BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN DUY CHÍ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY CỎ SEO GÀ (Pteris multifida Poir.) THU HÁI TẠI BA VÌ, HÀ NỘI CHUYÊN NGÀNH: Dƣợc học cổ truyền MÃ SỐ: 62720406 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI, năm 2016 CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI: Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Viện Kiểm nghiệm nghiên cứu Dƣợc trang thiết bị y tế Quân đội Trƣờng Đại học Y Hà Nội Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thái An TS Lại Quang Long Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc hội đồng chấm luận án cấp Trƣờng họp trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: Thƣ viện Quốc gia VN Thƣ viện Trƣờng ĐH Dƣợc HN A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Cỏ seo gà (còn có tên Sẹo gà, Phƣợng vĩ thảo) loài thực vật thuộc chi Pteris L Trong y học cổ truyền, Cỏ seo gà đƣợc dùng để chữa lỵ, viêm tử cung, viêm đƣờng tiết niệu, khí hƣ bạch đới, băng lậu, trúng độc, ung thƣ Tuy nhiên, việc sử dụng loài thực vật làm thuốc chữa bệnh chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian Đồng thời, chƣa tìm thấy nhiều công bố thành phần hóa học nhƣ tác dụng sinh học Cỏ seo gà, Việt Nam Do vậy, với mục đích hƣớng đến việc tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học nhƣ tìm hiểu tác dụng sinh học Cỏ seo gà, làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng loài dân gian, luận án: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học Cỏ seo gà (Pteris multifida oi hu h i i Ba Vì, H Nội” đƣợc thực Mục tiêu luận án Mô tả đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học, xác định đặc điểm vi học Cỏ seo gà thu hái a Vì, Hà Nội Nghiên cứu thành phần hóa học bƣớc đầu xây dựng phƣơng pháp định tính số hợp chất Cỏ seo gà sắc ký lỏng hiệu cao Thử độc tính cấp thăm dò số tác dụng sinh học mẫu nghiên cứu Để thực mục tiêu đề ra, luận án đƣợc tiến hành với nội dung sau:  Về thực vật: - Mô tả đặc điểm hình thái giám định tên khoa học loài nghiên cứu thu hái Tản Lĩnh, a Vì, Hà Nội - Tiến hành giải phẫu, mô tả đặc điểm cấu tạo lá, thân rễ; đặc điểm vi học bột lá, bột thân rễ  Về hóa học: - Định tính phản ứng hóa học để xác định nhóm chất có mẫu nghiên cứu - Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc số chất tinh khiết từ mẫu nghiên cứu dựa liệu phổ - Xây dựng phƣơng pháp định tính số hợp chất Cỏ seo gà kiểm chứng phù hợp trình chiết xuất, phân lập  Về tác dụng sinh học: - Đánh giá độc tính cấp mẫu nghiên cứu - Thử tác dụng chống viêm cấp mạn tính, tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa, tác dụng ức chế số dòng tế bào ung thƣ loài nghiên cứu Những đóng góp luận án 3.1 Về thực vật Đã giám định tên khoa học loài nghiên cứu thu hái Tản Lĩnh, a Vì, Hà Nội; mô tả chi tiết đặc điểm thực vật; đặc điểm vi học phần mặt đất thân rễ 3.2 Về thành phần hóa học - Đã định tính đƣợc nhóm chất flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đƣờng khử, sterol loài Pteris multifida Poir - Đã chiết xuất, phân lập nhận dạng cấu trúc hóa học 11 hợp chất từ loài nghiên cứu Trong số hợp chất phân lập đƣợc, có hợp chất lần phân lập đƣợc từ chi Pteris L là: PM3, PM9, PM12, PM25 PM26; hợp chất lần phân lập đƣợc từ loài Pteris multifida Poir là: PM1, PM4, PM11, PM15 PM18 - Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính đồng thời hợp chất PM3, PM9, PM12, PM15 PM18 Cỏ seo gà sắc ký lỏng hiệu cao với cột pha đảo Zorbax Eclipse XBD C18 (250 mm  4,6 mm, µm), detector UV bƣớc sóng 265nm, pha động acetonitril – nƣớc (có 0,1% acid formic) với chƣơng trình gradient dung môi 30 phút 3.3 Về tác dụng sinh học - Đã thử độc tính cấp cao nƣớc Cỏ seo gà xác định đƣợc LD50 Cỏ seo gà 212,0 g dƣợc liệu/kg cân nặng (178,06 - 228,67 g/kg) - Đã xác định đƣợc cao nƣớc Cỏ seo gà hai mức liều 7,2 g 21,6 g dƣợc liệu/kg cân nặng chuột nhắt trắng có tác dụng chống viêm cấp chống viêm mạn tính Hầu nhƣ chƣa thể tác dụng bảo vệ gan mô hình gây độc gan paracetamol liều 400 mg/kg cân nặng Với mức liều, dƣợc liệu có xu hƣớng chống oxy hóa thể qua việc làm giảm nồng độ MDA dịch đồng thể gan (p > 0,05) Tuy nhiên thử nghiệm in vitro, Cỏ seo gà thể tác dụng chống oxy hóa qua thử nghiệm quét gốc tự DPPH gốc hydroxyl tùy thuộc vào phân đoạn - Cắn phân đoạn ethyl acetat Cỏ seo gà hợp chất PM9 có tác dụng ức chế phát triển dòng tế bào MCF7 với IC50 tƣơng ứng 64,50 μg/ml 34,38 μg/ml Trên dòng tế bào ung thƣ cổ tử cung (HeLa) ung thƣ dày (N87) mẫu thử tác dụng Ý nghĩa luận án - Giám định tên khoa học mẫu dƣợc liệu giúp cho kết nghiên cứu hóa học tác dụng sinh học có rõ nguồn gốc - Xác định đặc điểm vi học góp phần tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu - Kết nghiên cứu thành phần hóa học phát hợp chất lần đƣợc phân lập từ chi Pteris L từ loài Pteris multifida Poir., sở khoa học tiếp tục cho hƣớng nghiên cứu tác dụng sinh học dựa thành phần hoạt chất có dƣợc liệu - Xây dựng phƣơng pháp định tính số hợp chất phân lập từ dƣợc liệu bƣớc đầu góp phần đại hóa tiêu chuẩn kiểm nghiệm dƣợc liệu Cỏ seo gà - Kết thử độc tính tác dụng sinh học chứng minh dƣợc liệu không gây độc mức liều nghiên cứu (phù hợp với mức liều thƣờng dùng) góp phần giải thích kinh nghiệm sử dụng dân gian Là sở khoa học để ứng dụng rộng rãi việc sử dụng dƣợc liệu điều trị bệnh mức liều phù hợp, cho hiệu điều trị tốt Bố cục luận án Luận án gồm chƣơng, 38 bảng, 47 hình, 149 tài liệu tham khảo, 15 phụ lục Luận án có 140 trang gồm phần chính: Đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (39 trang), nguyên vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu (19 trang), kết nghiên cứu (55 trang), bàn luận (22 trang), kết luận kiến nghị (3 trang) B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 1 Họ R ng seo g ( e idaceae 1.1.1.1 Vị trí phân loại, phân bố  