TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề: Nhân sâm Panax ginseng C ngàn năm Meyer dược liệu sử dụng từ hàng hững tác dụng y học hân Sâm, dùng y học cổ truyền, chứng minh theo nguyên lý y học đại hân Sâm từ thuốc huyền thoại phương Đông xuất rộng rãi phương Tây, với sản phẩm thương mại đa dạng hân Sâm ngày thuốc mang lại giá trị kinh tế to lớn Việt am tự hào có loài hân Sâm đặc hữu Sâm gọc inh (hay gọi Sâm hu ăm) Panax vietnamensis a & Grutzv., biết đến giới với tên gọi Vietnamese ginseng Sâm gọc inh có thành phần ginsenosid, dược chất hân sâm, đánh giá vào loại nhiều so với loài khác chi Panax giới Tuy nhiên, Sâm gọc inh phát muộn (vào năm 1985) cho nên, có nhiều cố gắng để phát triển thuốc quý giá tiềm Sâm gọc inh chưa hoàn toàn đánh thức Cộng với địa bàn phân bố hẹp (chỉ có vùng núi gọc inh), lại bị khai thác bừa bãi, nên Sâm gọc inh sớm đứng trước nguy tuyệt chủng Với nỗ lực địa phương có Sâm gọc inh phân bố, loài dược liệu tránh bị tuyệt diệt hưng để đưa Sâm gọc inh thành thuốc ngang hàng với loại hân sâm có thị trường dược liệu số lượng chất lượng, cần có nhiều nghiên cứu chuyên sâu ứng dụng sản xuất hiệu Trên giới, hân Sâm Panax ginseng C Meyer nhân giống sản xuất dược chất ginsenosid thành công nuôi cấy mô Ginsenosid chiết từ mô sẹo nuôi cấy mô hân sâm có dạng với ginsenosid thu từ rễ hân Sâm tự nhiên, tác dụng dược lý dịch chiết rượu methanol bột ginsenosid từ mô sẹo giống với dịch chiết bột thu từ rễ hân Sâm tự nhiên Do có hệ thống nuôi cấy lớn bioreactor dùng để sản xuất ginsenosid theo quy mô công nghiệp, cung cấp cho thị trường tiêu thụ ngày rộng lớn, khắc phục hạn chế canh tác Nhân Sâm như: thời gian trồng kéo dài, bị giới hạn khí hậu, thổ nhưỡng, nhiều sâu bệnh SVT : G YỄ T Ị T TỐT G IỆP Sâm gọc GV D: BÙI VĂ T Ế VI inh giới biết đến với tên gọi Vietnamese ginseng nhiều nhà khoa học quốc tế lưu ý nghiên cứu Việt am cần tự nghiên cứu sản xuất, cố gắng đánh thức giá trị y học giá trị kinh tế Sâm gọc inh Trong hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô thật đưa nông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, muốn nghiên cứu đưa Sâm gọc inh phát triển theo hướng đại, mang lại hiệu kinh tế cao bỏ qua kỹ thuật Thực tế, Sâm mô sẹo gọc inh nhân giống thành công từ hưng tiến bước để sản xuất ginsenosid Sâm gọc inh nuôi cấy mô chưa có nghiên cứu công bố Với mong muốn tìm hiểu loại trồng có giá trị kinh tế với công nghệ nuôi cấy tế bào thực nhằm mục đích nhân giống sản xuất hợp chất có giá trị kinh tế, thực khóa luận tốt nghiệp: “Công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm gọc Linh (Panax vietnamensis a et Grushv.) hướng dẫn thầy Bùi Văn Thế Vinh 1.2 Mục đích đề tài: - Tổng quan Sâm gọc Linh - Tìm hiểu số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm gọc Linh SVT : G YỄ T Ị T TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI CHƯƠNG II TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả phương pháp nuôi cấy phận thực vật ( tế bào đơn, mô, quan ) điều kiện vô trùng  Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa hai nguyên tắc: - Dựa vào tính toàn tế bào: Mỗi tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Mỗi tế bào hệ thống mở, tự trì tự sản xuất để tiến hành chức chuyên biệt sản sinh hệ tế bào cần thiết - Dựa vào khả biệt hóa phản biệt hóa tế bào: Biệt hóa biến đổi tế bào từ trạng thái tế bào phôi thể chức Các tế bào dùng môi trường cấy có khả biệt hóa cấu trúc chức Trong điều kiện thích hợp, làm cho tế bào trở lại trạng thái tế bào sinh chúng - tế bào phôi trình gọi trình phản biệt hóa Vì tế bào gần với trạng thái tế bào phôi khả nuôi cấy thành công cao nhiêu  ngh a: - Nhân nhanh giống trồng - Bảo quản nguồn gen - Tạo bệnh - Sản xuất hoạt chất sinh học - Mang tính công nghiệp  c ch SVT : G YỄ T Ị T hát tri n: TỐT G IỆP - 5: obert GV D: BÙI VĂ T Ế VI ooke quan sát tế bào sống kính hiển vi đưa khái niệm tế bào - 1838: Matthias Schleiden Theodore Sch ann đề xướng học thuyết tế bào - 1904: Hannig nuôi cấy phôi loài họ cải - 19 - 