LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC SVTH: NGUYỄN THỊ HIỀN LƯƠNG GVHD: PGS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN ThS TÔN NỮ MINH NGUYỆT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Hàm lượng đường ban đầu Sinh trưởng nấm men Sử dụng chất Hàm lượng tannin ban đầu Tạo thành sản phẩm Mật độ tế bào hạt Mật độ tế bào hạt Hàm lượng đường khử Hàm lượng nitơ Hàm lượng ethanol Hàm lượng acid hữu Ảnh hưởng hàm lượng đường ban đầu § Động học trình sinh trưởng nấm men § Động học trình sử dụng chất: đường khử, nitơ § Động học trình tạo thành sản phẩm: cồn, acid hữu Ảnh hưởng hàm lượng tannin ban đầu § Động học trình sinh trưởng nấm men § Động học trình sử dụng chất: đường khử, nitơ § Động học trình tạo thành sản phẩm: cồn, acid hữu ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN 300 CD200g/L TD200g/L CD240g/L 250 TD240g/L Mật độ tế bào (triệu tế bào/mL) CD280g/L TD280g/L CD320g/L 200 TD320g/L CD360g/L TD360g/L 150 100 50 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 228 Thời gian (h) ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN 0,8 Tốc độ sinh trưởng riêng nấm men (1/h) CD200g/L TD200g/L 0,7 CD240g/L TD240g/L CD280g/L 0,6 TD280g/L CD320g/L TD320g/L 0,5 CD360g/L TD360g/L 0,4 0,3 0,2 0,1 0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 Thời gian (h) Ảnh hưởng hàm lượng đường ban đầu § Động học trình sinh trưởng nấm men § Động học trình sử dụng chất: đường khử, nitơ § Động học trình tạo thành sản phẩm: cồn, acid hữu Ảnh hưởng hàm lượng tannin ban đầu § Động học trình sinh trưởng nấm men § Động học trình sử dụng chất: đường khử, nitơ § Động học trình tạo thành sản phẩm: cồn, acid hữu ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG CƠ CHẤT QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG đường 350 CD200g/L TD200g/L CD240g/L 300 TD240g/L Hàm lượng đường (g/L) CD280g/L TD280g/L 250 CD320g/L TD320g/L CD360g/L 200 TD360g/L 150 100 50 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 228 Thời gian (h) ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG CƠ CHẤT QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG đường 60 Tơc độ sử dụng đường riêng (g/h/10 12 tế bào) CD200g/L TD200g/L 50 CD240g/L TD240g/L CD280g/L 40 TD280g/L CD320g/L TD320g/L 30 CD360g/L TD360g/L 20 10 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 228 Thời gian (h) ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG CƠ CHẤT QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG đường Hàm lượng đường ban đầu (g/L) Thời gian lên men (h) Nấm men cố định Nấm men tự 200 79,2 ± 2,5a 108,0 ± 2,0d 240 86,4 ± 1,5b 132,0 ± 2,5e 280 100,8 ± 2,6c 146,4 ± 3,0f 320 79,2 ± 2,5a 180,0 ± 4,6g 360 84,0 ± 2,5b 196,8 ± 7,5h ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG CƠ CHẤT QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG nitơ 180 CD200g/L 160 TD200g/L Hàm lượng nitơ amin tự (mg/L) CD240g/L TD240g/L 140 CD280g/L TD280g/L CD320g/L 120 TD320g/L CD360g/L TD360g/L 100 80 60 40 20 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 228 Thời gian (h) 10 ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG CƠ CHẤT QUÁ TRÌNH SỬ DỤNG nitơ 200 Hàm lượng nitơ ammonium (mg/L) 180 160 140 120 CD200g/L TD200g/L 100 CD240g/L TD240g/L CD280g/L 80 TD280g/L CD320g/L 60 TD320g/L CD360g/L 40 TD360g/L 20 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 228 11 Thời gian (h) Ảnh hưởng hàm lượng đường ban đầu § Động học trình sinh trưởng nấm men § Động học trình sử dụng chất: đường khử, nitơ § Động