BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN THỊ HÀ KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ RED PYROGALLOL-MOLYBDAT ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN THỊ HÀ KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ RED PYROGALLOL-MOLYBDAT ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN THỊ MINH THUẬN Thành phố Hồ Chí Minh 2014 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học Năm học 2013-2014 KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ RED PYROGALLOL MOLYBDAT ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU Sinh viên thực hiện: Trần Thị Hà Thầy hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Minh Thuận Đặt vấn đê Cũng các thành phẩm thuốc, các sản phẩm thuốc thử sử dụng sinh hóa cũng cần đảm bảo hiệu và chất lượng từ sản xuất đến hết hạn dùng Bởi vậy nhà sản xuất phải nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm để xác định tuổi thọ của chế phẩm và đưa hạn Chúng thực hiện đề tài với mục tiêu khảo sát độ ổn định của kit thử red pyrogallol – molybdat để định lượng protein niệu với quy trình đa được tối ưu hoá Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Pha chế lô thuốc thử red pyrogallol molybdat và tiến hành định lượng protein niệu bằng phương pháp đo quang theo quy trình đa được tối ưu hóa Thẩm định quy trình này Sau đó khảo sát độ ổn định của lô thuốc thử red pyrogallol molybdat được sản xuất theo công thức được tối ưu hóa bằng các phương pháp dài hạn, lao hóa cấp tốc và gây stress Dựa vào số liệu tiến hành độ ổn định để tính tuổi thọ của của lô theo phương pháp Van’t Hoff và tính tuổi thọ trung bình của thuốc thử Kết qua Quy trình tối ưu đạt các yêu cầu thẩm định Tuổi thọ của thuốc thử tính toán được theo phương pháp Van’t Hoff của thuốc thử tính là 30 tháng Kết luận Chúng xác định được tuổi thọ của thuốc thử red pyrogallol molybdat pha được là 30 tháng Final essay for the degree of B.S.Pharma Academic year: 2013 -2014 EXAMINE THE STABILITY OF THE PYROGALLOL RED MOLYBDATE TEST KIT FOR QUANTITATIVE PROTEINURIA Tran Thi Ha Supervisor: MA Nguyen Thi Minh Thuan Abstract Introduction and objectives: Like other drug products, reagents products use in biochemistry should also ensure efficiency and quality from production to the end use So manufacturers have to study the stability of preparations to determine the longevity of medication and take out of life shelf We take this subject with the aim of examining the stability of pyrogallol red test kit-molybdates proteinuria to quantify the processes optimized Matherials and method: Three batches of reagent red pyrogallol molybdate were mixed Proteinuria was determined by a spectrophotometry method using RPM reagent with the process optimized This process was evaluated Then, batches of red pyrogallol molybdate reagents produced according to the formula which is optimized were examined the stability by using the long term, accelerate and cause stress method Based on demographic to calculate the longevity of batches according to Van't Hoff approach and calculated the average life expectancy of a reagent Results: Optimal quantitative process achieves the required of validation criteria The lifespan of reagent is calculated by the Van't Hoff method is 30 months Conclusion: We determined the longevity of red pyrogallol molybdat reagent which is mixed was 30 months LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến cô ThS Nguyễn Thị Minh Thuận đa tận tình dẫn, giúp đỡ, vạch hướng cũng hướng giải quyết khó khăn suốt thời gian em thực hiện đề tài để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này Em xin chân thành cảm ơn cô PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ đa dành thời gian góp y phản biện giúp cho đề tài khóa luận của em được hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Trần Thanh Nhan đa hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm quy giá cho khóa luận của em được hoàn thành tốt và đúng thời hạn Em xin chân thành cảm ơn các anh chị