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng hoá chất điều hoà sinh trưởng phát : ogl xác định vai trò I sinh quan - 195 : Morel Martin thực vi ghép invitro thành công - 19 - 19 : Guha Mahesh ari lần thành công tạo đơn : Murashige Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật bội từ nuôi cấy bao phấn cà rốt - 19 9: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) Hapopappus gracilis - 197 : Phát Cytokinin có khả phá ngủ Gerberas - 1978: Marton cộng xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần - 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần sản xuất chất trao đổi thứ cấp quy mô công nghiệp nuôi cấy tế bào dịch lỏng ithospermum spp Mitsui 0Petrochemicals - 1988: lein cộng tái sinh chuyển gen phương pháp bắn gen - 199 : Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen lavrSavr 2.1.2 Các kỹ thuật nuôi cấy 2.1.2.1 Nuôi cấy hôi Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng tự dưỡng giai đoạn dị dưỡng cần có chất điều hòa sinh trưởng để phát triển Trong nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò quan trọng, đường sucrose cho nhiều kết tốt goài số chất tự nhiên nước dừa, dịch chiết malt, casein thủy phân chất cần nuôi cấy phôi Đối với chất điều hòa sinh trưởng, auxin thường dùng nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho phát triển phôi hiệt độ, ánh sáng ảnh hưởng đến phát triển phôi, thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp phôi phát triển tự nhiên SVT : G YỄ T Ị T hiệt độ ± o C TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI thích hợp cho sinh trưởng nảy mầm phôi Các phôi thứ cấp khó sinh trưởng hoạt động chúng tách rời nuôi điều kiện chiếu sáng 000 lux chiếu sáng suốt ngày nuôi  ỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu như: - hân giống trồng - Thử sức sống phôi hạt - Duy trì phôi yếu cứu phôi lai xa - Sản xuất hạt nhân tạo mà chất tế bào phôi 2.1.2.2 Nuôi cấy mô c uan tách r i Trong nuôi cấy mô quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt, mẫu phải tình trạng sinh lý tốt phát triển hu cầu dinh dưỡng nuôi cấy phận khác khác có số yêu cầu chung nguồn carbon, nguồn đường, nguyên tố đa lượng, vi lượng chất điều hòa sinh trưởng Muốn trì sinh trưởng phát triển quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường Đối với nuôi cấy mô cần bổ sung thêm chất hữu chứa nitơ dạng acide amine, đường inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng mô tách rời khả tổng hợp chất  uôi cấy mô quan tách rời ứng dụng trong: - ghiên cứu điều kiện sinh trưởng phận mô - Nhân invitro - Tạo mô sẹo phục vụ cho nghiên cứu chọn dòng tế bào, đột biến soma, 2.1.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh SVT : G YỄ T Ị T TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI Đặc điểm mô phân sinh chứa tế bào non trẻ, phân chia mạnh, không bị virus xâm nhập, mô phân sinh mô virus Mô phân sinh thường mô đỉnh chồi cành Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ mầm non, chồi hình thành cành non Trong nuôi cấy cân chất điều hòa sinh trưởng quan trọng Muốn tạo chồi cần bổ sung cytokinin tổ hợp cytokinin với auxin, muốn tạo rễ bổ sung auxin  uôi cấy mô phân sinh sử dụng trong: - Tạo virus - hân giống invitro - Tạo đa bội qua xử lý colchicin ghiên cứu trình hình thành quan 2.1.2.4 Nuôi cấy bao hấn hạt hấn Ưu điểm nuôi cấy bao phấn đơn giản thao tác kỹ thuật môi trường nuôi cấy, tạo lưỡng bội từ soma thành bao phấn, khó phân biệt với tự lưỡng bội từ đơn bội ạt phấn nuôi cấy phát triển thành đơn bội hoàn chỉnh điều kiện nuôi cấy invitro đường tạo phôi trực tiếp gián tiếp thông qua tạo mô sẹo tạo quan Phương pháp tạo đơn bội kép phương pháp chọn lọc tạo giống có hiệu chọn lọc cao, đặc biệt kết hợp với phương pháp tạo biến dị di truyền khác lai hữu tính gây đột biến nhân tạo Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen tuổi bao phấn điều kiện mà cho bao phấn sinh trưởng Quá trình sinh trưởng sau phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung muối khoáng vào môi trường Tần số phát sinh đơn bội sinh trưởng