Về vị trí phân loại: Họ Ráng seo gà gọi họ Seo gà, Cỏ seo gà họ lớn ngành dƣơng xỉ Theo phân loại nhiều tác giả, họ Ráng seo gà (Pteridaceae) thuộc Ráng dực xỉ (Pteridales), lớp Ráng đa túc (Polypodiopsida), ngành Dƣơng xỉ (Polypodiophyta)  Về phân bố: Họ Ráng seo gà gồm phân họ, 50 chi với khoảng 950 loài, phân bố rộng rãi giới Việt Nam có 12 chi với khoảng 150 loài, mọc hoang, số loài đƣợc sử dụng làm thuốc 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật Các tài liệu tham khảo mô tả tổ hợp đặc điểm đặc trƣng họ Ráng seo gà thảo, mọc gần đất, thân rễ có nhiều lông hay vảy Lá giống hay có loại: sinh sản không sinh sản Lá kép lông chim hay chia thùy đặn, xẻ ngón Gân nối với hình vành khuyên Ổ túi bào tử mép lá, liên tục, đặt nhánh nối đầu gân, che chở áo mép gập lại Vòng giới không đầy đủ, qua chân 1.1.2 Chi Pteris L 1.1.2.1 Vị trí phân loại Chi Pteris L thuộc họ Ráng seo gà (Pteridaceae), theo tài liệu tham khảo vị trí phân loại chi đƣợc tóm tắt nhƣ sau: Ngành Dƣơng xỉ (Polypodiophyta) Lớp Ráng đa túc (Polypodiopsida) Bộ Ráng dực xỉ (Pteridales) Họ Ráng seo gà (Pteridaceae) Chi Pteris L 1.1.2.2 Đặc điểm chung chi Pteris L Các thuộc chi Pteris L thảo, thân rễ mọc bò, mọc sát Lá giống có loại Lá lần kép 2-3 lần kép, cuống mang phụ to phụ với thùy dài, thùy đều, nhiều, gân nối với tạo hình vành khuyên Ổ túi bào tử mép vành khuyên, có áo mép gập lại, liền thành dải liên tục Bào tử hình tứ diện hình cầu, màu nâu nhạt đen, có u sần Trên giới, chi Pteris L có tới 280 -300 loài, chi lớn số loài thuộc họ Pteridaceae Khu vực phân bố chủ yếu chúng vùng khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới nhƣ: Trung Quốc, Nhật ản, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam, Lào, Ở Việt Nam, chi Pteris L có khoảng 28-30 loài Một số loài đại diện nhƣ: Pteris cretica L.; Pteris ensiformis Burm.; Pteris multifida Poir.; Pteris semipinnata L.; Pteris vittata L đƣợc phân bố từ Bắc vào Nam: Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Bình, Cần Thơ, Phan Rang , từ bình nguyên đến cao nguyên 1.1.3 Pteris multifida Poir 1.1.3.1 Đặc điểm thực vật loài Pteris multifida Poir Tên Việt Nam: Cỏ seo gà, Phƣợng vĩ thảo, Kê cƣớc thảo, Sẹo gà, Chân xỉ nhiều khía, Ráng seo gà chẻ nhiều Tên đồng nghĩa: Pteris serrulata L Cây cỏ, cao 30-50 cm (có thể hơn), thân rễ nhỏ, ngắn, mọc bò Lá mọc thẳng từ thân rễ, xẻ sâu hình lông chim hai lần, nhẵn, gân rõ Cây có hai loại lá: không sinh sản ngắn, có cuống mang dài 6-12 cm, phiến dài từ 8-25 cm, màu lục nhạt vàng, thùy to nhỏ không mọc đối nhau, mép khía có đầu tròn, riêng thùy tận thuôn dài hình mũi nhọn; sinh sản có cuống dài 10-50 cm, phiến dài 10-40 cm, màu đen gồm thùy hình dải thuôn uốn éo, mọc đối, đầu nhọn hoắt Cuống dài, màu nâu nhạt gốc, vàng phía Hai bên mép nhiều sinh sản gập lại mang quan sinh sản gọi ổ nang (túi bào tử) dày đặc Lá hình dáng nhìn giống nhƣ lông seo đuôi gà hay đuôi phƣợng nên có tên Cỏ seo gà hay phƣợng vĩ thảo tử hình bốn cạnh, tròn, màu vàng nhạt có nhiều u sần nhỏ Mùa sinh sản: tháng - tháng 10 1.1.3.2 Phân bố, sinh thái Cỏ seo gà phân bố tự nhiên khắp khu vực Đông Đông ắc Á Ở Việt Nam, Cỏ seo gà phân bố rộng từ đồng bằng, đồi đến vùng núi thấp Lào Cai, Hà Giang, Cao ằng, Lạng Sơn, Quảng ình, Huế đến Lâm Đồng Cỏ seo gà có khả sống khỏe, tồn đƣợc nhiều loại đất, kể nơi đất cằn cỗi, hay đất nhiều loại đá mẹ khác (đá vôi, phiến sét, bazan,…) phong hóa Cây thƣờng mọc thành khóm, thành đám ven nƣơng rẫy, ven đƣờng bìa rừng, hốc đá dƣới chân núi đá Ở đồng bằng, Cỏ seo gà mọc chân tƣờng gạch, đƣờng làng Cây tái sinh chủ yếu nhờ đẻ nhánh mẹ nảy mầm từ bào tử 1.1.3.3 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến Toàn Cỏ seo gà đƣợc thu hái, rửa sạch, phơi khô Nƣớc tƣơi dùng bôi có tác dụng chữa bỏng Có thể dùng khô sắc uống ngâm rƣợu uống dùng cách lấy tƣơi giã nát nghiền thành bột trộn với dầu vừng 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC Th nh phần hóa học mộ số lo i huộc chi Pteris L Theo số tài liệu tham khảo, thành phần hóa học chi Pteris L bao gồm: flavonoid; ent-kauran; terpenoid; pterosin-sesquiterpen hợp chất phenolic Các nhà khoa học phân lập đƣợc 28 hợp chất thuộc nhóm pterosin, ent-kauran flavonoid từ loài Pteris cretica L.; 26 hợp chất thuộc nhóm pterosin, flavonoid, acid hữu β-sitosterol từ loài Pteris ensiformis Burm.; 26 hợp chất thuộc nhóm pterosin ent-kauran từ loài Pteris semipinnata L 2 Th nh phần hóa học Cỏ seo g (Pteris multifida Poir.) Từ loài Pteris multifida Poir., nhà khoa học phân lập đƣợc khoảng 70 hợp chất thuộc nhóm pterosin, flavonoid, ent-kauran, terpenoid, acid hữu cơ, số hợp chất phenolic β-sitosterol 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC Trên giới Việt Nam, số loài thuộc chi Pteris L đƣợc sử dụng làm thuốc chữa bệnh, phổ biến dạng thuốc sắc, thuốc đắp, có loài Pteris multifida Poir Theo tài liệu thu thập đƣợc, tác dụng sinh học công dụng chữa bệnh chi Pteris L loài Pteris multifida Poir gồm: tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa, chống viêm, chống đột biến, ung thƣ, hạ lipid máu, kháng khuẩn kháng nấm 1.4 CÔNG DỤNG CỦA CỎ SEO GÀ VÀ MỘT SỐ ÀI THUỐC Công dụng Theo Đông y, Cỏ seo gà có vị đắng ngọt, tính lạnh, có tác dụng nhiệt, tiêu viêm, lợi tiểu, mát máu, cầm lỵ Toàn Cỏ seo gà đƣợc dùng chữa lỵ mãn tính, lỵ trực khuẩn, viêm ruột, viêm đƣờng tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nƣớc bọt, sƣng vú, mụn nhọt, lở ngứa, bệnh da Nƣớc tƣơi có tác dụng chữa bỏng Mộ số b i huốc  Bài thuốc chữa lỵ trực khuẩn: - ài 1: Rễ Seo gà thơm 24 g, nƣớc 100 ml, đun sôi 30 phút Chia hay lần uống ngày - ài 2: Chè tƣơi 100 g, Seo gà khô 24 g, nƣớc 150 ml, đun sôi 30 phút Chia hay lần uống ngày  Bài thuốc chữa lỵ amip: - ài 1: Cỏ seo gà (toàn thân), dây mơ lông, rễ cỏ tranh, rễ phèn đen, vị 20 g; gừng sống lát, sắc uống làm 2-3 