh kể đến sô nguyên nhân sau: - Một số giống mẫn cảm với bệnh bạc số giống tạp giao số giống chất lượng Báo cáo thực tập giáo trình - Do thời tiết nóng ẩm, mưa to gió lớn xảy thời kỳ lúa cần quang hợp cao - Do biện pháp canh tác làm đất, lúa nhiễm bệnh vàng sau lập thu, bón thêm phân cấp cứu vàng lá, lúa lớp rễ phát triển non nên gặp mưa dông dễ nhiễm bệnh bạc - Bệnh thường mẫn cảm với lượng đạm dư lá, ruộng bón đạm nhiều, bón muộn, bón lai rai, bón không cân đối giữ đạm, lân kaly, ruộng trũng hẩu dồn đạm cuối vụ, biện pháp thâm canh gieo cấy, chăm bón không kỹ thuật I.3.3 Tác hại bệnh bạc lá: - Giảm diện tích quang hợp - Giảm khối lượng 1000 hạt - Tăng tỷ lệ hạt lép - Giảm 20- 50% suất I.3.4 Con đường xâm nhập Báo cáo thực tập giáo trình Báo cáo thực tập giáo trình I.4 Cơ sở khoa học chọn giống kháng bệnh bạc lúa Theo Viện bảo vệ thực vật cải tiến chế độ canh tác như: sử dụng phân bón hợp lý, đảm bảo thời vụ gieo cấy, chế độ nước tưới hợp lý sử dụng giống chống chịu coi biện pháp có hiệu lực phòng chống bệnh Trong việc sử dụng giống chống chịu coi biện pháp hàng đầu có hiệu để phòng trừ bệnh bạc lúa Bạc lúa xuất tất vùng trồng lúa giới Tuy nhiên hình thức sinh sản đơn giản vi khuẩn bạc chịu ảnh hưởng yếu tố ngoại cảnh dẫn đến cấu trúc di truyền thay đổi, từ tạo nhiều bệnh tồn đồng ruộng Nguyên nhân dẫn đến thay đổi cấu trúc di truyền vi khuẩn là: - Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật không hợp lý, người nông dân thiếu hiểu biết sử dụng loại thuốc với liều lượng lớn liên tục ruộng sản xuất, làm cho vi khuẩn lúc đầu bị tiêu diệt sau chúng trở nên nhờn thuốc hình thành nòi kháng lại loại thuốc - Công tác nhập nội giống trồng thực hậu kiểm dịch không chặt chẽ làm cho vi khuẩn tồn hạt giống di chuyển từ vùng sang vùng khác, tạo đa dạng nòi gây khó khăn khôn lường - Hình thức canh tác đa dạng trồng nhiều giống lúa khác (bao gồm lúa thường lúa lai) vùng rộng lớn trồng lúa tạo môi trường ký chủ phong phú, điều kiện hình thành nên nhiều nòi vi khuẩn Ngoài ra, điều kiện thời tiết thay đổi với diễn biến phức tạp nguyên nhân gây tượng Do vậy, việc chọn giống chống bệnh bạc khó Những năm 80 kỷ XX, Viện nghiên cứu lúa Quốc tế xác định chất di truyền tính chống bệnh gen quy định Điều khẳng định Báo cáo thực tập giáo trình chắn nhờ vào nghiên cứu nhà khoa học kỹ thuật đại Tính kháng trồng khả làm giảm sinh trưởng phát triển ký sinh sau có tiếp xúc ký sinh với ký chủ khởi phát Trong tính kháng trồng có tính kháng dọc (kháng chuyên nòi) đơn gen kiểm soát tính kháng ngang (kháng nhiều nòi) đa gen định Giải thích chế kháng, Flor (1956) đưa thuyết “gen đối gen”: gen quy định tính kháng ký chủ có gen đặc thù quy định tính gây bệnh ký sinh, trước hay sau thắng gen ký chủ trồng tiếp tục tiến hoá Khi nghiên cứu bệnh bạc người ta nhận thấy tượng ban đầu giống biểu tính kháng tốt vùng trồng sau vài năm giống lại trở nên nhiễm bệnh - người ta gọi phá vỡ tính kháng (breakdown of resistance) giống mà nguyên nhân xuất chủng vi khuẩn có độc tính cao Để kiểm soát phá vỡ tính kháng, vài chiến lược chọn tạo giống đề xuất ví dụ đề xuất Ezuka Sakaguchi (1978) sau: - Sử dụng giống chứa gen có tính kháng ngang - Tổ hợp tính kháng ngang từ tính kháng dọc cách: Sử dụng giống nhiều dòng (multiline) bao gồm hỗn hợp dòng đẳng gen, dòng có gen kháng dọc khác đồng thời gian sinh trưởng, hình thái thuộc tính khác; sử dụng luân chuyển giống có gen kháng dọc khác Sự luân chuyển diễn theo không gian hay theo thời gian; tập hợp lượng đủ lớn gen kháng dọc giống đơn Thực chiến lược này, nhà chọn giống cần có thông tin xác nguồn bệnh thông tin di truyền tính kháng vật liệu tạo giống Báo cáo thực tập giáo trình I.5 Chuyển gen kháng bệnh bạc I.5.1 Nghiên cứu gen kháng bệnh bạc Cho đến tháng 6/2005 nhà khoa học tìm 30 gen kháng bệnh bạc Các gen kháng ký hiệu Xa1, Xa2, … Tính kháng bệnh quy định gen đơn trội: Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, ; gen đơn lặn xa5, xa8, xa13, xa26, xa28, …; hai gen kết hợp với Xa1/Xa4, Xa4/Xa7, Hiện nghiên cứu sử dụng tới 10 dòng đẳng gen (dòng thị) là: IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBB10, IRBB11, IRBB14, IRBB21 chứa gen đơn chống bệnh Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa1, Xa11, Xa14, Xa21 [12].Các gen kháng nằm nhiễm sắc thể (NST) khác nhau: gen Xa1, Xa2, Xa12 nằm NST số 4, gen lặn xa5 nằm NST số 5, gen Xa7 nằm NST số 6, gen Xa15 nằm NST số 8, gen Xa9 nằm NST số 10 gen Xa10, Xa21,Xa23, Xa3, Xa4 nằm NST số 11 R-gene Donor Chrom R-gene Donor Chro m Xa1 Kogyoku Xa16 Te-tep - Xa2 Tetep Xa17 Asominori - 11 Xa18 IR24, Toynishiki - Xa3 Wase Aikoku Xa4 TKM6 11 xa19 XM5 - Xa5 DZ192 xa20 XM6 - Xa7 DV85 Xa21 O longistaminata 11 Xa8 PI231129 Xa22(t) Zhachanglong - Xa10 CAS 209 11 Xa23 Oryza rufipogon - Xa11 IR8 - xa24(t) DV86 - Xa12 Kogyoku xa25 Nep Bha Bong To - Xa13 BJ1 Xa26 Arai Raj - Xa14 TN1 - xa27 Lota Sail - Xa15 XM41 - Xa? Oryza minuta - 10 Báo cáo thực tập giáo trình BamHI BamHI NLS AD kb WT PXO1865(r3) & PXO0314(r9b) MT PXO2684(r9c) E nt GAA TTC GAA GCC CGC TAC GGA aa E F E A R Y E nt GAA TC GAA GCC CGC GGA C GG aa E E AT R L G Nhờ sử dụng thị phân tử mà chủng đột biến làm hiệu lực gen kháng dễ dàng phát Như biến đổi chủng gây bệnh phân tích rõ rang, xác nhờ thị phân tử để từ có biện pháp ứng phó kịp thời *Dùng phản ứng RFLP để xác định đồ gen Xa3, Xa4 24 Báo cáo thực tập giáo trình 25 Báo cáo thực tập giáo trình III.PHƯƠNG PHÁP LÂY NHIỄM VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG Đánh giá vật liệu chọn giống khâu quan trọng thiếu công tác chọn giống Việc đánh giá vật liệu chọn giống cần khách quan, khoa học, xác nhằm phát ưu, khuyết điểm vật liệu chọn giống Phương pháp đánh giá khoa học, xác khách quan công tác chọn giống nhanh chóng thu kết nhiêu Sau chuyển gen kháng vào dòng bố mẹ triển vọng (vật liệu chọn giống) tiến hành đánh giá tính kháng bạc dòng III.1 Phương pháp phân lập nuôi cấy bảo quản vi khuẩn III.1.1 Phương pháp phân lập đơn khuẩn lạc Bước 1: chọn mẫu có triệu chứng bệnh tươi Bước 2: cắt mẫu bệnh bạc thành 4-5 mẫu nhỏ khoảng 2-5cm, chọn đoạn tiếp giáp mô bệnh mô khỏe đoạn chứa nhiều vi khuẩn Bước 3: khử trùng mẫu bệnh cồn 700 tròng vòng 10 giây, sau chuyển sang khử trùng nước Javen 3% Bước 4: Rửa mẫu nhiễm bệnh3 lần nước vô trùng Bước 5: chế tạo dùng dịch mẹ nghiền giã nhỏ mẫu bệnh cối chày sứ bổ sung 1ml nước cất vô trùng vào, sau lấy 100ml vi khuẩn vào ống nghiệm có 9ml nước cất vô trùng để thu dung dịch vi khuẩn pha loãng lần Sau lây 1ml vi khuẩn pha loãng lần vào ống nghiệm 9ml nước cất vô trùng ta dung dịch vi khuẩn pha loãng lần Tiếp tục lấy 1ml dungg dịch vi khuẩn lần cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng ta thu dung dịch pha loãng lần Bước 6: Cấy vi khuẩn : Lấy vòng que cấy dung dịch bệnh ống nghiệm, cấy sang đĩa Petri có môi trường Wakimoto Dùng que cấy dàn khắp mặt đĩa Đặt đĩa Petri có vi khuẩn vào tủ định ôn nuôi cấy nhệt độ 280C, theo dõi phát triển vi khuẩn sau 24-36-48-60 26 Báo cáo thực tập giáo trình Bước 7: Tách đơn khuẩn lạc: Theo dõi vi khuẩn 24h-72h thấy khuẩn lạc mọc dùng que cấy tách cẩn thận khuẩn lạcos dạng tròn nhỏ, bề mặt ướt cong có màu nhạt sang đĩa Petri có môi trường Wakimoto Cấy 6-8 khuẩn lạc đĩa theo đường zic zac đem nuôi cấy nhiệt độ 280C III.1.2 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Môi trường nuôi cấy môi rường Wakimoto Thành phần môi trường nuôi cấy Khoai tây : 300g Đường saccarosa: 15g Pepton : 5g NaHPO4.12H2O 2g Ca(NO3)24H2O 0.5g Agar 17g Nước cất 1000ml pH 6.8-7 cáh nấu : Khoai tây gọt vỏ cắt lát mỏng , cho nước cất vào đun sôi 30 phút, lọc lấy nước lớp vải cho thêm hóa chất cần thiết đường, muối, Agar,Pepton vào cho thêm nuocs cất cho đủ lít dùng que khuấy Đun sôi lò vi sóng cho môi trường thật sau tùy theo ý định mà làm: - đổ môi trường sang ống nghiệm ( ống 9-10ml) đậy nút đem hấp khử trùng 1210C 20 phút, sau đem tạo thạch nghiêng - đổ môi trường sang đĩa Petri: Môi trường sáu nấu chín từ lò vi sóng đổ sang bình tam giác, đậy kín giấy bạc đem khử trùng 121 0C 20 phút Đĩa Petri sấy tủ sấy 1610C vòng 180 phút Đổ môi trường vào đĩa, sau bật tia UV đợi môi trường nguội đem cất vào tủ lạnh 27 Báo cáo thực tập giáo trình III.1.3 Bảo quản vi khuẩn *Bảo quản môi trường sữa Skim- milk: - Thành phần : Skim-milk: 10g; mì 1.5g; nước cất 100ml, dùng máy khuấy dùng xilanh chia môi trường vào ống nghiệm nhỏ ( 1ml/ ống), sau hấp 1210C 20 phút - Tiến hành : lấy 1-2 vòng que cấy vi khuẩn nuôi cấy môi trường vòng 48 ống nghiệm chứa môi trường, dùng máy khuấy Votrex khuấy sau bảo quản tủ lạnh sâu (-300C) * Bảo quản môi trường Paraphin Lấy vi khuẩn cấy môi trường thạch nghiêng ngắn , nuôi tủ định ôn bảo quản nhệt độ phòng sấy