nói chung tốt chúng nuôi điều kiện chiếu sáng, hạt phấn số kiểu gen sinh trưởng hai điều kiện có chiếu sáng tối  uôi cấy bao phấn hạt phấn dùng cho tạo dòng để: SVT : G YỄ T Ị T TỐT G IỆP - GV D: BÙI VĂ T Ế VI ghiên cứu gen lặn chúng không biểu thể dị hợp tử Chọn dòng đột biến 2.1.2.5 Nuôi cấy tế bào đ n Tế bào đơn nhận đường nghiền mô, xử lý enzyme Sau chúng nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy lắc tạo điều kiện thuận lợi cho trao đổi khí tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng Tế bào đơn lọc nuôi cấy môi trường đặc biệt tăng sinh khối Mỗi loại cây, loại tế bào khác đòi hỏi kỹ thuật nuôi cấy khác Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn phức tạp, chúng bị nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng tách rời khỏi quần thể tế bào  uôi cấy tế bào đơn sử dụng cho mục đích: - Chọn dòng tế bào - Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển phân hóa tế bào điều kiện khác - Thu nhận chất trao đổi thứ cấp 2.1.2.6 Nuôi cấy roto a t Tế bào trần tế bào tách bỏ thành tế bào phương pháp học hay sử dụng enzyme Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast tái sinh thành tế bào mới, phân chia tái sinh thành hoàn chỉnh Ưu kỹ thuật tách nuôi cấy tế bào trần tế bào màng cứng, trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu đơn vị thể tích môi trường cao (đạt 106 tế bào/1ml môi trường)  Ứng dụng nuôi cấy protopast: - Tạo lai soma - Chuyển bào quan chuyển gen Quá trình dung hợp protoplast thực hai đối tượng loài hay khác loài - Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào 2.1.3 Môi tr ng nuôi cấy SVT : G YỄ T Ị T TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI  Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần sau: - Muối khoáng đa lượng - Muối khoáng vi lượng - Vitamin - guồn carbon - Chất điều hòa sinh trưởng - Ngoài bổ sung thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men, ) agar  Môi trường nuôi cấy chia thành ba loại: - Môi trường ngh o dinh dưỡng: White, Knop - Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg - Môi trường giàu dinh dưỡng: MS Cơ sở cho việc xây dựng môi trường nuôi cấy xem xét thành phần cần cho sinh trưởng phát triển Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào mô thực vật thay đổi tùy theo loài phận nuôi cấy Đối với mẫu cấy tùy theo mục đích thí nghiệm thành phần môi trường thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa mẫu cấy Tế bào mô thực vật đòi hỏi p tối ưu cho sinh trưởng phát triển nuôi cấy Độ p môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới trình thu nhận chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì cần điều chỉnh độ p trường thích hợp trước nuôi cấy Thường sử dụng aO chỉnh độ p 2.1.4 Các chất điều hòa inh tr ởng thực vật SVT : G YỄ T Ị T hay môi Cl loãng để điều TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI 2.1.4.1 Auxin uxin nhóm chất điều hòa sinh trưởng sử dụng rộng rãi nuôi cấy mô thực vật I auxin tự nhiên có mô thực vật, , IB , , -D auxin nhân tạo, thường auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh Chúng có mặt phận mô phân sinh đỉnh, phận non khác  Sự áp dụng loại nồng độ auxin môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: - iểu tăng trưởng phát triển cần nghiên cứu - àm lượng auxin nội sinh mẫu cấy - tổng hợp auxin tự nhiên mẫu cấy - Sự tác động qua lại auxin ngoại sinh auxin nội sinh - Đặc tính auxin  Vai trò chất thuộc nhóm auxin: - ích thích phân chia kéo dài tế bào Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ức chế sinh trưởng chồi bên ích thích phân hoá mô dẫn Ảnh hưởng khác rụng lá, quả, đậu quả, phát triển chín quả, hoa mối quan hệ với điều kiện môi trường - Tạo nhân nhanh mô sẹo (callus) ích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) Tạo phôi soma ( , -D) 2.1.4.2 Cytokinin Các cytokinin dẫn xuất adenine Các cytokinin sử dụng thường xuyên B P, Zeatin 2-iP cytokinin tự nhiên, B kinetin cytokinin nhân tạo Chúng hòa tan aO Cl loãng Tỷ lệ auxin/cytokinin quan trọng phát sinh hình thái hệ thống nuôi cấy Đối với phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus rễ cần có tỷ lệ auxin/ cytokinin cao, trường hợp ngược lại dẫn đến sinh sản chồi chồi nách Cytokinin có mặt mô phân sinh đỉnh rễ, non  Chức chủ yếu cytokinin: SVT : G YỄ T Ị T TỐT G IỆP ích thích phân chia tế bào - GV D: BÙI VĂ T Ế VI Tạo nhân callus - ích thích phát sinh chồi nuôi cấy mô - ích thích phát sinh chồi nách kìm hãm ảnh hưởng ưu chồi đỉnh - àm tăng diện tích phiến kích thích lớn lên tế bào - Có thể làm tăng mở khí khổng số loài - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Ức chế hình thành rễ - Ức chế kéo dài chồi - Ức chế trình già (hoá vàng rụng) lá, kích thích tạo diệp lục 2.1.4.3 Gibberellin Trong số chất thuộc nhóm gibberellin, G nhiều thực tiễn G tính G chất sử dụng kích thích kéo dài chồi nảy mầm phôi vô có tính hoà tan nước Gibberellin tạo đỉnh rễ, chồi, non, hạt  Gibberellin có chức sau: - ích thích kéo dài chồi tăng cường phân bào kéo dài tế bào - Phá ngủ hạt giống củ giống - iểm soát hoa - Ức chế hình thành rễ bất định - năm tuổi ích thích sinh tổng hợp α-amylase hạt ngũ cốc nảy mầm Các chất ức chế tổng hợp kích thích trình tạo củ (thân củ, thân hành củ) - ích thích nảy mầm phấn hoa sinh trưởng ống phấn - Có thể gây tạo không hạt làm tăng kích thước nho không hạt - Có thể làm chậm hoá già có múi 2.1.4.4 Abscisic acid (ABA) bscisic acid chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên tạo trực tiếp từ acid mevalonic phân giải carotenoid Chúng tạo lá, quả, mũ rễ, hạt  Các tác dụng B là: SVT : G YỄ T Ị T 10 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI  Kết uả: Sâm gọc inh xử lý gCl2 với nồng độ % thời gian 20 phút tỷ lệ nhiễm thấp ( 0%) tỷ lệ nhiễm không cao (80%) Còn xử lý Ca(OCl)2 với nồng độ 10%, thời gian phút tỷ lệ nhiễm thấp (10 %) tỷ lệ không nhiễm cao (90%) (Bảng 1) 3.6.2 Khảo át ảnh h ởng tổ h hoocmon ên ự hát inh hình thái: Sử dụng mẫu mầm, thân, rễ Sâm gọc inh uôi cấy phối hợp tổ hợp môi trường khác để đánh giá phát sinh hình thái Bảng 3.2: nh h ởng tổ h hoocmon ên ự hát inh hình thái âm Ngọc Linh cấy mô: Bộ Đối t hận ng Hoccmon cấy inh hình thái IBA Sâm gọc Linh Kết uả hát IAA NAA K 2ip G 0.2 0.2 Chết 0.5 0.5 Chết 0.5 Callus Callus Mầm, 0.2 0.5 thân, rễ 0.5 0.25 ễ 0.5 1 Phôi soma 0.5 0.5 Phôi chồi ễ 0.5 Chồi  Kết uả: - Với tổ hợp hoocmon IB 0.5 + ip Sâm gọc inh phát sinh phôi soma - Với tổ hợp hoocmon 1+G - Với tổ hợp hoocmon + ip 0.5 phát sinh rễ SVT : G YỄ T Ị T phát sinh phôi chồi 36 TỐT G IỆP 3.6.3 GV D: BÙI VĂ T Ế VI nh h ởng điều kiện chiếu ên khả tạo mô o từ cuống á: Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần không cần suốt thời gian tạo mô sẹo Đối với mẫu lá, đa số trường hợp tạo mô sẹo tối thường tốt sáng Tuy nhiên, số trường hợp mẫu cấy lại tạo mô sẹo tốt điều kiện sáng Môi trường tốt cho tạo mô sẹo ban đầu từ mẫu cuống dùng để khảo sát điều kiện chiếu sáng Mẫu đặt hai điều kiện tối hoàn toàn chiếu sáng (1 giờ/ ngày) Bảng 3.3: nh h ởng điều kiện chiếu ên khả tạo mô o từ cuống á: 2,4-D (mg/l) Bộ hận Phần trăm tạo mô o (%) Chiếu (16 gi / ngày) Tối hoàn toàn 20 30 90 80 90 90 3.0 80 80 0.5 100 100 100 100 100 100 100 100 0.5 1.0 2.0 1.0 2.0 Lá Cuống 3.0  Kết uả: ết bảng cho thấy tỷ lệ phát sinh mô sẹo mẫu cuống gần tương đương hai điều kiện chiếu sáng tối, lượng mô sẹo điều kiện tối chất lượng mô sẹo có tượng thủy tinh thể, môi trường có mg/l , -D SVT : G YỄ T Ị T 37 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI 3.6.4 nh h ởng kích th ớc mẫu cấy ban đầu ên ự tăng inh mô Mô sẹo cắt theo ba kích thước: T1, T , o: T Mẫu mô sẹo với kích thước xác định cấy vào môi trường nhân nhanh Mô sẹo sau trình tăng sinh sử dụng cho trình tái sinh chồi rễ bất định Bảng 3.4: nh h ởng kích th ớc mẫu cấy ban đầu ên ự tăng inh mô Chỉ tiêu uan át Trọng lượng tươi ban đầu (mg) ích thước (cm) Sinh khối sau tuần nuôi cấy Trọng lượng tươi (mg) Trọng lượng khô (mg) Tỷ lệ chất khô ( %) Tỷ lệ tăng sinh khối khô o: KT1 KT2 KT3 (0.5*0.5) (0.7*0.7) (1.0*1.0) 147 267 ± 18 576 ± 24 1.1*0.9 1.4*1.0 1.6*1.2 