học trình tạo thành sản phẩm: cồn, acid hữu Ảnh hưởng hàm lượng tannin ban đầu § Động học trình sinh trưởng nấm men § Động học trình sử dụng chất: đường khử, nitơ § Động học trình tạo thành sản phẩm: cồn, acid hữu 12 ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH SẢN PHẨM QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HP CỒN 16 14 Hàm lượng cồn (%v/v) 12 10 CD200g/L TD200g/L CD240g/L TD240g/L CD280g/L TD280g/L CD320g/L TD320g/L CD360g/L TD360g/L 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 228 13 Thời gian (h) ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH SẢN PHẨM Tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình (g/L/h) QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HP CỒN 1.2 Cố định Tự 0.8 0.6 0.4 0.2 200 240 280 320 Hàm lượng đường (g glucose/L) 360 14 ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH SẢN PHẨM QUÁ TRÌNH chuyển hóa acid hữu 4,1 3,9 pH 3,8 CD200g/L TD200g/L CD240g/L TD240g/L CD280g/L TD280g/L CD320g/L TD320g/L CD360g/L TD360g/L 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 12 24 36 48 60 72 84 15 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 228 Thời gian (h) ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH SẢN PHẨM QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA CỦA CÁC ACID HỮU CƠ Hàm lượng acid tổng (g acid tartaric/100 mL) 0,80 0,75 0,70 0,65 CD200g/L TD200g/L CD240g/L TD240g/L CD280g/L TD280g/L CD320g/L TD320g/L CD360g/L TD360g/L 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 12 24 36 48 60 72 84 96 16 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 228 Thời gian (h) ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH SẢN PHẨM Hàm lượng acid dễ bay (g acid acetic/100mL) QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA CỦA CÁC ACID HỮU CƠ 0,06 0,05 0,04 CD200g/L TD200g/L CD240g/L 0,03 TD240g/L CD280g/L 0,02 TD280g/L CD320g/L TD320g/L CD360g/L 0,01 TD360g/L 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 228 17 Thời gian (h) KẾT LUẬN Mật độ tế bào cực đại - tốc độ sinh trưởng riêng cực đại Tốc độ sử dụng đường - tốc độ sinh tổng hợp cồn Khả sử dụng nitơ ammonium - nitơ hữu pH – hàm lượng acid tổng Hàm lượng acid dễ bay 18 Ảnh hưởng hàm lượng đường ban đầu § Động học trình sinh trưởng nấm men § Động học trình sử dụng chất: đường khử, nitơ § Động học trình tạo thành sản phẩm: cồn, acid hữu Ảnh hưởng hàm lượng tannin ban đầu § Động học trình sinh trưởng nấm men § Động học trình sử dụng chất: đường khử, nitơ § Động học trình tạo thành sản phẩm: cồn, acid hữu 19 ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG CỦA NAÁM MEN 250 Mật độ tế bào (triệu tế bào/mL) 200 150 CD 1,8g/L 100 TD 1,8g/L CD 2,8g/L TD 2,8g/L CD 3,8g/L TD 3,8g/L 50 CD 9,8g/L TD 9,8g/L CD 17,8g/L TD 17,8g/L 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 228 240 252 264 276 20 Thời gian (h) ƯU NHƯC ĐIỂM CỦA ALGINATE SO VỚI CÁC CHẤT MANG SỬ DỤNG PP HẤP PHỤ Alginate Chất mang sử dụng pp hấp phụ Hiệu suất cố định tế bào cao Có tác dụng bao bọc, bảo vệ tế bào Tế bào thoát khỏi chất mang Kỹ thuật cố định đơn giản Có thể tái sử dụng chất mang 93 NHƯC ĐIỂM CỦA VIỆC CỐ ĐỊNH NẤM MEN TRONG GEL ALGINATE VÀ CÁCH KHẮC PHỤC −Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do: Sự phát triển nhiều tế bào nấm men gần bề mặt Sự giải phóng CO bên gel làm phá vỡ cấu trúc gel → sử dụng kỹ thuật tạo màng bao áo nấm men cố định với mạng polymer −Gel Ca-alginate nhạy với chất tạo chelate phosphate, citrate lactate chất không tạo gel (non-gelling) ion