nhiệt độ 1600C III.2 Phương pháp lây nhiễm: * Chế tạo dung dịch vi khuẩn gây bệnh: vi khuẩn bảo quản -300C tiến hành nuôi cấy môi trường Wakimoto 280C 72 Lấy vòng que cấy vi khuẩn pha vào 10ml nước cất vô trùng để tạo thành dung dịch vi khuẩn có mật độ 108 CFU/ml * Phương pháp lây nhiễm nhân tạo - Các bước tiến hành: + Trước xác định bệnh tiến hành lây thử lên dòng mẫn cảm R24 để thử độc tính vi khuẩn sau bảo quản Các nguòn bệnh (Isolates) thu thập từ vùng sinh thái khác nhau, vùng sinh thái chia tiểu sinh thái, tiểu sinh thái lấy giống nhiễm + Tạo dung dịch lây nhiễm: Sau 48h vi khuẩn nuôi cấy môi trường Wakimoto mọc Khi ta lấy vòng vi khuẩn (các khuẩn lạc có hình dạng tròn, nhẵn bóng, lồi lên, kích thước – mm, màu vàng chanh, đặc trưng khuẩn lạc vi khuẩn Xanthomonnas oryzae) hòa với 10 ml nước tạo dung dịch có nồng độ vi khuẩn từ 108- 109/ ml nước Đem dung dịch lây nhiễm 28 Báo cáo thực tập giáo trình + Tiến hành trình lây nhiễm dòng đính đánh giá khả kháng bạc Quá trình lây nhiễm tiến hành trước trỗ 18 ngày, lúa xuất đòng ● Dụng cụ lây nhiễm: * Các chủng vi khuẩn tạo Hiện vùng đồng Bắc Bộ sử dụng chủ yếu chủng vi khuẩn có độc tính cao viện nghiên cứu lúa tạo ra, là: Race 5( chủng màu đỏ), Race 12( chủng màu hồng), Race 15( chủng màu xanh) * Kéo hấp khử trùng đựng hộp kín * Cồn khử trùng * Dây buộc với màu khác Thông thường sử dụng màu, là: màu xanh, màu hồng, màu đỏ ● Tiến hành buộc dây, đánh dấu các định lây nhiễm vi khuẩn * Chúng ta phải tiến hành buộc dây trước lây nhiễm * Mỗi dòng buộc dây 10 khóm đê lây nhiễm Chọn khóm có nhiều nhánh để tiến hành lây nhiễm * Trong khóm, tuỳ số lượng chủng vi khuẩn định lây nhiễm mà chia nhóm thành phần nhau, sau buộc dây để đánh dấu, phần buộc dây màu khác nhau, màu dây tương ứng với chủng vi khuẩn Ví dụ sử dụng chủng vi khuẩn Race 5, Race 12, Race 15 chia khóm thành phần buộc loại dây xanh( Race 15) , đỏ( Race 5), hồng( Race 12) Nếu khóm lúa có 10 nhánh chia 3:3:4 để buộc dây Trong trình buộc dây, đảm bảo nhóm màu phải có tối thiểu khóm không sâu bệnh, không gẫy để tiến hành lây nhiễm ● Thao tác lây nhiễm * Bước 1: Khử trùng tay cồn * Bước 2: Lấy kéo lọ đựng vi khuẩn Một kéo nhúng vào lọ vi khuẩn, muốn nhúng sang lọ khác phải thay keo khác * Bước 3: Lắc mạnh ống vi khuẩn trước mở lắp để lây, tay thuận cầm kéo, tay trái cầm ống nghiệm Nhúng đầu kéo vào dung dịch vi khuẩn, rút kéo, giữ cho kéo nằm ngang để dung dịch vi khuẩn không rơi xuống, mở kéo, cắt phần chóp lúa( 2-5cm) Nhúng lại kéo vào dung dịch vi khuẩn sau cắt 23 ●1 số ý tiến hành lây nhiễm nhân tạo là: * Không làm đổ vi khuẩn ruộng, không bỏ sót lá, không cắt nhầm buộc dây màu khác 29 Báo cáo thực tập giáo trình * dung dịch ¼ ống đổi lấy ống vi khuẩn khác loại Nếu đổi cắt sang ống màu khác cần khử trùng lại tay trước, dùng kéo khác để lây nhiễm * Nếu phát cắt nhầm sang nhóm màu khác, huỷ bỏ vừa cắt Tùy vào điều kiện thời tiết