lần ngày vào lúc đói - ài 2: Cỏ seo gà 30 g, vỏ sắn thuyền 12 g, cám gạo rang vàng g đậu đen rang cháy 20 g, sắc uống, chia làm lần ngày - ài 3: chữa kiết lỵ máu, mủ: Cỏ seo gà 40 g, dây mơ lông 30 g, binh lang 10 g, phèn đen 30 g, hàn the 10 g Sắc với bát nƣớc, bát rƣỡi chia lần uống Ngày sắc uống 4-5 lần kiêng mỡ, kiêng CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HƢƠNG HÁ NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Nguyên liệu nghiên cứu Cỏ seo gà (Pteris multifida Poir.) đƣợc thu hái vào tháng 10 năm 2012 Ba Vì, Hà Nội, sấy khô 50oC làm mẫu nghiên cứu đặc điểm vi học Toàn chiết thành cao nƣớc (3,6:1) chiết methanol phân đoạn dùng để thử tác dụng sinh học nghiên cứu thành phần hóa học - Các hóa chất, thuốc thử, thuốc đối chứng - Các thiết bị phân tích, máy đo phổ MS, NMR, - Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, hai giống, khỏe mạnh, khối lƣợng khoảng 20 g Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp - Các dòng tế bào ung thƣ: tế bào ung thƣ cổ tử cung (HeLa), tế bào ung thƣ vú (MCF7), tế bào ung thƣ dày (N87) 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nghiên cứu thực vật - Quan sát mô tả đặc điểm hình thái thực vật thực địa Giám định tên khoa học sở phân tích đặc điểm hình thái, đặc điểm phận sinh sản, so sánh với tiêu lƣu trữ tài liệu phân loại thực vật với giúp đỡ chuyên gia thực vật - Nghiên cứu đặc điểm vi học: cắt làm tiêu vi phẫu, soi bột lá, bột thân rễ loài nghiên cứu, quan sát đặc điểm, mô tả chụp ảnh tiêu 2.2.2 Nghiên cứu h nh phần hóa học - Định tính nhóm chất hữu dịch chiết toàn phần phản ứng hóa học đặc trƣng sắc ký lớp mỏng - Chiết xuất methanol tách thành phần phƣơng pháp chiết lỏnglỏng với dung môi có độ phân cực tăng dần - Phân lập hợp chất phƣơng pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel (0,040-0,063 mm, Merck), chất hấp phụ pha đảo ODS (YMC 30-50 m, Nhật), hạt Diaion HP-20 Sephadex LH-20 - Xác định độ tinh khiết hợp chất SKLM, HPLC xây dựng phƣơng pháp định tính số hợp chất dƣợc liệu HPLC - Nhận dạng hợp chất phân lập đƣợc dựa vào liệu phổ MS, NMR, so sánh với liệu phổ có thƣ viện phổ tài liệu thu thập đƣợc 2 Nghiên cứu c dụng sinh học - Thử độc tính cấp xác định LD50 theo phƣơng pháp Litchfield – Wilcoxon - Đánh giá tác dụng chống viêm cấp theo mô hình gây phù chân chuột carragenin - Đánh giá tác dụng chống viêm mạn theo mô hình gây u hạt thực nghiệm chuột sợi amiant - Đánh giá tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa mô hình gây tổn thƣơng gan động vật thực nghiệm paracetamol - Đánh giá khả chống oxy hóa in vitro thử nghiệm hoạt tính quét gốc tự DPPH hydroxyl - Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thƣ phƣơng pháp MTS in vitro - Các số liệu thực nghiệm đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm thống kê Graphpad Prism 5.0 Microsoft Excel CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT 1 Đặc điểm thực vậ v gi m định tên khoa học Mô tả chi tiết đầy đủ phận thân rễ, không sinh sản, sinh sản, ổ túi, túi bào tử bào tử loài nghiên cứu, so sánh với tiêu lƣu trữ phòng Tiêu Quốc gia Việt Nam, viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, đối chiếu với khóa phân loại tham khảo tài liệu, giám định tên khoa học loài nghiên cứu thu hái Ba Vì, Hà Nội Pteris multifida Poir., họ Ráng seo gà (Pteridaceae), tên Việt Nam Cỏ seo gà, Phƣợng vĩ thảo, Sẹo gà Đặc điểm vi học 3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu * Cấu tạo giải phẫu lá: Phần gân lá: Phía có mép rìa nhô ra, lõm vào, phía dƣới lồi nhiều iểu bì biểu bì dƣới cấu tạo lớp tế bào nhỏ xếp liên tục, đặn, có mang lông tiết chân đơn bào ngắn, đầu tròn gồm tế bào Mô mềm gồm tế bào thành mỏng, hình tròn, đa giác xếp lộn xộn Nội bì gồm hàng tế bào hình chữ nhật nối với thành hình tròn ôm lấy bó libe-gỗ nằm gân Ngay sát lớp nội bì lớp trụ bì cấu tạo 1-2 lớp tế bào hình tròn, đa giác bao bọc lấy bó libe gỗ Libe gồm tế bào màu hồng đậm xếp giống hình tim nằm sát lớp trụ bì, tạo thành vòng bao quanh gỗ Mô gỗ hình chữ V Phần phiến lá: Vi phẫu phiến bên dƣới có biểu bì lớp tế bào xếp sát nhau, đặn Bên tế bào mô mềm gồm nhiều lớp tế bào hình gần nhƣ tròn Phần cuống lá: Vi phẫu cuống có mặt cắt hình vuông lồi góc Từ vào có biểu bì lớp tế bào xếp sát vào nhau, đặn Màng có lớp cutin mỏng bao bọc có mang lông tiết Mô mềm gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác, có góc tròn, góc có khoảng gian bào nhỏ Trụ bì hàng tế bào hình tròn, đa giác xếp sát giống hình tim bao quanh bó libe-gỗ ên trụ bì lớp nội bì bao gồm tế bào hình chữ nhật, bắt màu hồng xếp đặn, ngăn cách mô mềm bó trụ ó libe-gỗ nằm sát bên trụ bì Libe nằm gồm tế bào màu hồng đậm xếp sát tạo thành hình trái tim bao quanh mô gỗ Mô gỗ gồm tế bào bắt màu xanh có hình chữ V * Cấu tạo giải phẫu thân rễ Lớp biểu bì Mô mềm gồm tế bào thành mỏng, xếp không Có 35 bó libe-gỗ không nhau, hình elip Mỗi bó đƣợc bao quanh lớp trụ bì gồm 1-2 hàng tế bào bắt màu hồng hình tròn, đa giác xếp sát thành hình elip, tròn hay trái tim Bao bọc bên lớp trụ bì lớp nội bì bao gồm hàng tế bào bắt màu hồng nhạt, hình chữ nhật xếp đặn Libe nằm bên sát lớp trụ bì gồm tế bào bắt màu hồng đậm nội bì xếp sát bao quanh mô gỗ Mô gỗ gồm tế bào bắt màu xanh có kích thƣớc khác nằm bó libe-gỗ Từ liệu phổ MS, NMR chiều chiều, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất PM4 Steringlykosid hay 2-desoxy-D-glucose βsitosterin  Hợp chất PM9: phân lập đƣợc dƣới dạng bột màu vàng nhạt, tan ethanol, methanol, DMSO UV λmax (MeOH): 265, 328, 343 nm Trên phổ khối lƣợng ESI-MS PM9 thấy xuất pic ion giả phân tử m/z 577,5 [M - H]- tƣơng ứng với hợp chất có công thức phân tử C27H30O14 Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δppm: 6,45 (1H, d, J=2,0 Hz, H6); 6,47 (1H, d, J=2,0 Hz, H8); 7,79 (1H, d, J=9,0 Hz, H2’); 6,92 (1H, d, J=8,5 Hz, H3’); 6,92 (1H, d, J=8,5 Hz, H5’); 7,79 (1H, d, J=9,0 Hz, H6’); 5,30 (1H, s, H1”); 3,16 (1H, m, H2”); 3,43 (1H, m, H3”); 3,31 (1H, m, H4”); 3,31 (1H, m, H5”); 0,81 (3H, d, J=5,5 Hz, H6”); 5,54 (1H, s, H1’”); 3,16 (1H, m, H2’”); 3,16 (1H, m, H3’”); 3,31 (1H, m, H4’”); 3,63 (1H, m, H5”’); 1,13 (3H, d, J=6,5 Hz, H6”’) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δppm: 157,89 (C2); 134,66 (C3); 178,02 (C4); 161,80 (C5); 99,52 (C6); 161,80 (C7); 94,70 (C8); 156,22 (C9); 105,88 (C10); 120,48 (C1’); 130,79 (C2’); 115,48 (C3’); 160,19 (C4’); 115,48 (C5’); 130,49 (C6’); 101,96 (C1”); 70,76 (C2”); 70,31 (C3”); 71,23 (C4”); 71,23 (C5”); 17,50 (C6”); 98,53 (C1”’); 70,76 (C2”’); 70,76 (C3”’); 71,23 (C4’”); 70,31 (C5”’); 17,94 (C6”’) Từ liệu phổ MS, NMR chiều; phổ hai chiều HMBC HSQC, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất PM9 kaempferol -3,7-diO-α-L-rhamnopyranosid hay có tên kaempferitrin  Hợp chất PM11: phân lập đƣợc dƣới dạng bột màu vàng nhạt Phổ khối lƣợng APCI-MS PM11 xuất pic ion giả phân tử m/z 449,0 tƣơng ứng với hợp chất có công thức phân tử C21H20O11 [M + H]+ Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 6,23 (1H, d, J=2,0 Hz, H6); 6,42 (1H, d, J=2,0 Hz, H8); 8,07 (1H, d, J=9,0 Hz, H2’); 6,91 (1H, d, J=9,0 Hz, H3’); 6,91 (1H, d, J=9,0 Hz, H5’); 8,07 (1H, d, J=9,0 Hz, H6’); 5,26 (1H, d, J=7,5 Hz, H1”); 3,45 (1H, m, H2”); 3,34 (1H, m, H3”); 3,37 (1H, m, H4”); 3,45 (1H, m, H5”); 3,71 (1H, dd, J=2,0, 11,5 Hz, Ha-6”); 3,52 (1H, dd, J=5,5, 12,0 Hz, Hb-6”) Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 159,07 (C2); 135,47 (C3); 179,51 (C4); 163,09 (C5); 100,03 (C6); 166,42 (C7); 94,85 (C8); 158,57 (C9); 105,65 (C10); 122,83 (C1’); 132,27 (C2’); 116,09 (C3’); 161,58 (C4’); 116,09 (C5’); 132,27 (C6’); 104,14 (C1”); 75,75 (C2”); 78,42 (C3”); 71,38 (C4”); 78,07 (C5”); 62,65 (C6”) Từ liệu phổ MS, NMR kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo cho phép kết luận PM11 kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid hay gọi astragalin 11  Hợp chất PM12: phân lập đƣợc dƣới dạng bột màu trắng Trên phổ khối lƣợng ESI-MS PM12 xuất pic ion giả phân tử m/z 139,1 tƣơng ứng với hợp chất có công thức phân tử C7H6O3 [M + H]+ Trên phổ 1H-NMR xuất tín hiệu proton thơm δH 7,32 (1H, sbr, H2), 6,94 (1H, d, J=8,0 Hz, H5) 7,33 (1H, dd, J=8,0 Hz, 1,5 Hz chồng chập với tín hiệu 7,32, H6) gợi ý vòng benzen kiểu 1, 3, Tín hiệu đặc trƣng nhóm aldehyd (CHO) quan sát thấy vị trí cộng hƣởng δH 9,71 (s) Quan sát phổ 13CNMR phổ DEPT cho thấy xuất tín hiệu carbon, có tín hiệu carbon vòng thơm vị trí cộng hƣởng δC 130,84; 119,46; 153,74; 147,19; 116,26 126,40 tƣơng ứng với C1, C2, C3, C4, C5 C6 nhóm carbonyl nhóm aldehyd δC 193,11 Các kiện phổ cho phép nghĩ đến cấu trúc vòng benzen 1, 3, 4; có nhóm hydroxy nhóm aldehyd So sánh với liệu công bố tài liệu tham khảo thấy phù hợp vị trí tƣơng ứng Từ liệu cho phép khẳng định PM12 3,4-dihydroxy benzaldehyd  Hợp chất PM15: phân lập đƣợc dƣới dạng bột màu vàng UV λmax (MeOH): 265 nm 344 nm Phổ khối lƣợng ESI-MS PM15 thấy xuất pic ion giả phân tử m/z 595,1 [M+H]+ tƣơng ứng với hợp chất có công thức phân tử C27H30O15 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 6,51 (1H, d, J=2,0 Hz, H6); 6,76 (1H, d, J=2,0 Hz, H8); 7,82 (1H, d, J=9,0 Hz, H2’); 6,97 (1H, d, J=8,0 Hz, H3’); 6,97 (1H, d, J=8,0 Hz, H5’); 7,82 (1H, d, J=9,0 Hz, H6’); 5,42 (1H, d, J=1,5 Hz, H1”); 3,36 (1H, m, H2”); 3,74 (1H, m, H3”); 3,36 (1H, m, H4”); 3,74 (1H, m, H5”); 0,96 (3H, d, J=6,0 Hz, H6”); 5,09 (1H, d, J=7,0 Hz, H1”’); 3,52 (1H, m, H2”’); 3,54 (1H, m, H3”’); 3,36 (1H, m, H4”’); 3,54 (1H, m, H5”’); 3,74 (1H, m, Ha-6”’); 3,97 (1H, dd, J=12,0, 2,0 Hz, Hb-6”’) Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 159,85 (C2); 136,46 (C3); 179,80 (C4); 162,80 (C5); 100,86 (C6); 164,66 (C7); 95,82 (C8); 158,00 (C9); 107,69 (C10); 122,42 (C1’); 132,02 (C2’); 116,57 (C3’); 161,75 (C4’); 116,57 (C5’); 132,02 (C6’); 103,48 (C1”); 71,27 (C2”); 72,07 (C3”); 73,17 (C4”); 71,89 (C5”); 17,64 (C6”); 101,58 (C1”’); 74,71 (C2”’); 77,81 (C3”’); 72,12 (C4”’); 78,36 (C5”’); 62,46 (C6”’) Từ liệu phổ MS, NMR chiều; phổ HMBC HSQC, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất PM15 kaempferol-3-O-α-Lrhamnopyranosid-7-β-D-glucopyranosid  Hợp chất PM18: phân lập đƣợc dƣới dạng bột màu vàng, UV λmax (MeOH): 227 nm, 265 nm 344 nm Phổ khối lƣợng ESI-MS PM18 thấy xuất pic ion giả phân tử m/z 725,1 [M-H]- tƣơng ứng với hợp chất có công thức phân tử C32H38O19 12 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 6,48 (1H, d, J=2,0 Hz, H6); 6,75 (1H, d, J=2,0 Hz, H8); 7,83 (1H, d, J=8,0 Hz, H2’); 6,96 (1H, d, J=8,0 Hz, H3’); 6,96 (1H, d, J=8,0 Hz, H5’); 7,83 (1H, d, J=8,0 Hz, H6’); 5,42 (1H, d, J=1,5 Hz, H1”); 4,24 (1H, dd, J=1,5, 3,0 Hz, H2”); 3,97 (1H, d, J=1,5 Hz, H3”); 3,44 (1H, m, H4”); 3,65 (1H, m, H5”); 0,96 (3H, d, J=6,0 Hz, H6”); 5,16 (1H, d, J=7,5 Hz, H1”’); 3,71 (1H, m, H2”’); 3,43 (1H, m, H3”’); 3,36 (1H, m, H4”’); 3,64 (1H, m, H5”’); 3,74 (1H, m, Ha-6”’); 3,97 (1H, d, J=1,5 Hz, Hb-6”’); 5,47 (1H, d, J=2,0 Hz, H1””); 4,05 (1H, d, J=10,0 Hz, H2””); 3,83 (1H, d, J=10,0 Hz Ha-4””); 4,05 (1H, d, J=10,0 Hz, Hb-4””); 3,56 (2H, brs, H5””) Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 159,89 (C2); 136,46 (C3); 179,81 (C4); 163,00 (C5); 100,70 (C6); 164,53 (C7); 95,73 (C8); 158,12 (C9); 107,90 (C10); 122,39 (C1’); 132,04 (C2’); 116,59 (C3’); 161,81 (C4’); 116,57 (C5’); 132,04 (C6’); 103,48 (C1”); 71,29 (C2”); 72,13 (C3”); 73,17 (C4”); 71,90 (C5”); 17,65 (C6”); 100,18 (C1”’); 78,26 (C2”’); 78,76 (C3”’); 72,13 (C4”’); 78,41 (C5”’); 62,40 (C6”’); 110,89 (C1””); 78,15 (C2””); 80,70 (C3””); 75,42 (C4””); 65,86 (C5””) Quan sát phổ 1H-NMR 13C-NMR PM18 thấy tƣơng đồng cấu trúc phân tử hợp chất PM15 Dựa vào kết phân tích phổ hai chiều HSQC, HMBC so sánh liệu với tài liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất PM18 kaempferol3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apio -furanosyl -(1-2)-β-D-glucopyranosid  Hợp chất PM23: phân lập đƣợc dƣới dạng bột màu trắng Trên phổ khối lƣợng ESI-MS PM23 thấy xuất pic ion giả phân tử m/z 449,2 [M+Na]+ tƣơng ứng với hợp chất có công thức phân tử C21H30O9 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 4,87 (1H, s, H3); 7,43 (1H, s, H4); 1,11 (3H, s, H10); 3,62 (1H, d, J=11,0 Hz, Ha-11); 3,69 (1H, d, J=11,5 Hz, Hb-11); 2,38 (3H, s, H12); 2,91 (2H, t, J=8,0 Hz, H13); 3,51 (2H, t, J=8,0 Hz, H14); 2,56 (3H, s, H15); 4,57 ( 1H, d, J=7,5 Hz, H1’); 3,49 (1H, d, J=9,0 Hz, H2’); 3,21 (1H, m, H3’); 3,29 (1H, m, H4’); 3,29 (1H, m, H5’); 3,84 (2H, dd, J=2,0, 12,0 Hz, H6’) Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 209,43 (C1); 57,27 (C2); 85,10 (C3); 126,43 (C4); 146,28 (C5); 138,64 (C6); 137,96 (C7); 132,77 (C8); 152,50 (C9); 18,70 (C10); 67,10 (C11); 21,42 (C12); 33,06 (C13); 61,58 (C14); 14,17 (C15); 105,60 (C1’); 77,87 (C2’); 75,13 (C3’); 71,63 (C4’); 78,18 (C5’); 62,69 (C6’) Từ liệu phổ MS, NMR chiều chiều đồng thời so sánh liệu với tài liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất PM23 có tên 2R,3R-pterosin L 3-O-β-Dglucopyranosid 13 PM1: 2-(1,2-dihydroxyethyl)furan PM3: maltol 3-O-β-Dglucopyranosid PM4: steringlykosid PM9: kaempferitrin OH 3' 4' 2' HO 1' O 6' 10 5' 6" O O OH 4" OH OH 2'' 3" 1'' OH 5" O HO PM11: kaempferol -3-O-β-D-glucopyranosid PM12: 3,4-dihydroxy benzaldehyd PM15: kaempferol-3-O-α-Lrhamnopyranosid-7-β-Dglucopyranosid PM18: kaempferol-3-O-α-Lrhamnopyranosid-7-O-[α-D-apio furanosyl -(1-2)-β-D-glucopyranosid 11 O 10 12 OH 13 HO OH HO PM25: blumenyl A β-D-glucopyranosid PM23: 2R,3R-pterosin L 3-O-β-D-glucopyranosid O 2' 4' O O HO 3' 7' 2' 9' 8' 1' O O 6' 5' HO O HO O O 6'' 4'' HO HO 5'' 2'' OH 1" 3'' PM26: bockiosid B 14  Hợp chất PM25: phân lập đƣợc dƣới dạng bột màu trắng Phổ khối lƣợng ESI-MS xuất pic ion giả phân tử m/z 409,2 [M+Na]+ tƣơng ứng với hợp chất có công thức phân tử C19H30O8 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 2,17 (1H, d, J=17,0 Hz, Ha-2) 2,54 (1H, d, J=17,0 Hz, Hb-2); 5,89 (1H, m, H4); 5,89 (1H, m, H7); 5,89 (1H, m, H8); 4,44 (1H, m, H9); 1,32 (3H, s, H10); 1,06 (3H, d, J=3,5 Hz, H11); 1,06 (3H, d, J=3,5 Hz, H12); 1,94 (3H, d, J=1,5 Hz, H13); 4,36 (1H, d, J=8,0 Hz , H1’) proton vùng đƣờng khoảng 3,17-3,88 ppm Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 42,43 (C1); 50,71 (C2); 201,20 (C3); 127,19 (C4); 167,25 (C5); 80,01 (C6); 135,29 (C7); 131,56 (C8); 77,28 (C9); 21,18 (C10); 19,55 (C11); 23,43 (C12); 24,69 (C13); 102,76 (C1’); 75,27 (C2’); 78,14 (C3’); 71,68 (C4’); 78,04 (C5’); 62,85 (C6’) Từ liệu phổ MS, NMR, đồng thời so sánh liệu với tài liệu tham khảo hợp chất PM25 đƣợc xác định blumenyl A β-D-glucopyranosid  Hợp chất PM26: phân lập đƣợc dƣới dạng bột màu trắng Trên phổ khối lƣợng ESI-MS PM26 thấy xuất pic ion giả phân tử m/z 473,1 [M+Na]+ tƣơng ứng với hợp chất có công thức phân tử C21H22O11 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm: 6,53 (1H, d, J=5,5 Hz, H5); 8,10 (1H, d, J=5,5 Hz, H6); 5,41 (2H, s, H7); 7,50 (2H, d, J=8,5 Hz, H2’/H6’); 6,83 (1H, d, J=8,5 Hz, H3’/H5’); 7,70 (1H, d, J=16,5 Hz, H7’); 6,40 (1H, d, J=18,0 Hz, H8’) ; 4,98 (1H, d, J=7,5 Hz, H1”) proton vùng đƣờng khoảng δH 3,28-3,87 ppm Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 161,55 (C2); 143,79 (C3); 177,19 (C4); 117,94 (C5); 157,51 (C6); 59,19 (C7); 126,99 (C1’); 131,38 (C2’); 116,89 (C3’); 159,56 (C4’); 116,89 (C5’); 131,38 (C6’); 147,76 (C7’); 113,98 (C8’); 168,35 (C9’); 104,59 (C1”); 75,32 (C2”); 77,86 (C3”); 71,11 (C4”); 78,59 (C5”); 62,52 (C6”) Từ liệu phổ MS, NMR so sánh liệu với tài liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất PM26 bockiosid B 3.2.3 Bƣớc đầu xây dựng phƣơng ph p định tính mộ số h nh phần ong Cỏ seo gà Nghiên cứu định tính hợp chất PM3, PM9, PM12, PM15 PM18 dƣợc liệu phƣơng pháp HPLC 3.2.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký Sau khảo sát loại cột C18 với nhiều kích thƣớc hạt, chiều dài cột nhiều hệ dung môi tốc độ dòng khác nhau, điều kiện sắc ký đƣợc lựa chọn nhƣ sau: + Cột: Zorbax Eclipse X D C18 (250 mm  4,6 mm; µm) 15 + Pha động: Sử dụng hệ pha động acetonitril (kênh A) nƣớc có 0,1% acid formic (kênh ) với chế độ gradient dung môi Tỷ lệ A: sử dụng ban đầu (5:95), thay đổi tuyến tính đến (9:91) phút thứ 4, thay đổi tuyến tính đạt (16:84) phút thứ 5, trì đến phút thứ 12, sau tiếp tục thay đổi tuyến tính tới (28:72) phút thứ 22, thay đổi tuyến tính trở tỷ lệ ban đầu (5:95) phút 29, trì đến phút 30 + Detector UV bƣớc sóng 265 nm + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Thể tích tiêm: 20 l 3.2.3.2 Thẩm định phương pháp định tính số hợp chất Cỏ seo gà Kết thẩm định cho thấy phƣơng pháp có độ đặc hiệu cao, pic tách tốt, độ lặp lại hệ thống tốt với độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD thời gian lƣu diện tích pic chất từ 0,07%-0,18% 0,65%-1,11% Giới hạn phát chất từ 0,13 µg/ml-0,18 µg/ml 3.2.3.3 Kết định tính số hợp chất phân đoạn chiết xuất từ Cỏ seo gà Áp dụng phƣơng pháp để định tính thành phần phân đoạn chiết xuất Cỏ seo gà Kết cho thấy cắn cloroform có chất PM9, PM12 PM18; cắn ethyl acetat cắn methanol có chất PM3, PM9, PM12, PM15 PM18 3.3 KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 3.3.1 Thử độc ính cấp cao nƣớc Cỏ seo g Kết xác định đƣợc cao nƣớc Cỏ seo gà có độc tính cấp đƣờng uống từ liều 120 g dƣợc liệu/kg cân nặng chuột trở lên LD50 = 212,0 g dƣợc liệu/kg cân nặng (228,67-178,06 g/kg) 3 T c dụng chống viêm Cỏ seo g 3.3.2.1 Tác dụng chống viêm cấp Thử tác dụng chống viêm cấp mô hình gây phù chân chuột carrageenin Kết thí nghiệm cho thấy cao nƣớc Cỏ seo gà liều 7,2 g dƣợc liệu/kg cân nặng chuột có tác dụng làm giảm