ở Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh và công ty dược phẩm OPC đa giúp đỡ em việc gửi mẫu và lấy mẫu quá trình thực hiện đề tài Em xin cảm ơn các thầy cô, các anh chị bộ môn Hóa Sinh và các bạn đa nhiệt tình giúp đỡ thời gian thực hiện khóa luận Trần Thị Hà MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ gốc Ý nghĩa Abs Absorbance Độ hấp thu BCA Bicinchoninic acid BN Bệnh nhân CV Coefficient of variation EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid LLOQ Lower limit of quantitation Giới hạn định lượng LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng N/A Not available Dữ liệu không xác định NKM Người khỏe mạnh RH Relative Humidity RP Red Pyrogallol RPM Red Pyrogallol – Molybdat RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn TB Trung bình UV – Vis Ultraviolet – Visible VNĐ Việt Nam Đồng WHO World Health Organization Hệ số biến thiên Độ ẩm tương đối Tử ngoại – khả kiến Tổ chức Y tế thế giới DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG 10 DANH MỤC PHỤ LỤC 58 − Bang 4.24 Kết tuổi thọ bộ kit RPM theo nguyên tắc Van’t Hoff ở lô được bảo quản ở điều kiện 40 oC ± 2/ RH = 75 ± 5% − − Thời gian bao quan (ngày) − Lô − Lô − Lô − 905 − 905 − 927 − Mặc dù tiến hành khảo sát độ ổn định của kit thử RPM với phương pháp, thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên số liệu của phương pháp dài hạn cịn ít và chưa đủ sớ liệu để đưa kết luận tuổi thọ của kit thử nên xác định tuổi thọ của kit thử RPM theo các phương pháp lao hóa cấp tốc − Vậy tuổi thọ của bộ kit tính theo phương pháp Van’Hoff được trình bày bảng 4.19 − Bang 4.25 Tuổi thọ của bộ kit theo phương pháp Van’Hoff − − − Tuổi thọ của bộ kit − Lô − Lô − Lô − Phương pháp lao − 916 − 876 − 860 − Phương pháp lao − 905 − 905 − 927 − Tuổi thọ trung − 30 − 30 − 29 hóa cấp tốc ở 25 o C (ngày) hóa cấp tốc ở 40 o C (ngày) bình theo phương pháp Van’t Hoff (tháng) − Nhận xét: Tuổi thọ trung bình của bộ kit thử RPM theo phương pháp lao hóa cấp tốc là 30 tháng Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương Kết và bàn luận 59 4.3 BÀN LUẬN − Quy trình định lượng protein niệu với kit thử RPM theo quy trình tối ưu đáp ứng tốt các yêu cầu thẩm định một quy trình định lượng tính đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác, độ đúng Vì vậy kit thử RPM được sản xuất theo quy trình tối ưu hóa có thể thay thế các chế phẩm ngoại nhập hiện có thị trường mà đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm − Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương Kết và bàn luận Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN − Qua ba tháng thực hiện đề tài, từ các mục tiêu đề ra, chúng đa thu được một số kết sau: − Thẩm định được quy trình định lượng protein niệu bằng phương pháp RPM tối ưu hóa máy UV – Vis spectro UV 2505 Quy trình tối ưu hóa được đánh giá là đạt các yêu cầu của một quy trình phân tích tính đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác và độ đúng − Ứng dụng quy trình định lượng đa thẩm định mẫu nước tiểu của người tình nguyện khỏe mạnh và mẫu nước tiểu của người bệnh Kết định lượng cho thấy, protein niệu của mẫu nước tiểu bệnh nhân cao người khỏe mạnh − Khảo sát được độ ổn định của kit thử RPM bằng phương pháp tự nhiên ở ± 3oC và phương pháp lao hóa cấp tốc ở điều kiện 25 ± oC/ RH=60 ± 5% và điều kiện 40 ± oC/ RH=75 ± 5% Sau đó tính được tuổi thọ của bộ kit bằng phương pháp Van’t Hoff Tuổi thọ của thuốc thử theo phương pháp Van’t Hoff xác định được là 30 tháng 5.2 ĐỀ NGHỊ − Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên chúng xác định được tuổi thọ của kit thử theo phương pháp lao hóa cấp tốc Nếu có điều kiện tiếp tục nghiên cứu đề tài này, chúng đề nghị: − Tiếp tục khảo sát độ ổn định của kit thử RPM theo phương pháp tự nhiên ở ± oC đến hoạt tính kit thử giảm 95% so với ban đầu để có thể xác định tuổi thọ của bộ kit ở điều kiện tự nhiên, từ đó đưa hạn dùng chính xác của bộ kit − Sản xuất một lượng lớn bộ kit thử RPM đa tối ưu hóa và sử dụng bộ kit này để định lượng protein niệu của các mẫu