mà dòng sinh trưởng nhanh hay chậm khác mà tiến hành lây nhiễm đợt hay nhiều đợt khác Nếu điều kiện thời tiết ban đầu không thuận lợi số dòng sinh trưởng, phát triển chậm, không đủ số nhánh số để lây nhiễm đợt tiến hành lây nhiễm bệnh đợt Hoặc sau 10-12 ngày quan sát không thấy vi khuẩn ăn vào phải tiến hành lây nhiễm lại III,2 Đánh giá bạc *Hệ thống đánh giá nhân dòng nhà lưới đồng ruộng Greenhouse test Chiều dài Miêu tả nhiễm (cm) 0-5 R Field test (Breeding lines) Điểm % DLA Miêu tả 1-5 R >5-10 MR 6-12 MR >10-15 MS 13-25 MS >15-20 S 26-50 S >20 HS >50 HS *Đo vết bệnh: Sau 18 ngày lây nhiễm, tiến hành đo chiều dài vết bệnh( từ vị trí cắt đến hết vết cháy lá) theo phương pháp GS Satoru Taura ( Nhật Bản) đề xuất xác định mức độ kháng dòng giống theo bảng sau: Chiều dài vết bệnh(cm) 18 Kháng- Resistant ( R) Kháng vừa- Moderately resistant (MR) Nhiễm- Susceptible (S) Nhiễm cao- High susceptible + Sau đánh giá mức độ kháng dòng giống, tiến hành so sánh dòng tham gia thí nghiệm, so sánh với dòng đối chứng Từ rút dòng có triển vọng để tham gia qua trình chọn giống Ở sử dụng dòng đối chứng: ● Dòng đối chứng chuẩn nhiễm: Thường dòng IR24, dòng lúa viện nghiên cứu lúa không chứa gen kháng bạc ● Dòng đối chứng chuẩn kháng: Tuỳ theo chủng vi khuẩn mà có dòng đối chứng chuẩn khác Có dòng đối chứng chuẩn kháng IRBB21, IRBB5, IRBB7 Trong IRBB21 sử dụng chủ yếu nhất, dòng IR24 chuyển gen kháng bạc Xa-21 Như qua phương pháp lây nhiễm nhân tạo đánh giá tính kháng bạc vật liệu chọn giống, chủ yếu dòng bố R Từ có vật liệu chọn giống tốt, có tính kháng bạc cao, phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa có tính kháng bạc có suất Đây hướng chọn tạo giống lúa miền Bắc nước ta 31 Báo cáo thực tập giáo trình Một số kết đánh giá tính kháng bạc viện nghiên cứu lúa trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội STT Dòng lúa Xa-gen 312.HAU070686 331.HAU0706913 339.HAU0706921 IR24 None 24.1 18.3 17.2 IRBB1/4 Xa1/4 13.0 18.0 15.8 IRBB1/5 Xa1/5 1.8 2.3 1.9 IRBB1/7 Xa1/7 0.9 1.5 1.1 IRBB1/10 Xa1/10 18.4 17.4 16.9 IRBB1/11 Xa1/11 23.2 18.7 19.9 IRBB3/7 Xa3/7 0.5 1.4 2.1 IRBB3/10 Xa3/10 13.2 14.5 13.9 IRBB4/5 Xa4/5 2.9 2.6 2.7 10 IRBB4/7 Xa4/7 3.5 2.7 11 IRBB4/10 Xa4/10 15.5 15.5 19.1 12 IRBB4/11 Xa4/11 17.7 18.8 21.5 13 IRBB5/7 Xa5/7 0.2 0 14 IRBB5/10 Xa5/10 2.1 2.2 2.8 15 IRBB5/11 Xa5/11 1.7 2.7 1.9 16 IRBB7/10 Xa7/10 0.5 5.5 1.2 17 IRBB4/5/13 Xa4/5/13 0.8 0,3 1.0 18 IRBB4/5/13/21 Xa4/5/13/21 1.3 1.3 1.2 32 Báo cáo thực tập giáo trình Chiều dài vết bệnh trung bình 17 dòng lúa đa gen Xa với race5 vi khuẩn X oryzae STT Dòng lúa Xa-gen 312.HAU07068-6 331.HAU0706913 339.HAU0706921 IR24 None S S S IRBB1/4 Xa1/4 S S S IRBB1/5 Xa1/5 R R R IRBB1/7 Xa1/7 R R R IRBB1/10 Xa1/10 S S S IRBB1/11 Xa1/11 S S S IRBB3/7 Xa3/7 R R R IRBB3/10 Xa3/10 S S S IRBB4/5 Xa4/5 R R R 10 IRBB4/7 Xa4/7 R R R 11 IRBB4/10 Xa4/10 S S S 12 IRBB4/11 Xa4/11 S S S 13 