phù chân chuột thời điểm sau gây viêm h (p < 0,05) Ở thời điểm sau gây viêm h, cao nƣớc Cỏ seo gà liều thấp có xu hƣớng làm giảm phù chân chuột, nhƣng khác biệt chƣa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Ở thời điểm sau gây viêm h, cao nƣớc Cỏ seo gà liều thấp tác dụng làm giảm phù chân chuột Cao nƣớc Cỏ seo gà liều 21,6 g dƣợc liệu/kg có tác dụng làm giảm phù chân chuột tất thời điểm nghiên cứu Tác dụng rõ thời điểm sau gây viêm h, h (p < 0,01) h (p < 0,05) Tác dụng chống viêm cấp cao nƣớc Cỏ 16 seo gà liều cao thời điểm sau gây viêm h h thể mạnh so với aspirin liều 200 mg/kg, nhiên khác biệt chƣa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 3.3.2.2 Tác dụng chống viêm mạn Kết thí nghiệm tác dụng ức chế viêm mạn cao nƣớc Cỏ seo gà chuột nhắt trắng sau cấy hạt amiant cho thấy cao nƣớc Cỏ seo gà liều 7,2 g dƣợc liệu/kg cân nặng chuột có tác dụng chống viêm mạn tính rõ rệt (p < 0,05), tác dụng tƣơng đƣơng đƣơng với methyl prednisolon liều 10 mg/kg (p > 0,05) Cao nƣớc Cỏ seo gà liều 21,6 g dƣợc liệu/kg có tác dụng chống viêm mạn tính (p < 0,001), tác dụng mạnh so với methyl prednisolon liều 10 mg/kg (p < 0,05) 3 T c dụng bảo vệ gan v chống oxy hóa Cỏ seo g 3.3.3.1 Tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa động vật thực nghiệm Kết cho thấy cao nƣớc Cỏ seo gà mức liều 7,2 21,6 g dƣợc liệu/kg cân nặng chƣa thể tác dụng làm giảm khối lƣợng gan, hoạt độ AST, ALT huyết mô bệnh học chuột bị gây độc paracetamol liều 400 mg/kg Cao nƣớc Cỏ seo gà mức liều có xu hƣớng chống oxy hóa động vật thực nghiệm thông qua việc làm giảm hàm lƣợng MDA gan chuột nhắt trắng 3.3.3.2 Tác dụng qu t gốc tự DPP hydroxyl Cỏ seo gà Kết cho thấy mẫu cắn nƣớc toàn phần cắn ethyl acetat có tác dụng quét gốc tự DPPH với giá trị IC50 tƣơng ứng 441,26 ± 3,05 μg/ml; 372,34 ± 1,97 μg/ml so với đối chứng dƣơng acid ascorbic 21,44 ± 0,99 μg/ml Cắn methanol toàn phần, cắn nƣớc cắn cloroform thể tác dụng quét gốc tự hydroxyl với giá trị IC 50 tƣơng ứng 83,96 ± 0,84 μg/ml; 313,9 ± 2,11 μg/ml 311,6 ± 1,19 μg/ml so với đối chứng dƣơng mannitol 689,92 ± 3,27 μg/ml 3 T c dụng gây độc ên mộ số dòng ế b o ung hƣ Cỏ seo g Kết cho thấy, cắn phân đoạn ethyl acetat chất PM9 có tác dụng dòng tế bào MCF7 với IC50 tƣơng ứng 64,50 μg/ml 34,38 μg/ml so với đối chứng dƣơng taxol 0,29 ± 0,02 μg/ml Trên hai dòng tế bào HeLa N87, hai mẫu thử tác dụng CHƢƠNG BÀN LUẬN 4.1 VỀ THỰC VẬT Cỏ seo gà (Pteris multifida Poir.) thuộc chi Pteris L., loài phổ biến giới Theo hệ thống phân loại Smith (2006), Thực vật chí Đài Loan (1993), Võ Văn Chi (2012) chi Pteris L thuộc họ Ráng seo gà (Pteridaceae), Ráng dực xỉ (Pteridales), lớp Ráng đa túc (Polypodiopsida), ngành Dƣơng xỉ (Polypodiophyta) Trên giới, họ Ráng seo gà họ lớn ngành Dƣơng xỉ gồm có phân họ, 50 17 chi với khoảng 950-1000 loài Trong đó, Pteris L chi có số lƣợng lớn họ Pteridaceae Ở Việt Nam, họ Ráng seo gà có 12 chi với khoảng 150 loài, chi Pteris L có khoảng 28-30 loài, việc xác định tên loài nhiều gặp khó khăn Trong trình lấy mẫu Ba Vì (Hà Nội) vào thời điểm khác năm, mẫu có mang sinh sản đƣợc lấy vào tháng 10 Mẫu thu hái đƣợc mô tả đặc điểm hình thái, phân tích, so sánh với đặc điểm mô tả khóa phân loại chi Pteris L mô tả loài Pteris multifida Poir Thực vật chí Đài Loan, kết hợp với tài liệu chuyên khảo thực vật nhà thực vật khác Kết cho thấy nghiên cứu có đầy đủ đặc điểm họ Ráng seo gà (Pteridaceae), đặc điểm chi Pteris L đặc điểm loài Pteris multifida Poir Mẫu nghiên cứu đƣợc TS Đỗ Thị Xuyến, chuyên gia thực vật học Viện Sinh thái- Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam phối hợp với đồng nghiệp Đài Loan giám định tên khoa học Pteris multifida Poir., họ Ráng seo gà (Pteridaceae) Việc giám định tên khoa học giúp cho công bố thành phần hóa học tác dụng sinh học có rõ nguồn gốc 4.2 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Về chiế xuấ v phân lập c c hợp chấ Cỏ seo g Trên giới, qua tổng kết nghiên cứu cho thấy từ phần thân rễ loài Pteris multifida Poir nhà khoa học phân lập đƣợc khoảng 70 hợp chất Luận án phân lập đƣợc 11 hợp chất xác định cấu trúc chúng dựa vào liệu phổ khối lƣợng, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều, hai chiều so sánh với tài liệu tham khảo  2-(1,2-dihydroxyethyl)furan: hydratcarbon tự nhiên đƣợc chiết xuất từ môi trƣờng nuôi cấy Actinosynnema pretiosum Đây lần phân lập đƣợc hợp chất từ Cỏ seo gà  Maltol 3-O-β-D-glucopyranosid: lần phân lập đƣợc hợp chất từ chi Pteris L Các nhà khoa học giới phân lập đƣợc maltol 3-O-β-Dglucopyranosid từ Abies koreana, từ Astragalus halicacabus, từ củ Smilax bockii, từ Scleranthus uncinatus Schur., từ rễ Đơn kim (Bidens pilosa L.)  Steringlykosid: lần phân lập đƣợc hợp chất từ loài Pteris multifida Poir Các nhà khoa học giới phân lập đƣợc Steringlykosid từ loài Pteris inaequalis Baker  Kaempferitrin: lần phân lập đƣợc kaempferitrin từ loài Pteris multifida Poir chi Pteris L Kaempferitrin kaempferol glycosid tự nhiên, phân bố rộng rãi họ thực vật nhƣ Apiaceae, Asteraceae, Fabaceae, 18 erberidaceae, Malvaceae, Lauraceae Hợp chất đƣợc phân lập từ sài hồ bắc, từ loài Bauhinia forficate, Lespedeza cyrtobotrya, Hedyotis verticillata, Lotus lalambensis, Cinnamomum osmophloeum Đối với Cỏ seo gà, kaempferitrin đƣợc phân lập từ phân đoạn ethyl acetat qua lần tinh chế cột silicagel lần qua cột pha đảo tƣơng tự nhƣ chiết từ loài Lotus lalambensis  Kaempferol 3-O-β-D glucopyranosid: lần phân lập đƣợc hợp chất từ loài Pteris multifida Poir Các nhà khoa học giới phân lập đƣợc hợp chất từ dịch chiết ethanol loài Camellia sinensis, từ số loài thuộc chi Cicer nhƣ: Cicer arietinum, C flexnosum, chi Euphorbia nhƣ: Euphorbia cypasissias, E.lathyris, E peoples…  3,4-dihydroxy benzaldehyd: lần phân lập đƣợc hợp chất từ chi Pteris L Các nhà khoa học giới phân lập đƣợc 3,4-dihydroxy