Đang tải... (xem toàn văn)
Bioproducts cách ly và quy trình phương pháp làm sạch bằng ánh nắng là đoạn quan trọng của công nghiệp công nghệ sinh học. Bromelain là en zim mà có giá trị thương mại lớn và được quan tâm đến nhiều thứ trong dược, tiêu hoá, và công nghiệp dệt, giữa người khác. Mục tiêu này nghiên cứu là để phát triển phương pháp mới cho sự làm trong sạch bromelain từ phế liệu thân phát sinh từ nông nghiệp chế biến cây dứa. Bromelain đã được làm sạch sử dụng hai sắc ký lỏng bước, sự trao đổi i on cộng sắc ký sự lọc gel. Sử dụng phương pháp luận mà được phát triển tạo ra en zim với trọng lượng phân tử của 30 kDa ( xác nhận bằng SDS Trang ), phục hồi cao của hoạt động enzim ( 89% ), và với purifi cation yếu tố của 16.93, kết quả cao hơn phương pháp luận mô tả trong văn chương. HPLC cho thấy hiện diện của hai đỉnh cao trong sắc phổ sự trao đổi i on và chỉ một prô tê in trong sắc phổ sự lọc gel. Kết quả cho thấy, tùy vào nơi đến của bromelain, tiến trình có thể bị chặn đứng sau khi bước sự làm trong sạch đầu tiên. MALDI TOF cô miễn là dấu vân tay khối pép tít của bromelain và MALDIMS cô phân mảnh hồ sơ và trình tự của ion của m z 951 và 1584. Do đó, kết nối và cấu trúc hoá học của bromelain được xác nhận. Hơn nữa, chưa kể thế mạnh của nó khác phương pháp luận, nó có thể được áp dụng cho lợi dụng nông nghiệp và công nghiệp cây dứa phế liệu. Sự cô lập và tinh chế các chế phẩm sinh học là quá trình rất tầm quantrọng trong ngành công nghiệp công nghệ sinh học, chiếm 8090% tổng chi phí sản xuất. Hơn nữa, sự phát triển của đơn giản, phương pháp khả thi để lọc protein đã là một điều kiện tiên quyết cần thiết cho nhiều tiến bộ trong công nghệ sinh học (Harikrishna et al., 2002; Costa et al., 2009). Sắc ký lỏng (LC) là một kỹ thuật thường được sử dụng làm sạch protein. Tuy nhiên, kỹ thuật phân tích khác cũng có thể được sử dụng như chiết lỏnglỏng bởi hệ thống hai pha nước (Babu et al., 2008), đảo ngược các hệ thống micellar. và tách biệt bởi màng tế bào và có mưa (Doko et al, 2005. Silveste et al., 2012). Trong sắc ký lỏng, ủng hộ teins trong dung dịch (pha động) đang bị cô lập và tinh khiết qua tương tác của họ với một pha tĩnh (Cao, 2005). Nói chung, các sản phẩm thu được bằng cách lọc LC là rất tốn kém và có giá trị gia tăng cao do chi phí của các vật liệu được sử dụng trong quá trình sản xuất. Sự phát triển của thanh lọc LCchi phí thấp phương pháp đã được thử thách (Costa et al., 2009). Enzyme phân hủy protein, hoặc protease, là một lớp học của thủy phân các enzyme có khả năng tách cầu nối peptide của chuỗi protein và rất cần thiết trong quá trình sinh lý. Ngoài ra, thân chọc là một trong những enzyme có liên quan nhất từ một công nghiệp quan điểm vì sự tham gia của họ trong một số công nghệ ứng dụng (Bon et al., 2008). Bromelain là một enzyme phân giải protein thuộc cysteine gia đình peptidase. Loại enzyme này có thể được tìm thấy trong các mô của nhà máy của gia đình Bromeliaceae, và dứa (Ananas comosus var. comosus) là nguồn chính của nó (Rowan và cộng sự, 1990;.. Hebbar et al, 2008). Bromelain có một số ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt là trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm các ngành công nghiệp, như cũng như một số ứng dụng lâm sàng, chẳng hạn như một tác nhân chống ung thư, điều biến đáp ứng miễn dịch và tăng cường tác dụng kháng sinh và hành động mucolytic và tiêu hóa (Maurer, 2001;. Bala và cộng sự, 2012). Hơn nữa, các enzyme có tác dụng trên tim mạch và các bệnh tuần hoàn và có thể có tiềm năng sử dụng trong phẫu thuật thủ tục và chăm sóc vết thương (Costa et al., 2009). Các ứng dụng trên toàn thế giới của bromelain làm tăng tầm quantầm xác định một phương pháp khai thác và tinh chế khả thi cho enzyme này. Như một phương pháp có thể giúp giảm thiểu thiệt hại trong các doanh nghiệp nông nghiệp dứa vì nông nghiệp và công nghiệp chất thải dứa (thân cây, lá và thân răng) rất giàu này enzyme. Thông thường, dư lượng này không được sử dụng và không có điểm đến appropriăn (Bardiya et al, 1996;.. Costa và cộng sự, 2009). Do đó, nghiên cứu này trình bày một phương pháp khả thi mới cho purification của bromelain từ thân cây dứa sử dụng LC là chính mình kỹ thuật
MỘT QUY TRÌNH MỚI DỰA TRÊN SẮC KÝ CỘT ĐỂ LÀM SẠCH BROMELAIN BẰNG TRAO ĐỔI ION CỘNG VỚI GEL CHROMATOGRAPHIES LỌC Trừu tượng hóa: Bioproducts cách ly quy trình phương pháp làm ánh nắng đoạn quan trọng công nghiệp công nghệ sinh học Bromelain en - zim mà có giá trị thương mại lớn quan tâm đến nhiều thứ dược, tiêu hoá, công nghiệp dệt, người khác Mục tiêu nghiên cứu để phát triển phương pháp cho làm bromelain từ phế liệu thân phát sinh từ nông nghiệp chế biến dứa Bromelain làm sử dụng hai sắc ký lỏng bước, trao đổi i - on cộng sắc ký lọc gel Sử dụng phương pháp luận mà phát triển tạo en - zim với trọng lượng phân tử 30 kDa ( xác nhận SDS - Trang ), phục hồi cao hoạt động enzim ( 89% ), với purifi - cation yếu tố 16.93, kết cao phương pháp luận mô tả văn chương HPLC cho thấy diện hai đỉnh cao sắc phổ trao đổi i - on prô - tê - in sắc phổ lọc gel Kết cho thấy, tùy vào nơi đến bromelain, tiến trình bị chặn đứng sau bước làm MALDI - TOF cô miễn dấu vân tay khối pép - tít bromelain MALDI-MS / cô phân mảnh hồ sơ trình tự ion m / z 951 1584 Do đó, kết nối cấu trúc hoá học bromelain xác nhận Hơn nữa, chưa kể mạnh khác phương pháp luận, áp dụng cho lợi dụng nông nghiệp công nghiệp dứa phế liệu © 2014 Elsevier B.V tất quyền bảo lưu Giới thiệu Sự cô lập tinh chế chế phẩm sinh học trình tầm quan-trọng ngành công nghiệp công nghệ sinh học, chiếm 80-90% tổng chi phí sản xuất Hơn nữa, phát triển đơn giản, phương pháp khả thi để lọc protein điều kiện tiên cần thiết cho nhiều tiến công nghệ sinh học (Harikrishna et al., 2002; Costa et al., 2009) Sắc ký lỏng (LC) kỹ thuật thường sử dụng làm protein Tuy nhiên, kỹ thuật phân tích khác sử dụng chiết lỏng-lỏng hệ thống hai pha nước (Babu et al., 2008), đảo ngược hệ thống micellar tách biệt màng tế bào có mưa (Doko et al, 2005 Silveste et al., 2012) Trong sắc ký lỏng, ủng hộ teins dung dịch (pha động) bị cô lập tinh khiết qua tương tác họ với pha tĩnh (Cao, 2005) Nói chung, sản phẩm thu cách lọc LC tốn có giá trị gia tăng cao chi phí vật liệu sử dụng trình sản xuất Sự phát triển lọc LC-chi phí thấp phương pháp thử thách (Costa et al., 2009) Enzyme phân hủy protein, protease, lớp học thủy phân enzyme có khả tách cầu nối peptide chuỗi protein cần thiết trình sinh lý Ngoài ra, thân chọc enzyme có liên quan từ công nghiệp quan điểm tham gia họ số công nghệ ứng dụng (Bon et al., 2008) Bromelain enzyme phân giải protein thuộc cysteine gia đình peptidase Loại enzyme tìm thấy mô nhà máy gia đình Bromeliaceae, dứa (Ananas comosus var comosus) nguồn (Rowan cộng sự, 1990; Hebbar et al, 2008) Bromelain có số ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt thực phẩm, mỹ phẩm dược phẩm ngành công nghiệp, như số ứng dụng lâm sàng, chẳng hạn tác nhân chống ung thư, điều biến đáp ứng miễn dịch tăng cường tác dụng kháng sinh hành động mucolytic tiêu hóa (Maurer, 2001; Bala cộng sự, 2012) Hơn nữa, enzyme có tác dụng tim mạch bệnh tuần hoàn có tiềm sử dụng phẫu thuật thủ tục chăm sóc vết thương (Costa et al., 2009) Các ứng dụng toàn giới bromelain làm tăng tầm quan-tầm xác định phương pháp khai thác tinh chế khả thi cho enzyme Như phương pháp giúp giảm thiểu thiệt hại doanh nghiệp nông nghiệp dứa nông nghiệp công nghiệp chất thải dứa (thân cây, thân răng) giàu enzyme Thông thường, dư lượng không sử dụng điểm đến appropri-ăn (Bardiya et al, 1996; Costa cộng sự, 2009) Do đó, nghiên cứu trình bày phương pháp khả thi cho purifi-cation bromelain từ thân dứa sử dụng LC kỹ thuật Phương pháp 2.1 Vật chất 2.1.1 Chất thải dứa Chất thải dứa từ cv Vitória thu từ Incaper Sooretama Nông trại Thí nghiệm, Sooretama-ES, Braxin 2.1.2 Hoá chất Tất sản phẩm hoá chất dùng nghiên cứu mua từ Xíchma, Merck GE ( USA ) Sản phẩm hoá chất lớp HPLC mua từ Tedia Brazil 2.2 Trích đoạn thô sơ Số lượng biết ( 450 g ) chất thải ( thân cv dứa Vitória ) ngỡ ngàng năm phút với 600 mL giải pháp extrac - tor ( 0.4 M H2SO4 / mm Na2SO4pH 4.5 lúc ◦ C ) Trích đoạn sau lọc centrifuged 14,750 × g cho 20 tối thiểu lúc ◦ C, supernatant ( trích đoạn en - zim thô sơ ) đạt dùng cho exper - iments sau Trích đoạn thô sơ lưu trữ đông cứng - 20 ◦ c 2.3 xác định protein Nồng độ protein từ giải pháp enzym xác định theo phương pháp mô tả Bradford (1976) sử dụng albumin huyết bò tiêu chuẩn 2.4 Hoạt động Bromelain Hoạt động bromelain định theo đơn vị tiêu hoá casein ( CDU ) phương pháp, sử dụng casein chất với có mặt cysteine EDTA Xét nghiệm dựa vào thuỷ phân phân giải prô - tê - in chất casein Độ hấp thu nước lọc rõ ràng ( làm hòa tan casein ) mea - sured 280 nm sử dụng máy trắc quang (Một đơn vị hoạt động bromelain định rõ) Một đơn vị hoạt động bromelain định nghĩa 1G tyrosine phát hành phút ml mẫu casein thủy phân theo điều kiện tiêu chuẩn 37◦C độ pH 7.0 10 phút Các phân tích mẫu thực giải pháp để trống Các đọc nồng độ protein thực ba lần, giá trị trung bình sử dụng cho việc tính toán hiệu khai thác Các hoạt động cụ thể, phục hồi hoạt động (%) lọc lần ước lượng phương trình sau đây: Hoạt động cụ thể = hoạt động phân giải protein (U / ml) /hàm lượng protein (mg / ml) (1) Phục hồi Bromelain (%) = hoạt động bromelain sau lọc bromelain/ hoạt động chiết xuất dầu thô × 100 (2) Thanh lọc lần = hoạt động cụ thể sau làm /hoạt động cụ thể dịch chiết thô (3) 2.5 Sắc ký trao đổi ion Một kính 25 mm cột ID, 110 mm dài đóng gói với caboxymethy-celullose cân với bốn khối lượng cột × 10 mũ -3M Đệm acetate Sau 10 ml dung dịch chiết xuất dầu thô nộp tiếp xúc với nhựa Sau đó, mẫu tách rửa M dung dịch đệm acetate pH 4,5 tỷ lệ 0,5 ml / phút chảy Sau phần thu thập mL phần phân ước Sự diện protein theo dõi cách sử dụng ghi âm quang phổ 280 nm sử dụng đệm acetate pH 4,5 trống Các thủ tục cho việc ước lượng hàm lượng protein hoạt động enzyme mô tả Cuối cùng, cột sau rửa giải pháp M NaCl thêm protein tách rửa Tất thủ tục thực môi trường lạnh 4◦C Enzyme tinh khiết lưu trữ đông lạnh -20◦C 2.6 Sắc ký lọc gel Phần phân ước từ sắc ký trao đổi ion thu thập trình sắc ký lọc gel Một cột thủy tinh với 