667 ± 45 804 ± 35 1505 ± 66 53.9 ± 36 57.8 ± 2.5 102.8 ± 4.5 8.08 7.19 6.83 5.46 3.22 2.65  Kết uả: ích thước mẫu cấy yếu tố quan trọng nhân giống invitro Khi khảo sát ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo, ta nhận thấy kích thước nhỏ ( T1) cho hiệu tốt tỷ lệ tăng sinh khối lẫn trọng lượng khô, khác biệt nhiều khả tăng sinh T KT3 (Bảng ) Sự tương quan bắt nguồn từ tương quan kích thước mẫu cấy - khả thu nhận dinh dưỡng từ môi trường ảnh hưởng chất thải nội sinh mô sẹo trình nuôi cấy SVT : G YỄ T Ị T 38 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI 3.6.5 nh h ởng auxin ên khả khởi tạo mô o từ cuống á: hững nghiên cứu có đối tượng thuộc chi Panax cho thấy giai đoạn khởi tạo mô sẹo thường có kết hợp cytokinin auxin Mẫu cuống sau khử trùng cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ loại auxin , -D, IBA, , với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; mg/l Mẫu đặt ngửa mặt môi trường cuống đặt ngửa (Vết cắt hướng lên trên) Bảng 3.5: nh h ởng auxin ên khả khởi tạo mô Auxin 2,4-D IBA NAA Nồng độ auxin ( mg/ ) o từ cuống á: Tỷ ệ tạo mô o (%) Cuống Lá 0.5 100 20 1.0 100 90 2.0 100 90 3.0 100 80 0.5 0 1.0 0 2.0 0 3.0 0 0.5 0 1.0 0 2.0 0 3.0 0  Kết uả: ết thu sau tuần nuôi cấy ghi nhận bảng 3.5 Trong ba loại auxin bổ sung vào môi trường có , -D có khả kích thích cuống tạo mô sẹo Trên môi trường bổ sung 1.0 mg/l , -D, mẫu cấy có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao (Đạt 90 % 100 % cuống lá), có lượng sẹo hình thành nhiều nhất, cấu trúc có màu vàng sáng SVT : G YỄ T Ị T 39 nồng độ TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI mg/l 2,4-D, mô sẹo bắt đầu có tượng thủy tinh thể Do đó, nồng độ , -D từ mg/l trở lên không phù hợp cho phát sinh mô sẹo 3.6.6 nh h ởng auxin ên khả tăng inh mô o âm Ngọc Linh: Các mẩu mô sẹo tạo từ giai đoạn khởi tạo cấy vào môi trường MS bổ sung mg/l TDZ loại auxin , -D, IB với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0; 5.0 mg/l điều kiện chiếu sang giờ/ ngày Bảng 3.6: nh h ng auxin ên khả tăng inh mô inh khối au tuần nuôi cấy Trọng Auxin Nồng độ (mg/l) ng t ban đầu (mg) 2,4-D IBA NAA o âm Ngọc Linh: Tỷ ệ tăng i Trọng t ng i (mg) Trọng Tỷ ệ sinh chất khô khối (mg/l) (%) khô ng khô 0.5 203 ± 16 584 ± 34 43.3 ± 2.5 7.42 3.18 1.0 212 ± 14 809± 37 66.2 ± 3.0 8.18 4.56 2.0 204 ± 17 711 ± 32 52.4 ± 2.4 7.37 3.73 3.0 205 ± 508 ± 24 36.6 ± 2.2 7.21 2.65 5.0 201 ± 13 493 ± 38 34.6 ± 1.7 7.01 2.50 0.5 197 ± 18 474 ± 23 45.6 ± 2.2 9.62 3.45 1.0 203 ± 19 532 ± 29 48.6 ± 2.7 9.14 3.56 2.0 207 ± 13 631 ± 32 49.5 ± 2.5 7.84 3.63 3.0 203 ± 15 552± 26 41.1 ± 1.9 7.45 3.10 5.0 209 ± 12 531 ± 23 35.3 ± 1.5 6.66 2.53 0.5 218 ± 485 ± 13 41.2 ± 1.1 8.49 2.81 1.0 212 ± 14 548 ± 21 45.0 ± 1.8 8.22 3.33 2.0 206 ± 15 588 ± 18 46.6 ± 1.4 7.92 3.37 3.0 199 ± 602 ± 32 45.7 ± 2.4 7.60 3.38 5.0 205 ± 14 720 ± 48 51.6 ± 3.4 7.20 3.77 SVT : G YỄ T Ị T 40 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI  Kết uả: Bảng cho thấy sau trình tăng sinh, mô sẹo nuôi cấy môi trường có 0.5 mg/l IB có tỷ lệ chất khô cao % tỷ lệ tăng sinh khối khô cao lần lại thu mô sẹo môi trường có , -D nồng độ 1.0 mg/l Có thể kết hợp auxin cytokinin làm tăng khả thu nhận đường chất dinh dưỡng khác từ môi trường mô sẹo kéo theo tăng sinh mô sẹo, đặc biệt tăng tỷ lệ chất khô IB auxin kích thích thu nhận dinh dưỡng từ môi trường kết hợp với TDZ tốt so với , -D ết tỷ lệ chất khô mô sẹo nuôi cấy môi trường có IB ba loại auxin sử dụng Tuy IB cao cho tỷ lệ mô sẹo có tỷ lệ chất khô cao , -D có tỷ lệ tăng sinh khối khô cao (Gấp lần) có tỷ lệ chất khô tương đối cao (8.18 %) Mặt khác, mô sẹo môi trường , -D có hình thái tốt nhất, dạng mô sẹo có khả tái sinh cao 3.6.7 nh h ởng BA NAA đến khả tái inh chồi từ mô o: Các mô sẹo thu thí nghiệm nhân nhanh mô sẹo tách chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung B với nồng độ bảng 3.6  Kết uả: Tỷ lệ auxin cytokinin đóng vai trò cần thiết cho tái sinh chồi, cytokinin thường thúc đẩy hình thành chồi trình thường kích thích bổ sung auxin với