benzaldehyd từ vỏ thân Musanga cecropioides, từ lá, thân rễ Trichomanes chinense, từ nấm Phellinus gilvus, từ Cremastra appendiculata loài Vitis vinifera, có tƣơng đồng pha tĩnh pha động trình phân lập PM12 từ Cỏ seo gà nghiên cứu tác giả khác  Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid: lần phân lập đƣợc hợp chất từ loài Pteris multifida Poir Các nhà khoa học giới phân lập đƣợc từ số loài thuộc chi Cleome: Cleome amplyocarpa, C brachycarpa số loài chi Capparis, đƣợc tìm thấy Chenopodium murale, hạt loài Arabidopsis thaniana, từ toàn Pteris ensiformis Burm., từ rễ loài Drynaria fortunei Quá trình phân lập hợp chất từ Cỏ seo gà tƣơng đối phù hợp với nghiên cứu trƣớc  Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D–apiofuranosyl-(1-2)-β-Dglucopyranosid]: hợp chất đƣợc phân lập từ P ensiformis Burm Quá trình phân lập hợp chất tƣơng đồng với trình phân lập từ Cỏ seo gà Đây lần phân lập đƣợc hợp chất từ loài Pteris multifida Poir  2R,3R-pterosin L 3-O-β-D-glucopyranosid: trƣớc đó, nhà khoa học phân lập đƣợc từ loài Pteris ensiformis Burm loài Pteris multifida Poir  Blumenyl A β-D-glucopyranosid: hợp chất đƣợc phân lập từ loài Antidesma membranaceum, Salsola komarovii Tuy nhiên, lần phân lập đƣợc hợp chất từ chi Pteris L  Bockiosid B: lần phân lập đƣợc hợp chất từ chi Pteris L Trƣớc đó, Guo Hongzhu cs phân lập đƣợc maltol glucosid từ củ loài Smilax bockii (Liliaceae) 19 2 Về xây dựng phƣơng ph p định tính mộ số hợp chấ ong Cỏ seo g 4.2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu thử Với mục đích kiểm chứng phù hợp trình phân lập hƣớng tới đại hóa tiêu chuẩn kiểm nghiệm dƣợc liệu Cỏ seo gà Quá trình chuẩn bị mẫu đƣợc thực nhằm tạo mẫu thử có lẫn tạp chất khác có Cỏ seo gà để khảo sát điều kiện sắc ký thẩm định độ đặc hiệu phƣơng pháp Dung môi methanol đƣợc lựa chọn với hỗ trợ siêu âm giúp giảm thời gian xử lý mẫu Đây phƣơng pháp dễ thực điều kiện phòng thí nghiệm, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt không tốn nhiều thời gian, phù hợp để áp dụng cho nghiên cứu Tuy vậy, để xây dựng phƣơng pháp định lƣợng thành phần dƣợc liệu cần khảo sát kỹ phƣơng pháp xử lý mẫu nhiều loại dung môi phƣơng pháp chiết khác để lựa chọn dung môi phƣơng pháp tối ƣu 4.2.2.2 Về việc tạm dùng chất đối chiếu để xây dựng phương pháp Do hợp chất phân lập đƣợc đa phần chất chuẩn cần thiết nên luận án tạm sử dụng hợp chất làm chất đối chiết để xây dựng phƣơng pháp Các hợp chất trƣớc tiến hành đo phổ để xác định cấu trúc đƣợc kiểm tra độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng, đồng thời độ tinh khiết đƣợc thể thông qua liệu phổ NMR Ngoài ra, kiểm tra độ tinh khiết hợp chất máy HPLC với detector DAD điều kiện sắc ký, kết pic chất phân lập đƣợc có độ tinh khiết tƣơng đối cao chứng tỏ chất phân lập đƣợc tinh khiết, đáp ứng yêu cầu chất chuẩn dùng định tính Các chất đƣợc khảo sát đƣợc sử dụng nhƣ dấu vân tay trình kiểm nghiệm dƣợc liệu Cỏ seo gà 4.2.2.3 Về khảo sát điều kiện sắc ký thẩm định phương pháp Qua tiến hành khảo sát xây dựng đƣợc chƣơng trình sắc ký tƣơng đối phù hợp, phƣơng pháp đƣợc đánh giá phù hợp hệ thống sắc ký, khả tách pic khỏi chất khác Kết cho pic cân đối, tách tƣơng đối tốt, chất có độ phân giải thấp PM15 đạt Rs ≈ 1,5; độ đặc hiệu cao, giới hạn phát thấp chứng tỏ chƣơng trình sắc ký phù hợp để định tính thành phần Cỏ seo gà 4.2.2.4 Về kết định tính thành phần phân đoạn Kết phân tích chất nghiên cứu phân đoạn thu đƣợc cho thấy cắn cloroform có mặt chất PM12, PM18 PM9, chất PM3 PM15 Tuy nhiên, so sánh tỷ lệ diện tích pic chất nghiên cứu cho thấy phần PM18 PM9 cắn toàn phần đƣợc chuyển sang dung môi chiết cloroform Trong cắn ethyl acetat chứa đầy đủ chất nghiên cứu, nhƣng lƣợng PM12 lại 20 cắn ethyl acetat thấp Trong cắn ethyl acetat chứa đầy đủ chất nghiên cứu, chất PM9, PM15 PM18 với lƣợng tƣơng đối lớn, lƣợng PM12 lại cắn ethyl acetat thấp Thực tế trình phân lập chất PM9, PM15 PM18 đƣợc tách từ cắn ethyl acetat hoàn toàn phù hợp Hàm lƣợng PM3 cắn ethyl acetat khoảng nửa so với cắn methanol Kết phù hợp với trình phân lập chất PM3, chất đƣợc phân lập từ phân đoạn nƣớc 4.3 VỀ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC Việc lựa chọn cao nƣớc Cỏ seo gà để thử độc tính cấp tác dụng sinh học xuất phát từ dạng bào chế thƣờng đƣợc sử dụng để điều trị bệnh dân gian 4.3.1 Về độc tính cao nƣớc Cỏ seo gà Với liều uống cao nƣớc Cỏ seo gà đến dƣới 96 g dƣợc liệu/kg cân nặng (gấp 13 lần liều dùng thông thƣờng), chuột tƣợng đặc biệt, nhƣng tăng liều đến 120 g dƣợc liệu/kg cân nặng thấy có chuột bị chết, thử nghiệm xác định đƣợc LD50 mẫu nghiên cứu 212,0 g dƣợc liệu/kg cân nặng (gấp 30 lần liều thƣờng dùng) Tuy nhiên, theo nghiên cứu Wang T.C cs (2007) sử dụng dịch chiết nƣớc P multifida Poir đƣờng uống theo cách sắc mà không gặp phải nguy ngộ độc Điều chứng tỏ Cỏ seo gà dùng dƣới dạng dịch chiết nƣớc, theo đƣờng uống có độc tính có độ an toàn cao Về c dụng chống viêm Cỏ seo g Cao nƣớc Cỏ seo gà có tác dụng chống viêm cấp mạn tính mô hình thử với mức liều theo kinh nghiệm dân gian dùng, tác dụng tăng tăng liều Nó cho thấy mối liên quan tác dụng sinh học thành phần hóa học có chứa số hợp chất flavonoid dẫn chất kaempferol (PM9, PM11, PM15, PM18) Nhiều nghiên cứu tiền lâm sàng kaempferol số glycosid kaempferol có nhiều tác dụng dƣợc lý, có tác dụng chống viêm Các kết nghiên cứu tác dụng chống viêm Cỏ seo gà khuôn khổ luận án đóng góp thêm tác dụng dƣợc liệu 4.3.3 Về c dụng bảo vệ gan v chống oxy hóa Cỏ seo g 4.3.3.1 Tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa động vật thực nghiệm Trong trình thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa dƣợc liệu động vật thực nghiệm, kết cho thấy cao nƣớc PM mức liều nghiên cứu chƣa thể tác dụng bảo vệ gan, có tác dụng chống oxy hóa yếu thành phần cao nƣớc có chứa số chất có tác dụng chống oxy