17,5 mm ID dài 200 mm đóng gói với Sephadex G-50® cân với nửa khối lượng cột đệm acetate Các mẫu áp dụng để tiếp xúc với nhựa cho Các mẫu sau tách rửa với M dung dịch đệm acetate pH 4,5 tốc độ dòng chảy 0,7 ml / phút, rửa giải thu thập mô tả trước viously Cột sau rửa với × 10 -3M acetate pH đệm 4,5 giải pháp thêm protein tách rửa tất thủ tục tiến hành môi trường lạnh 4◦C Enzyme tinh khiết lưu trữ đông lạnh -20◦C (Cabral et al, 2000 Hernández et al., 2005 với thay đổi) 2.7 SDS-PAGE SDS-PAGE thực theo phương pháp Laemmli (1970) sử dụng 15% (w / v) gel polyacrylamide Nhuộm gel thực Coomassie Brilliant Blue G-250 Đo Chromatog-raphy SDS-PAGE thực ba lần 2.8 HPLC A 20? L dịch chất mẫu thu từ việc trao đổi ion sắc ký lọc gel bị phân tích cao sắc ký lỏng hiệu (HPLC) thực Prominence Shi-madzu (Kyoto, Nhật Bản) với máy UV / vis LC-20A phát Các phần tách rửa Shimadzu Shim Gói CLC (M) C18 (dài 4,6 mm ID × 250 mm) cột sử dụng gradient tuyến tính TFA / H2O (1: 1000, v / v) TFA / axetonitril (1: 1000, v / v) 80 phút tốc độ dòng chảy 0,5 ml / phút, độ hấp thụ đọc 280 nm (Hernandez et al., 2005 với thay đổi) 2.9 Khối phổ Các điểm protein quan tâm cắt khỏi gel (Shevchenko et al., 1996) Các vị trí rửa ba lần với dung dịch rửa (1: 1, v / v 25 mM amoni cacbonat-acetonitrile) 25 ◦ C Các giải pháp giặt sau lấy chỗ che phủ acetonitrile cho 20 phút 25 ◦ C Cuối cùng, acetonitrile gỡ bỏ dư thừa bốc hơi, cung cấp, sấy khô chỗ nước hạt gel sau hydrat 10 phút với 10 L tiêu hóa? đệm (25 mM amoni cacbonat) có chứa 20 ng trypsin (trình tự cấp đổi porcin trypsin, Promega, Madison, WI, Hoa Kỳ) Sau, 20? L tiêu hóa đệm thêm vào, mẫu ủ 20 37 ◦ C Kết peptide tryptic hai lần chiết xuất với 50? L 0,1% axit trifluoroacetic (TFA) 50% (v / v) acetonitrile với 20 phút siêu âm Các sản phẩm từ hai chiết xuất kết hợp, máy hút khô sau hòa tan 0,1% TFA 50% (v / v) acetonitrile Ma trận (10 mg / ml CHCA (? -cyano4-hydroxycinnamic acid) 0,1% TFA 50%, v / v acetonitrile) mẫu (1: 1, v / v) phát cocrystallised mục tiêu Matrix hỗ trợ tia laser giải hấp ion hóa thời gian chuyến bay / thời gian chuyến bay hàng loạt spec-trometry (MALDI-TOF / TOF MS, mô hình 4700 Explorer Proteomics Phân tích, Biosystem Ứng dụng ® , Hoa Kỳ) áp dụng để Peptide Khối lượng vân tay (PMF) trình tự peptide Đối với MALDI-MS / MS đo lường, N2 sử dụng khí va chạm tế bào va chạm 2,8 × 10 -6 Torr Peptide autolysis trypsin khối lượng 842,5 2211,1 hiệu chuẩn hỗn hợp (Sequazyme Peptide Thánh Lễ Bộ tiêu chuẩn, hệ thống sinh học PerSeptive ® , Thành phố Foster, CA, USA) sử dụng, tương ứng, tiêu chuẩn nội bên MALDI MS MALDI MS / MS thủ tục Đối với sở liệu tìm kiếm, file PPW trình lên Công cụ tìm kiếm linh vật sử dụng Daemon 2.1.0 (Matrix Khoa học: http://www.matrixscience.com) máy chủ phiên Mascot 2.2.1 Các liệu tìm kiếm với phiên công chúng sở liệu protein không dự phòng Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học-thuật điều khiển (NCBI), tải vào tháng năm 2008, với độ xác khối lượng 15 ppm ion mẹ (MS) 0,2 Đà cho ion mảnh (MALDI MS / MS) Việc tìm kiếm hạn chế đến peptide tryptic với tối đa tách bỏ lỡ Các carbamidomethylation cysteine coi thay đổi cố định, trình oxy hóa methio chín dư lượng coi thay đổi biến ban đầu danh sách protein tạo hình thành sở để biết thêm phân tích Một "danh sách tích cực" tạo có người xem xét protein có chứa peptide (tối thiểu 10 aa) với số điểm 67 Mascot (giá trị p