thử lâm sàng khoảng thời gian tuổi thọ của kit thử Sau đó so sánh kết định lượng lâm sàng của kit thử tối ưu hóa với các kit Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương Kết luận và đề nghị thử khác cùng các mẫu thử để đánh giá độ nhạy và hiệu của bộ kit thử sản xuất Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại họcChương Kết luận và đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO − TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Môn Hóa Sinh Khoa Dược, Đại học y dược thành phố hồ chí minh (2013), giáo trình thực tập sinh hóa Bộ Y Tế (1972), Sinh hóa và phân tích nước tiểu, nhà xuất Y Học, Hà Nội, tr 111-113 Bộ Y Tế (2009), Hóa Sinh Học, nhà xuất Y Học Hà Nội, tr 548-549 Bộ Y Tế (2009), Quy chế đăng kí thuốc Bộ Y TẾ Vụ khoa học và đào tạo (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, nhà xuất Y Học, Hà Nợi, tr 171-186 Đặng Văn Hịa, Vĩnh Định (2012), Kiểm nghiệm thuốc, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, tr.135-180 Đặng Văn Hòa, Võ Thị Bạch Huệ (2014), Giáo trình độ ổn định thuốc Nguyễn Thế Khánh, Phạm Tử Dương (2001), Xét nghiệm sử dụng lâm sàng, nhà xuất Y Học, Hà Nội, tr 428-434 Phùng Thị Hoàng Nhi, (2013), Thiết kế và tối ưu hóa quy trình định lượng protein niệu bằng phương pháp Red Progallol – Molybdat, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh 10 Trần Thanh Nhan (2009), Hóa Sinh Học, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, Hà Nội, tr 197,198 11 Vũ Đình Vinh (1998), Hướng dẫn sử dụng các xét nghiệm sinh hóa, Nhà xuất Y Học, Hà Nội, tr 580-582 − TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 12 Antharavally Babu S., Mallia Krishna A., Rangaraj Priya (2009) "Quantitation of proteins using a dye–metal-based colorimetric protein assay", Analytical Biochemistry, 385, pp 342-345 13 Asean Guideline for drug product stability 5th Draft (2013) 14 Bradford Marion M (1976) "A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding Marion M.", Analytical Biochemistry, 72, pp 248-254 15 Bricgs Richard R., Swain and Stephen L (1979) "Measurement of Total Protein in Urine: Comparison of Two Dye-Binding Procedures with a Gel Filtration/Modified Biuret Method", Microchemical Journal, 24, pp 56-61 16 Chemicals diagnostic (2002), Total protein Assay 17 Chi Fo, Tsang, Arumugam Manthiram (1997), Journal of Materials Chemistry, (6) pp 1003–1006 18 ICH Q1A(R2) Guideline Stability Testing of New Drug Substances and Products (2003) 19 KSU Biochemistry - College of Science - Department of (2009), Biuret assay 20 Ku Hyung-Keun, Lim Hyuk-Min, Oh Kyong-Hwa et al (2013), "Interpretation of protein quantitation using the Bradford assay: Comparison with two calculation models", Analytical Biochemistry 434, pp 178-180 21 Lucarini A.C., Kilikian B.V (1999), "Comparative study of Lowry and Bradford methods: interfering substances", Biotechnology Techniques, 13, pp 149-154 22 Michael H Simonian, John A Smith (2006), “UNIT 10.1A Spectrophotometric and Colorimetric Determination of Protein Concentration”, Current Protocols in Molecular Biology, 10.1.A.1-10.1.A.9 23 Nicholas, Kruger J (2009), The Protein Protocols Handbook, pp 17-24 24 Noble James E., Bailey Marc J A (2009), Methods in Enzymology, pp 73-95 25 Orsonneau JL., Douet P,, Massoubre C (1989) "An improved pyrogallol redmolybdate method for determining total urinary protein", Clin Chem, 23 (11), pp 2233-2236 26 Redmile-Gordon M.A., Armenise E., White R.P., Hirsch P.R., Goulding K.W.T (2013), "A comparison of two colorimetric assays, based upon Lowry and Bradford techniques to estimate total protein in soil extracts", Soil Biology & Biochemistry, 67, pp.166-173 27 Sapan Christine V., Lundblad Roger L., Price Nicholas C (1999) "REVIEW: Colorimetric protein assay techniques", Biotechnol Appl Biochem, 29, pp 99-108 28 Shojaee N, Patton WF, Lim MJ et al (1996) "Pyrogallol red-molybdate: a reversible metal chelate stain for detection of proteins immobilized on membrane supports", Electrophoresis ,17 (4), 687-693 29 