IRBB5/7 Xa5/7 R R R 14 IRBB5/10 Xa5/10 R R R 15 IRBB5/11 Xa5/11 R R R 16 IRBB7/10 Xa7/10 R R R 17 IRBB4/5/13 Xa4/5/13 R R R 18 IRBB4/5/13/21 Xa4/5/13/21 R R R 33 Báo cáo thực tập giáo trình Phản ứng 17 dòng lúa đa gen Xa với race vi khuẩn X.oryzae ( nguồn : Nguyễn Văn Thạch –BVTV49C) C KẾT LUẬN Bằng việc sử dụng dòng đẳng gen thành công chuyển gen Xa kháng BB vào dòng TGMS 103S, 135S sở cho việc tạo giống lúa lai hai dòng kháng bạc Hiện Xa dần tính kháng việc nghiên cứu, sử dụng gen kháng khác việc làm tất yếu.Ở Việt Nam sử dụng Xa21 có khả kháng cao với đa dạng chủng bạc Đồng thời cần kết hợp nhiều gen kháng với để tăng hiệu tính bền vứng gen kháng Ứng dụng công nghệ sinh học công tác chọn tạo giống rút ngắn thời gian nghiên cứu làm tăng độ xác kết nghiên cứu Nếu trước chưa có CNSH, đánh giá qua kiểu hình vừa thời công sức không xác nhờ công nghệ sinh học mà muốn chuyển gen kháng nhanh cách làm truyền thống 2-3 năm Việt Nam đạt thành tựu bật chiến chống lại BB với giống VL24, VL50,… Và có nhiều giống khác đời vừa có suất cao, chất lượng tốt có khả kháng bệnh cao Ngoài lúa lai việc chuyển gen kháng bạc vào lúa quan tâm Giống lúa chuyển gen kháng bạc lá: BắcThơm7, tạo giống lúa Bắc Thơm.BB có chất lượng không Bắc Thơm lại có khả kháng bạc 34 Báo cáo thực tập giáo trình D KIẾN NGHỊ - Tổ chức nhân bảo quản dòng NILs - Tổ chức lai quy tụ kết hợp gen kháng, tăng sức kháng với BB - Tổ chức nghiên cứu tìm kiếm gen kháng loài lúa dại - Thường xuyên kiểm tra biến đổi cấu trúc chủng vi khuẩn - Thường xuyên kiểm tra hiệu lực kháng gen kháng 35 Báo cáo thực tập giáo trình Tài liệu tham khảo: Giáo trình Chọn giống trồng – NXB Giáo dục năm2000, PGS.TS Nguyễn Văn Hiển Giáo trình Chọn giống trồng – NXB Nông Nghiệp Hà Nội-2005, PGS.TS.Nguyễn Đình Hoà, PGS.TS Nguyễn Văn Hoan, PGS.TSVũ Văn Liết TARC Report – Reaction of rice cultivars resistant to Japanese and Phillippine races of Xanthomonas campertris pv Oryzae Kosabi DD: the estimation of map distance from recombination values Ann Eugenet 12: 172-175 (1944) Nelson RJ, Baraoidan MR,vera Cuz CM, Yap IV, linker map of rice (1993) Report of Deverlopment of new thermo-sensitive genetic male sterility line with bacterial blight resistance by mocular maker-assisted selection, Nguyễn Văn Hoan, Vũ thị Thu Hiền web: scientist crop.com Googgle.com with keyword: “bacterial blight resistance” and “ maker of rice” Giáo trình bệnh cây-NXB nông nghiệp Huang, N , Angeles.E R, Domingo,J,Magpantay, G.,Singh, S.,Zhang,G., Kumaravadivel,N.,Benett.J., Khush, G.S (1997) Pyramiding of bacterial 36 Báo cáo thực tập giáo trình blight resistant and Bamatis quanlity characteristics by phenoltypic and molercular maker-assisted selection in rice Nhóm sinh viên thực : Nguyễn Việt Cường Tạ Thị Mai Hiên Đỗ Trung Hiếu Nguyễn Thị Mai Trần Thị Nguyệt Nguyễn Hữu Tấn Ngô Thị Thảo Trần Thị Thêu 37 Báo cáo thực tập giáo trình 38