sodium magnesium → phồng ra, tăng kích thước lỗ xốp, làm giảm tính ổn định phá vỡ cấu trúc hạt gel → chất ổn định gel, CaCl2, celite pectine; làm cứng gel cách sử dụng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) loại vật liệu composite (colloidal silica) −Không bền hóa học dung dịch điện phân dung dịch có pH cao → tạo liên kết hạt gel với glutaraldehyde, với polycations; sấy khô hạt gel; ion Ba2+ vaø Sr2+ thay cho ion Ca2+ 94 ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN ALGINATE & CÁC ĐIỀU KIỆN TẠO GEL ĐẾN ĐỘ BỀN GEL & QUÁ TRÌNH LÊN MEN Khối lượng phân tử ↑ → không ảnh hưởng đến tốc độ lên men + ↑ độ bền gel Tỷ lệ M/G ↑ → tốc độ lên men ↑ + độ bền gel ↓ Nồng độ alginate ↑ (1 – 10%) → tốc độ lên men ↓ + độ bền gel ↑ pH tạo gel: 6,0 – 8,0 Nhiệt độ tạo gel: < 25oC Mật độ tế bào hạt Tỷ lệ S/V ↑ → suất lên men ↑ 95 MỘT SỐ ĐIỂM KHÁC NHAU GIỮA CỐ ĐỊNH NẤM MEN & CỐ ĐỊNH ENZYME § Nấm men tế bào sống → sinh trưởng, trao đổi chất § Cố định nấm men → hoạt tính tăng § Cố định enzyme → hoạt tính giảm độ bền hoạt tính cao so với enzyme tự 96 NHƯC ĐIỂM CỦA NẤM MEN TỰ DO Thời gian lên men dài, suất lên men thấp Tiêu tốn nhiều lượng để tách nấm men khỏi rượu vang sau trình lên men Khả tái sử dụng nấm men thấp Khó tự động hóa trình lên men 97 ƯU ĐIỂM CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH Tăng tốc độ sử dụng chất, rút ngắn thời gian lên men Ổn định hoạt tính nấm men Các chất mang cố định có tác dụng tác nhân bảo vệ tế bào chống lại ảnh hưởng bất lợi pH, nhiệt độ, dung môi kim loại nặng Dễ dàng tách nấm men khỏi sản phẩm sau trình lên men, làm giảm chi phí thiết bị lượng Có thể tái sử dụng nấm men nhiều lần Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tối ưu hóa tự động hóa trình lên men 98 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT RƯU VANG Dùng kỹ thuật cố định để khắc phục số vấn đề sản xuất rượu vang: § Loại acid malic rượu vang § Ngăn chặn tượng kéo dài thời gian lên men trình lên men kết thúc hàm lượng đường sót cao Dùng kỹ thuật cố định số phương pháp lên men: § Lên men tónh nhiều chu kỳ § Lên men liên tục Dùng kỹ thuật cố định sản xuất số loại rượu vang: § Lên men rượu vang phổ thông § Lên men rượu vang có gas theo phương pháp Champenoise 99 KHÁI NIỆM VỀ LÊN MEN Theo nghóa hẹp: trình thu nhận lượng, sinh tổng hợp ATP mà chuỗi hô hấp Theo nghóa rộng: trình chuyển hóa hợp chất hữu nhờ vi sinh vật Cơ chất + Giống VSV → Sinh khối vi sinh + Sản phẩm trao đổi chất ngoại bào + Cơ chất sót + Sản phẩm tự phân tế bào chết 100 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN Giống vi sinh vật Thành phần môi trường: § Các nguyên tố bản: C, N, H, O § Khoáng § Yếu tố sinh trưởng: vit, aa, purine, pyrimidine Điều kiện lên men: § Nồng độ chất § pH § Nhiệt độ § O2 101 LÝ DO CHỌN LỰA CÁC HÀM LƯNG ĐƯỜNG KHẢO SÁT § Dịch nho thông thường: 160 – 260g/L đường § Nho thu hoạch trễ: 300g/L § Dịch nho cô đặc: 350g/L 102 NẤM MEN BỊ ỨC CHẾ BỞI HÀM LƯNG ĐƯỜNG CAO Hoạt độ nước giảm → co tế bào chất Bất hoạt enzyme quan trọng đảm nhiệm nhiệm vụ mã DNA (Patterson cộng sự, 1995) pH nội bào giảm 0,2 đơn vị (Cheftel, 1995) 103 NẤM MEN CỐ ĐỊNH ÍT BỊ ỨC CHẾ BỞI HÀM LƯNG ĐƯỜNG CAO Có chất mang bảo vệ → đường cần có thời gian khuếch tán từ bên vào bên chất mang Nấm men cố định tạo thành glycerol nhiều → oxy hóa khử nội bào + NAD+/NADH+ + chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu Môi trường lên men có chứa ion Ca2+ (Vieira cộng sự, 1989) 104 NẤM MEN CỐ ĐỊNH CÓ KHẢ NĂNG TRAO ĐỔI CHẤT TỐT HƠN SO VỚI