hóa nhƣ PM9, PM12, PM15 PM18 nhƣng có số hợp chất có độc tính tế bào nên tế bào gan lô sử dụng PM liều cao có xu hƣớng bị thoái hóa nặng so với sử dụng liều thấp 21 4.3.3.2 Tác dụng chống oxy hóa in vitro Kết nghiên cứu cho thấy phân đoạn có tác dụng tùy thuộc vào loại gốc tự do, riêng phân đoạn n-hexan tác dụng mô hình Trong trình nghiên cứu thành phần hóa học Cỏ seo gà, phân lập đƣợc hợp chất PM9, PM15 PM18 Trong đó, PM9, PM15 PM18 đƣợc nhà khoa học chứng minh có khả chống oxy hóa loại trừ gốc tự Mặt khác, nghiên cứu tác giả khác cao nƣớc, cắn ethanol phân đoạn methanol loài Pteris multifida Poir có khả quét gốc tự DPPH, chống oxy hóa peroxy hóa lipid màng tế bào Ngoài ra, Cỏ seo gà có hợp chất PM12 có tác dụng ức chế oxy hóa phá hủy DNA trình chết tế bào gây H2O2, thu dọn gốc DPPH, hydroxyl, ROS nội bào PM26 có tác dụng quét gốc tự Nhƣ vậy, tác dụng chống oxy hóa in vitro Cỏ seo gà tƣơng đối phù hợp với nghiên cứu trƣớc đây, nhiên có phần yếu mẫu thử thu hái vị trí khác phƣơng pháp chuẩn bị mẫu khác 4 Về c dụng gây độc ế b o ung hƣ Cỏ seo g Kết thử nghiệm cho thấy mẫu thử có tác dụng dòng tế bào ung thƣ vú (MCF7) Trong Cỏ seo gà thu hái Hà Nội, đề tài phân lập đƣợc PM9 hợp chất đƣợc chứng minh tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, hạ lipid máu, chống ung thƣ PM12 đƣợc chứng minh có tác dụng ức chế phosphotransferase protein kinase II, ức chế tăng trƣởng tế bào ung thƣ U937 ngƣời PM23 đƣợc chứng minh có tác dụng gây độc dòng tế bào HL60 Nhƣ vậy, việc xác định đƣợc tác dụng gây độc tế bào ung thƣ vú dòng MCF7 cắn phân đoạn ethyl acetat chiết từ Cỏ seo gà đóng góp đề tài, góp phần nghiên cứu sâu tác dụng sinh học dƣợc liệu Kết sở giúp định hƣớng xác định mối quan hệ thành phần hoá học với tác dụng chống ung thƣ đƣợc biết đến Cỏ seo gà, phần chứng minh đƣợc kinh nghiệm sử dụng dƣợc liệu dân gian KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Về đặc điểm thực vật loài Pteris multifida Poir - Cỏ seo gà thu hái Ba Vì, Hà Nội đƣợc mô tả chi tiết đặc điểm thực vật xác định tên khoa học Pteris multifida Poir, họ Ráng seo gà (Pteridaceae) - Đã xác định đặc điểm vi phẫu lá, thân rễ đặc điểm bột lá, bột thân rễ loài nghiên cứu góp phần tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu 22 Về thành phần hóa học loài Pteris multifida Poir - Đã xác định nhóm chất có loài Pteris multifida Poir gồm: flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đƣờng khử, sterol - Đã phân lập đƣợc 11 hợp chất từ loài nghiên cứu là: PM1: 2-(1,2-dihydroxyethyl)furan PM3: maltol 3-O-β-D-glucopyranosid PM4: 2-desoxy-D-glucose β-sitosterin PM9: kaempferol-3,7-di-O-α-L-rhamnopyranosid PM11: kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid PM12: 3,4-dihydroxy benzaldehyd PM15: kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid PM18: kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apio-furanosyl-(1-2)-β-D- glucopyranosid] PM23: 2R,3R-pterosin L 3-O-β-D-glucopyranosid PM25: blumenyl A β-D-glucopyranosid PM26: bockiosid B - Trong số hợp chất phân lập đƣợc có hợp chất lần phân lập đƣợc từ chi Pteris L là: PM3, PM9, PM12, PM25 PM26; hợp chất lần phân lập đƣợc từ loài Pteris multifida Poir là: PM1, PM4, PM11, PM15 PM18 - Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính đồng thời hợp chất PM3, PM9, PM12, PM15 PM18 Cỏ seo gà sắc ký lỏng hiệu cao với cột pha đảo Zorbax Eclipse XBD C18 (250 mm  4,6 mm, µm), detector UV bƣớc sóng 265 nm, pha động acetonitril – nƣớc (có 0,1% acid formic) với chƣơng trình gradient dung môi 30 phút Đây nghiên cứu bƣớc đầu việc chuẩn hóa dƣợc liệu kiểm chứng phù hợp trình phân lập Về tác dụng sinh học loài Pteris multifida Poir - Thử độc tính cấp cao nƣớc Cỏ seo gà xác định đƣợc LD50 212,0 g dƣợc liệu/kg cân nặng - Cao nƣớc Cỏ seo gà hai mức liều 7,2 g 21,6 g dƣợc liệu/kg cân nặng chuột nhắt trắng có tác dụng chống viêm cấp chống viêm mạn tính, tác dụng tăng tăng liều sử dụng - Cao nƣớc Cỏ seo gà hai mức liều 7,2 g 21,6 g dƣợc liệu/kg cân nặng chuột nhắt trắng chƣa thể tác dụng bảo vệ gan thông qua khả làm giảm hoạt độ 23 AST, ALT; hạn chế tổn thƣơng cấu trúc đại thể vi thể gan paracetamol gây với liều 400 mg/kg cân nặng chuột nhắt trắng - Trên động vật thực nghiệm, cao nƣớc Cỏ seo gà có xu hƣớng chống oxy hóa thông qua việc làm giảm nồng độ MDA dịch đồng thể gan chuột nhắt trắng (p > 0,05) Tuy nhiên thử nghiệm in vitro, Cỏ seo gà thể tác dụng chống oxy hóa qua khả quét gốc tự DPPH gốc hydroxyl tùy thuộc phân đoạn - Cắn phân đoạn ethyl acetat Cỏ seo gà hợp chất PM9 có tác dụng ức chế phát triển dòng tế bào MCF7 với IC50 tƣơng ứng 64,50 μg/ml 34,38 μg/ml Trên dòng tế bào ung thƣ cổ tử cung (HeLa) ung thƣ dày (N87) mẫu thử tác dụng KIẾN NGHỊ - Dựa kết nghiên cứu thành phần hóa học, cần tiếp tục nghiên cứu khả chống oxy hóa chất phân lập đƣợc số mô hình chống oxy hóa khác - Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng hợp chất dƣợc liệu HPLC để góp phần tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu Cỏ seo gà (Pteris multifida Poir.) cao nƣớc dùng để thử tác dụng sinh học 24 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC Nguyễn Duy Chí, Nguyễn Thái An, Lại Quang Long (2013), “Evaluation of the anti-inflammatory effects in mice of Pteris multifida Poir.”, Pharma Indochina VIII, 12/2013, Proceeding of the 8th Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, p 665-669 Nguyễn Duy Chí, Lại Quang Long, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2014), “Một số flavonoid đƣợc phân lập từ Cỏ seo gà (Pteris multifida Poir.) thu hái Hà Nội”, Tạp chí Dược học, 9/2014 (461), tr 50-54 Nguyễn Duy Chí, Lại Quang Long, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2015), “Một số hợp chất phân lập từ phân đoạn nƣớc Cỏ seo gà (Pteris multifida Poir.) thu hái Hà Nội”, Tạp chí Dược học, 3/2015 (467), tr 25-29