Sigmaaldrich, sodium molybdate 30 Silvério Sara C., Moreira Sérgio, Milagres Adriane M.F et al (2012), "Interference of some aqueous two-phase system phase-forming components in protein determination by the Bradford method", Analytical Biochemistry, 421, pp 719-724 31 Smith P K., Krohn R I., Hermanson G T et al (1985), "Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid", Analytical Biochemistry, 150, pp 76-85 32 U.S Department of Health and Human Services Food and Administration, Guidance for industry bioanalytical method validation (2001) 33 Watanabe N., Kamei S., Ohkubo A et al (1986), "Urinary protein as measured with a pyrogallol red-molybdate complex, manually and in a Hitachi 726 automated analyzer", Clin Chem, 32 (8), pp 1551-1554 34 WHO guideline of stability testing of active substances and pharmaceutical products (2006) PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết phân tích thống kê tính tuyến tính của quy trình tối ưu − − SUMMARY OUTPUT − − − − − − − − − − Regression Statistics − 0.9991352 Multiple R 18 − 0.9982711 R Square 84 Adjusted R − 0.9980550 Square 82 − 0.0188050 Standard Error 73 Observations − 10 − ANOVA − − − df − Regression − − Residual − Total − − − − − − Intercept − X Variable − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − SS − 1.6335778 − 1.633577 54 854 − 0.0028290 − 0.000353 46 631 − − 1.6364069 − − − − − Coefficien − Standard − 0.0088674 − 0.0091879 ts 69 − 0.0033358 97 − MS Error 32 − 4.90815E05 − F − 4619.4449 − 0.965121 − 239 − 67.96649 − 837 nce F − 2.4443E − − − − t Stat − Signific − − P-value 0.3627 484 2.4443E -12 − Lower 95% − 0.01231 − 0.00322 PL-66 Phụ lục Phân tích độ chính xác ngày của quy trình định lượng protein niệu bằng thuốc thử RPM − − Nồng độ protein mg/dL − − − − − − − − Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance − − − − − − − − Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) − 4.9436 − − − − − − − − 0.068830662 − 5.056 − 5.056 − 0.153910039 − 0.0236883 − − − -3.333333333 012 − -0.608580619 − − 0.281 − − 4.775 − − 5.056 − − 24.718 − − − − 0.191104554 − − Nồng độ protein 170 mg/dL − − − − − − − − Mean − − − − − − − − Kurtosis Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) CV% 3.113319 − − − 171.0674 − − 1.44876836 − 171.348 − #N/A − 3.239544536 − 10.4946488 − − − − − − − 0.215993913 4074 − 0.606656228 − − 8.427 − − 167.416 − − 175.843 − − 855.337 − − − − 4.022425821 − CV% 1.89372 PL-67 − Nồng độ protein 290 mg/dL − − − − − − − − Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance − − − − − − − − Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count − − − Confidence Level(95.0%) − 283.8202 − − − − − − − − 2.034533666 − 283.146 − #N/A − 4.549355581 − 20.6966362 − − − 2.111335512 − 1.421936211 − − 11.236 − − 280.056 − − 291.292 − − 1419.101 − − − − 5.648771039 − CV% 1.602 900562 PL-68 − Phụ lục Phân tích độ chính xác khác ngày của quy trình định lượng protein niệu bằng thuốc thử RPM − Nồng độ protein mg/dL − − − − − − − − − − − − − − − − − − − 5.093466667 − 0.053923744 − 5.056 − 5.056 − 0.208845762 − 0.043616552 − -0.969999085 − -0.226627719 − 0.562 − 4.775 − 5.337 − 76.402 − 15 − 0.115654928 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) − Nồng độ protein 170 mg/dL − − − − − − − − − − − − − − − − − Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) − 171.9475333 − 0.70312862 − 171.91 − 171.91 − 2.723205434 − 7.415847838 − -0.997903844 − -0.131443569 − 8.708 − 167.416 − 176.124 − 2579.213 − 15 − 1.508060899 − − − − − − − − CV% − 4.100267575 − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − CV% 1.583742076 PL-69 − Nồng độ protein 290 mg/dL − − − − − Mean − 284.0449333 − − Standard Error − 1.184224735 − − Median − 283.427 − − Mode − 280.056 − − Standard Deviation − 4.586482678 − − Sample Variance − Kurtosis − 21.03582335 − − − 0.17425234 − Skewness − 0.842770489 − − Range − 16.292 − − Minimum − 277.809 − − Maximum − 294.101 − − Sum − Count − Confidence Level(95.0%) − − 4260.674 − − 15 − − 2.53990944 − CV% 1.6147032 17