NẤM MEN TỰ DO pH nội bào NMCĐ thấp chút so với NMTD: § ↑ tốc độ sử dụng ATP → ↑ tốc độ sinh tổng hợp ethanol § ↑ tốc độ phản ứng xúc tác phosphofructokinase hexokinase Thay đổi thành phần lipid màng membrane 105 NẤM MEN CỐ ĐỊNH CÓ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG NITƠ TỐT HƠN Thay đổi thành phần lipid màng membrane Có không bào lớn (Pardonova cộng sự, 1986) 106 NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG NITƠ NH4+ TRIỆT ĐỂ HƠN SO VỚI NITƠ AMIN Theo Jiranek cộng (1995): § Arginine, aspartic, asparagine, glutamin, isoleucine, leucine, lysine, serine, threonie NH4+ § Glutamic, alanine, histidine, methionine, phenylalanine valine § Glycine, tryptophan tyrosine § Proline 107 NẤM MEN BỊ ỨC CHẾ BỞI HÀM LƯNG CỒN CAO Ảnh hưởng đến màng tế bào chất → thay đổi trình vận chuyển chất qua màng Cồn tích lũy nội bào cao → enzyme ADH bị bất hoạt + tế bào giảm khả sống hoạt động 108 NẤM MEN CỐ ĐỊNH ÍT BỊ ỨC CHẾ BỞI HÀM LƯNG CỒN CAO Được bao bọc bảo vệ lớp vật liệu gel Có thay đổi khả vận chuyển chất qua màng → tăng khả giải phóng ethanol nội bào môi trường Có hoạt tính enzyme ADH cao 109 HIỆU SUẤT SINH TỔNG HP CỒN CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH THẤP HƠN NMCĐ sử dụng nhiều đường để chuyển hóa thành hợp chất khác → tăng khả trao đổi chất khả chịu đựng stress NMCĐ sử dụng đường để trì ổn định mật độ tế bào 110 pH CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH THẤP HƠN SO VỚI NẤM MEN TỰ DO § Chu trình Krebs § Vận chuyển ion H+ qua màng tế bào (H+ vào tế bào hơn) 111 ƯU ĐIỂM CỦA pH THẤP Độ bền sinh học cao: tác dụng pH thấp + tác dụng SO2 Độ bền hóa lý cao: cường độ màu độ bền màu cao; ↑ khả kết lắng phức tannin-protein 112 CHUYỂN HÓA CỦA CÁC ACID HỮU CƠ Bắt đầu trình lên men, acid tartaric acid malic chiếm ưu Nhưng sau đó: § Acid tartaric giảm dần: kết tủa với K Na; chuyển hóa thành acid lactic acid acetic § Acid malic giảm dần § Acid succinic tăng dần 113 NẤM MEN CỐ ĐỊNH TẠO THÀNH ÍT ACID DỄ BAY HƠI Có khả sử dụng đường tốt Thay đổi hoạt động TĐC nấm men → giảm khả chuyển hóa đường thành acid acetic pH thấp 114 LÝ DO CHỌN LỰA CÁC HÀM LƯNG TANNIN KHẢO SÁT § Nho: 0,5 – 2% tannin § Một số loại nho: 3% tannin (Navarie, L’oenologie, Tec & Doc Lavoisier, Paris, 1992) 115 KHÁI NIỆM VỀ TANNIN § Tannin hợp chất phenol tan nước, có khối lượng phân tử nằm khoảng 500 – 3000 Ngoài phản ứng thông thường phenol, tannin có tính chất đặc biệt khả kết tủa với alkaloid, gelatin protein khác § Tannin xuất phát từ chữ “tanning” có nghóa thuộc da 116 VAI TRÒ CỦA TANNIN TRONG RƯU VANG ĐỎ Ảnh hưởng đến vị rượu vang → tạo cảm giác se (astringency) nơi miệng Trong trình ủ: § Tannin ngưng tụ, tạo thành hợp chất phlobaphen vô định hình có màu đỏ § Tannin bị oxy hóa, tạo thành hợp chất quinol → hương vị rượu dậy Ổn định màu rượu vang đỏ Cải thiện độ rượu vang Là chất chống oxy hóa Đối với người: bảo vệ tim mạch, chống ung thư 117 MỐI QUAN HỆ GIỮA HAI ĐƠN VỊ ĐO HÀM LƯNG TANNIN 1g/L acid tannic = 1g/L acid gallic 118 NẤM MEN BỊ ỨC CHẾ BỞI HÀM LƯNG TANNIN CAO Tannin hấp phụ lên bề mặt nấm men → ảnh hưởng đến khả vận chuyển chất qua màng Acid tannic ảnh hưởng đến trình tổng hợp chuỗi hô hấp → thiếu sắt → giảm tốc độ sinh trưởng (Wauter cộng sự, 2001) Acid tannic ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp acid béo không no sterol màng tế bào chất (Wauter cộng sự, 2001; Mazauric Salmon, 119 2005) CHUỖI HÔ HẤP 120 AOAC THE ASSOCIATION OF ANALYTICAL COMMUNITIES Là hệ thống phương pháp phân tích tiêu chuẩn hóa 121