nồng độ thấp Trong thử nghiệm, sử dụng B hợp với 1.0 mg/l B kết nhận thấy tổ hợp 1.0 mg/l khác nhau, kết hợp cho số chồi đạt cao chồi/ mẫu trọng lượng trung bình 0.185 g (Bảng 7) SVT : G YỄ T Ị T B kết 41 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI Bảng 3.7: Khả tái inh chồi từ mô o môi tr ng M có bổ ung BA NAA: BA (mg/l) NAA (mg/l) 0.5 1.0 2.0 4.0 SVT : G YỄ T Ị T ố ng chồi/ mẫu Trọng ng chồi (g) 0.5 5.0 0.106 1.0 6.1 0.141 1.5 4.6 0.193 2.0 3.3 0.197 2.5 3.0 0.094 0.5 5.5 0.163 1.0 6.3 0.185 1.5 5.9 0.158 2.0 3.9 0.148 2.5 3.7 0.157 0.5 4.2 0.152 1.0 5.5 0.141 1.5 2.9 0.144 2.0 2.8 0.112 2.5 2.7 0.108 0.5 3.3 0.154 1.0 3.0 0.122 1.5 2.6 0.122 2.0 0.8 0.108 2.5 0 42 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI 3.6.8 nh h ởng BA ên uá trình tăng tr ởng chồi âm Ngọc Linh invitro: hững chồi tốt sau thu nhận tách chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung 1.0 g/l than hoạt tính, g/l sucrose, 0.5 mg/l BA ( 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 mg/l) Bảng 3.8: nh h ởng BA ên uá trình tăng tr ởng chồi âm Ngọc Linh invitro: BA (mg/l) Trọng ng t i (g) Chiều cao chồi (cm) ố ng á/ chồi 0.5 0.61 5.66 3.0 1.0 0.87 6.16 3.3 2.0 0.72 4.11 4.0 4.0 0.71 4.33 3.9  Kết uả: Trong nồng độ B mg/l đươc sử dụng, nồng độ 1.0 mg/l B kết hợp với 0.5 cho kết tăng trưởng chồi chốt với trọng lượng tươi chồi 0.87 g chiều cao chồi cm (Bảng 3.8) Vậy môi trường nuôi cấy có bổ sung 1.0 mg/l B 0.5 mg/l tốt cho trình tăng trưởng chồi 3.6.9 nh h ởng nồng độ đ ng đến khả tăng tr ởng chồi: hững chồi tốt thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l , 1.0 mg/l B , p 5.7 đường với nồng độ đường 10; 0; 0; 0; 50; g/l  Kết uả: Qua kết thử nghiệm cho thấy sucrose carbohydrate hào tan chiếm ưu nồng độ thường dùng nằm khoảng - g/l sucrose ghiên cứu ảnh hưởng sucrose lên tăng trưởng chồi Sâm gọc inh sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy việc bổ sung sucrose vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực lên sinh trưởng chồi Sự gia tăng nồng độ sucrose môi trường kích thích sinh trưởng chồi Sâm SVT : G YỄ T Ị T gọc inh mà có tác dụng mạnh đến biến đổi 43 TỐT G IỆP khối lượng chúng GV D: BÙI VĂ T Ế VI ồng độ 50 g/l sucrose cho kết tốt trọng lượng, chiều cao số lượng (Bảng 9) Bảng 3.9: nh h ởng nồng độ đ Sucrose (g/l) Trọng ng chồi (g) ng đến khả tăng tr ởng chồi: Chiều cao chồi (cm) ố ng á/ chồi 10 0.49 4.4 2.2 20 0.55 5.4 2.5 30 0.68 5.7 2.6 40 1.06 5.8 3.2 50 1.46 6.1 3.5 60 1.28 6.1 3.2 3.6.10 nh h ởng than hoạt tính đến khả tăng tr ởng chồi invitro: hững chồi tốt thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l , 1.0 mg/l B , p 5.7 với nồng độ than hoạt tính 1.0; 2.0; 3.0 4.0 g /l Bảng 3.10: nh h ởng than hoạt tính đến khả tăng tr ởng chồi invitro: Than hoạt tính (g/l) Trọng ng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) ố ng á/ chồi 0.53 3.3 3.6 1.0 0.61 4.6 3.7 2.0 1.01 5.3 3.3 3.0 0.97 6.8 2.7 4.0 0.94 8.5 3.1  Kết uả: Than hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thưc vật, có khả thay đổi thành phần môi trường Than hoạt tính điều chỉnh p SVT : G YỄ T Ị T 44 môi TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI trường, hấp thụ chất làm cản trở phát triển mô ết thu cho thấy nồng độ than hoạt tính tăng có thay đổi r rệt trọng lượng chiều cao chồi, số lượng thay đổi đáng kể Trọng lượng chồi đạt cao môi trường chứa g/l than hoạt tính khoảng 1.01 g/chồi, tăng 1.9 lần so vời đối chứng (Bảng 3.10) Vậy nồng độ g/l than hoạt tính phù hợp cho qúa trình tăng sinh chồi Sâm gọc inh 3.6.11 nh h ởng IAA IBA NAA đến khả r bất đ nh từ mô Mô sẹo cấy vào môi trường rễ có chứa auxin ( , IB , I o: )ở nồng độ 1.0; 0; 5.0; 7.0 mg/l Bảng 3.11: nh h ởng IAA IBA NAA đến khả r bất đ nh từ mô o: Auxin NAA IAA IBA Tỷ ệ r ( mg/l) (%) r / mẫu 1.0 30 3.0 ± 0.3 5.98 18 3.0 100 8.7 ± 0.1 21.88 13 5.0 70 2.6 ± 0.1 6.23 7.0 50 2.1 ± 0.1 12.21 1.0 3.0 5.0 10 7.0 1.0 70 1.6 ± 0.1 7.83 16 3.0 80 4.0 ± 0.3 5.21 21 5.0 100 4.8 ± 0.3 15.81 18 7.0 60 3.5 ± 0.1 8.06 1.7 SVT : G YỄ T Ị T ố ng Tỷ ệ khối Nồng độ ng r / mẫu (%) Chiều dài tối đa r (mm) 0.2 ± 0.2 45 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI  Kết uả: Quá trình khảo sát ảnh hưởng ba loại auxin trên, ta nhận thấy IAA không thích hợp cho trình rễ Sâm gọc inh từ mô sẹo auxin không kích thích mô sẹo rễ bất định IB ngược lại ồng độ mg/l cho kết tố với tỷ lệ rễ lên đến 100 %, số lượng rễ/ mẫu lớn (8.7 rễ/ mẫu), tỷ lệ khối lượng rễ / mẫu lớn ( 1.88 %), chiều dài tối đa rễ 13 mm (Bảng 3.11) IB nồng độ 5.0 mg/l cho tỷ lệ rễ đạt 100 %, Số lượng rễ trung bình/ mẫu mẫu, tỷ lệ khối lượng 15.81 % chiều dài tối đa rễ 18 mm ết giải thích auxin tổng hợp có hoạt tính cao dạng tự nhiên Vậy hai môi trường kích thích rễ tốt môi trường Ms ½ bổ sung mg/l môi trường MS ½ bổ sung mg/l IB 3.6.12 nh h ởng IBA NAA đến khả nhân r bất đ nh: ễ bất định sau tạo thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường nhân rễ có bổ sung auxin , IB nồng độ 1.0; 3.0; 5.0 mg/l  Kết uả: Từ kết bảng 3.12 bảng 3.13 cho thấy nguồn gốc mẫu rễ có ảnh hưởng lớn đến hiệu nhân rễ Mẫu rễ bảng 3.12 có khả nhân rễ tốt hơn, nghiệm thức rễ, tỷ lệ rễ cao %, số rễ thứ cấp cao rễ/ mẫu Mẫu rễ bảng 3.13 có tỷ lệ rễ cao %, số rễ thứ cấp cao rễ/ mẫu, có trên môi trường chứa nghiệm thức rễ mẫu lại cấy hi xét đến ảnh hưởng loại auxin, ta thấy trình nhân rễ bất định Sâm gọc inh nồng độ 5.0 mg/l phù hợp với A kích thích nhân rễ tốt (60 %), có số rễ thứ cấp nhiều (9 rễ/ mẫu) mẫu tăng trọng cao (Trọng lượng tươi trung bình 90 ± mg/l, tăng lần so với ban đầu) nữa, có tới 5/ nghiệm thức bổ sung nghiệm thức Vậy IB khơi tạo rễ từ mô sẹo và cho kết rễ so với IB , có / nồng độ mg/l phù hợp cho việc nồng độ 5.0 mg/l phù hợp cho trình nhân rễ bất định Sâm gọc inh SVT : G YỄ T Ị T ơn 46 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI Bảng 3.12: nh h ởng IBA NAA đến khả nhân r mẫu có nguồn gốc từ môi tr ng bổ ung NAA: ố r thứ Trọng ng t NAA IBA Tỷ ệ r (mg/l) (mg/l) (%) cấ - 20 140 ± 10 - 30 290 ± 10 - 60 390 ± 20 - 10 450 ± 50 - 20 330 ± 20 - 30 280 ± 30 i trung bình (mg/l) Bảng 3.13: nh h ởng IBA NAA đến khả nhân r mẫu có nguồn gốc từ môi tr ng bổ ung IBA: ng t IBA Tỷ ệ r (mg/l) (mg/l) (%) cấ - 40 350 ± 10 - 20 180 ± 30 - 0 - 10 - 0 - 0 SVT : G YỄ T Ị T ố r thứ Trọng NAA 47 bình (mg/l) 270 ± 10 i trung TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết uận - Sâm gọc inh công nhận Sâm có hàm lượng saponin cao với số lượng nhiều nhất, so với loài Panax khác giới Do việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại nhiều ý nghĩa thực tiễn việc bảo tồn nguồn dược liệu quý giá - Quá trình khảo sát ảnh hưởng loại nồng độ auxin lên khả tạo mô sẹo ban đầu cuống cho thấy nồng độ mg/l -D trở lên không phù hợp cho phát sinh mô sẹo từ Sâm gọc inh - Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao môi trường ½ MS bổ sung 1.0 mg/l BA, 1.0 mg/l NAA, 50 g/l sucrose - Đối với trình rễ từ mô sẹo, mẫu mô sẹo nuôi cấy môi trường ½ MS có bổ sung 3.0 mg/l NAA cho tỷ lệt rễ cao nhất, số lượng rễ nhiều tỷ lệ trọng lượng tươi rễ/ mẫu cao - Môi trường ½ MS có bổ sung 5.0 mg/l kích thích nhân rễ tốt nhất, cho tỷ lệ rễ cao rễ phân nhánh nhiều 4.2 Kiến ngh : - Được giới ghi nhận loài Sâm quý bậc nhất, đến Sâm gọc inh chưa biết đến nhiều loài Sâm àn Quốc hay Sâm Triều Tiên - Việc nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu loài Sâm giới nhiều tác giả tiến hành nhiều năm, Việt am kh ng định tính thực khả tạo nguồn Sâm đường nuôi cấy mô tế bào cần nhiều nghiên cứu loài Sâm gọc inh Việt hưng am để Việt am chủ động nguồn nguyên dược liệu quý, đồng thời đưa thương hiệu Sâm Việt am mang tầm quốc tế - loài Sâm đặc hữu tìm thấy với số lượng phạm vi phân bố hẹp, nhạy cảm với môi trường sống, nguồn cung cấp hạn chế, thời gian từ SVT : G YỄ T Ị T 48 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI lúc trồng từ hạt thu củ lên đến 5- năm Do đó, nguồn Sâm gọc Linh cạn kiệt dần nguy tuyệt chủng cao, nên cần có nhiều biện pháp cấp bách để bảo tồn phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên quốc gia SVT : G YỄ T Ị T 49 TỐT G IỆP SVT : G YỄ T Ị T GV D: BÙI VĂ T Ế VI 50 [...]... bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt, đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn trong các bioreactor hiều loại protein,... trong suốt thời gian sử dụng SVT : G YỄ T Ị T 26 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI CHƯƠNG III CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ÂM NGỌC LINH 3.1 Nuôi cấy mô o (D ng Tấn Nhựt và c ) 3.1.1 Nguyên iệu: Các mẫu lá và cuống lá 3.1.2 Môi tr ng: Sử dụng môi trường nền MS goài ra còn bổ sung: 1.0 mg/l , -D và 0.2 mg/l TDZ Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh p = 5.8 Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C,... thuộc họ hân oại: am có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm hưng chỉ có bốn loài Sâm hân Sâm (Araliaceae) Chi Panax gần gũi với cây gingseng C A Meyer là Sâm gọc hân Sâm Panax inh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ Diệp, đều là các cây thuốc quý ăm 19 8, S Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm gọc inh và tạm đặt tên nó là Sâm Ban dân y hu 5 do DS Đào hu 5 gọc Linh tại vùng núi ăm 197 , đoàn điều tra cây thuốc của... đúng cách Tuỳ vào mục đích nuôi cấy, thu nhận sản phẩm Tuỳ thuộc vào từng loại nuôi cấy sẽ có một môi trường tối ưu Thông thường ta phải trải qua quá trình thực nghiệm, từ đó mới tìm một loại môi trường thích hợp cho từng mục đích Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn... thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá 2.1.5 Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.5.1 Đảm bảo điều kiện vô trùng Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng, rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển và với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần so với tế bào thực vật - Dụng cụ thuỷ tinh: ửa sạch, hấp trong nồi áp suất ở 1 1 oC/15 phút út... mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy - Trong quá trình thao tác SVT : G YỄ T Ị T 12 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI Bảng 2.1: Th i gian tối thi u đ hấ kh trùng môi tr ng nuôi cấy mô ở 1210C Th tích môi tr ng (ml) Th i gian tối thi u (phút) 20-25 24 50 26 100 28.5 250 31.5 500 35 1000 40 2000 48 3000 55 4000 63 2.1.5.3 Chọn mô cấy và x ý đúng cách Tuỳ mục đích nuôi cấy để chọn loại mô cấy thích hợp Thông thường... 0.5 cm đặt vào môi trường - Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày tháng, đem vào phòng nuôi 3.2.6 Điều kiện nuôi cấy: - hiệt độ: 25 ± 20C - Cường độ chiếu sáng: 2.500 – 3.000 lux - Thời gian chiếu sáng: 1 giờ/ ngày - Độ ẩm: 75- 80 % SVT : G YỄ T Ị T 29 TỐT G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI Hình 3.2: Chồi âm Ngọc Linh 3.3 Nuôi cấy r (D ng Tấn Nhựt và c ) 3.3.1 Nguyên iệu: Sử dụng các mô sẹo đã hình... nhỏ mô sẹo khoảng 0.5 0.5 cm đặt vào môi trường - Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày tháng, đem vào phòng nuôi 3.3.6 Điều kiện nuôi cấy: - hiệt độ: 25 ± 20C - Cường độ chiếu sáng: 2500- 3000 lux - Thời gian chiếu sáng: 1 giờ/ ngày - Độ ẩm: 75- 80 % Hình 3.3: R 3.4 Nuôi cấy inh khối (D âm Ngọc Linh ng Tấn Nhựt và c ) 3.4.1 Nguyên iệu: Các mô sẹo đã hình thành 3.4.2 Môi tr ng: Sử dụng... tháng) - Sau thời gian này ta thấy khối lượng tế bào được nhân lên rất nhiều và có thể đem đi lọc để lấy tế bào nhằm thu sinh khối hay nhân sinh khối 3.4.6 Điều kiện nuôi cấy: - hiệt độ: 25 ± 20C - Cường độ chiếu sáng: 2.500- 3.000 lux - Thời gian chiếu sáng: 1 giờ/ ngày - Độ ẩm: 75- 80 % - Thời gian lắc lỏng: - Số vòng: 100 – 120 vòng/ phút tháng Hình 3.4: Nuôi cấy trong Bioreactor SVT : G YỄ T Ị T 32... G IỆP GV D: BÙI VĂ T Ế VI 3.6 Khảo át các điều kiện ảnh h ởng đến nuôi cấy âm Ngọc Linh 3.6.1 Khảo át ảnh h ởng của một ố oại chất kh trùng: Đối với Sâm gọc inh bộ phận thí nghiệm là đầu (mầm, thân, rễ) Chọn chồi mọc th ng hay chồi bên làm nguyên liệu nuôi cấy có chiều dài -3 cm, cắt bỏ hết lá, xử lý bằng cồn 70 % trong 1 phút ở tủ cấy vô trùng, sau đó tráng lại lần bằng nước cất vô trùng, sau đó xử