TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ - Tên đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả chuyển gen bưởi” - Mã số: T2012-07 - Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Tiến Dũng - Tel.: 0986985140 E-mail: tiendungntt@yahoo.com - Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Cơ quan cá nhân phối hợp thực hiện: Khoa CNTH&CNTP-Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Thời gian thực hiện: từ 2/2012 đến 2/2013 Mục tiêu Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả chuyển gen bưởi thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Nội dung - Nghiên cứu ảnh hưởng tuổi mẫu đến khả tiếp nhận gen - Nghiên cứu ảnh hưởng phương thức biến nạp gen đến khả tiếp nhận gen - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lây nhiễm vi khuẩn đến khả tiếp nhận gen Kết đạt (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế – xã hội, v.v…) - Sản phẩm khoa học: báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học - Sản phẩm ứng dụng: Phương pháp biến nạp gen vào bưởi SUMMARY - Research Project Title: “Study on the effect of some fators on genetic transformation of Citrus (Citrus grandis L)” - Code number: T2012-07 - Coordinator: MSc Nguyen Tien Dung - Tel: 0986985140 Email: tiendungntt@yahoo.com - Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agriculture and Foresrtry - Cooperating Institution(s): Faculty of Biotechnology and Food technology, Thai Nguyen University of Agriculture and forestry - Duration: from 2/2012 to 2/2013 Objectives Evaluation of the effect of some fators on genetic transformation of Citrus via Agrobacterium tumefaciens Main contents - Study on the effect of explant age on genetic transformation - Study on the effect of genetic transformation mode - Study on the effect of duration of genetic transformation Results obtained - Results of sciences: a report of scientific research - Results of applications: Method of genetic transformation of citrus Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây bưởi có tên khoa học Citrus grandis Osbeck hay Citrus maxima (Burm) Merr, thuộc họ Rutaseae, họ phụ Aurantiodae, chi Citruss Bưởi có múi có phổ phân bố rộng từ vùng nhiệt đới tới vùng nhiệt đới Có thể nói bưởi có mặt hầu hết lục địa Vùng phân bố bưởi giới vào khoảng 35 vĩ độ nam bắc Hiện người ta chọn giống chịu rét mở rộng phạm vi phân bố lên đến 41-43 độ bắc Bưởi ăn có giá trị dinh dưỡng cao Thành phần hóa học có 100 gam bưởi tươi phần ăn được: Đường 6-12%, Lipit 0,1gam, Protein 0,9gam, xenluloza 0,2gam, ngồi cịn có loại vitamin B1, B2, Caroten 0.2mg, khống chất dạng vi lượng cần thiết cho thể người Trong 1kg bưởi phần ăn cung cấp 530-600 calo nguồn lượng dễ tiêu Cây bưởi có hệ số sử dụng cao, ngồi dùng ăn tươi bưởi chế biến thành nhiều sản phẩm có giá trị nước quả, mứt, làm nước ngọt, làm tương, nấu rượu, bã rượu dùng làm cồn, làm thức ăn cho gia súc Trong công nghiệp chế biến vỏ, hạt để lấy tinh dầu, bã tép để sản xuất pectin có tác dụng bồi bổ thể, đặc biệt bưởi có tác dụng tốt để chữa bệnh đường ruột, tim mạch, chống ung thư, gỗ mịn dùng làm dụng cụ gia đình, đồ mỹ nghệ, làm nhạc cụ tốt (Vũ Công Hậu, 1998) Ở nước ta, điều kiện thời tiết khí hậu, đất đai thích hợp cho trồng bưởi thực tế bưởi trồng nước ta từ lâu đời khắp ba miền đất nước với 100 giống có nhiều chủng loại quý như: bưởi Năm Roi, bưởi Phúc Trạch, bưởi Đoan Hùng, bưởi đỏ Mê Linh Trong đó, giá trị trái Bưởi khác nhau, có loại 1000-5000 đ/quả (bưởi địa phương) , có loại 20.000-70.000 đ/quả (Da xanh, năm roi, phúc trạch) Sở dĩ có khác biệt chất lượng trái Bưởi (Vũ Công Hậu, 1998) Trong thực tế sản xuất năm qua, chưa đầu tư thích đáng, sâu bệnh hại nhiều, thâm canh nhiều năm khơng có giải pháp cải tạo giống nên tượng thối hóa giống diễn ngày mạnh, diện tích trồng bưởi nước ta ngày thu hẹp Cho đến bưởi trồng chủ yếu vườn nhà dân có nguy thất nguồn gen quý Đứng trước thực trạng xuống cấp bưởi, tổ chức UTFANET xếp bưởi vào hàng ngũ ăn không phổ biến cần bảo tồn phát triển Vấn đề chọn tạo giống bưởi tốt, bệnh, chất lượng cao, giống khơng hạt, hạt vấn đề đặt cấp bách “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả chuyển gen bưởi” nhằm phục vụ cho công tác tạo nguồn vật liệu chọn tạo giống 1.2 Mục tiêu đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả chuyển gen bưởi 1.3 Yêu cầu đề tài - Nghiên cứu ảnh hưởng tuổi mẫu sử dụng biến nạp - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lây nhiễm với vi khuẩn - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian siêu âm, hút chân không đến khả biến nạp gen Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi giới Việt Nam 2.1.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi giới Hiện nay, bưởi trồng khắp lục địa, phát triển vùng trồng bưởi giới có tương quan với cách mạng công nghiệp vùng Những năm gần với phát triển cam qt diện tích trồng bưởi chiếm tỷ lệ đáng kể so với diện tích cây có múi giới [2;3] Bảng 1.1 Tình hình sản xuất có múi châu lục năm 2010 Các châu lục giới Chỉ tiêu Năm Châu Phi Châu Á Châu Mỹ Châu Âu Châu Đại Thế giới Dương 2008 824 379 279 261 91 987 3061 815 200 673 2009 862 612 299 084 88 988 006 846 256 567 2010 857 145 293 796 88 989 003 775 1245710 Năng 2008 50,061 188,642 119,434 300,222 152,135 87,774 suất 2009 52,697 205,256 116,824 291,756 142,541 93,671 (tạ/ha) 2010 49,673 218,371 117,234 311,518 94,433 Sản 2008 126 889 5268 024 098 637 91 898 12 399 10 538 810 lượng 2009 545 749 138 889 039 592 87 702 12 059 11 770 353 (tấn) 2010 257 713 415 661 043 254 93 549 11 880 11 763 628 Diện tích (ha) 153,29 Nguồn: FAOSTAT/FAO Statistics - năm 2010 Nhìn chung diện tích trồng có múi giới có xu hướng tăng dần qua năm kéo theo suất sản lượng tăng lên Năm 2008, diện tích trồng có múi tồn giới 200 673 ha, suất trung bình đạt 87,774 tạ/ha, sản lượng đạt 10 538 810 Đến năm 2010 diện tích tăng lên 245 710 ha, sản lượng đạt 11 763 628 tấn, suất 94,433 tạ/ha (bảng 1.1) (FAO, 2010) So sánh diện tích trồng có múi năm Châu lục năm 2010, Châu phi có tổng diện tích lớn sau đến Châu Á, Châu Mỹ, Châu Âu vùng có diện tích nhỏ Châu Đại Dương 775 (FAO, 2010) Vùng Châu Phi: nước sản xuất nhiều như: Nigeria, Guinea, Angola…đã đưa Châu Phi lên đứng vị trí số diện tích trồng Bưởi năm 2010 857 145 Tuy có diện tích trồng lớn suất sản lượng lại chưa cao Châu Á châu lục có diện tích trồng lớn thứ hai giới sản lượng lại cao 415 661 Châu Âu có diện tích nhỏ thứ hai suất trung bình lại cao Năm 2008 suất đạt 300,222 tạ/ha, năm 2009 đạt 291,756 tạ/ha, năm 2010 đạt 311,518 tạ/ha (bảng 1.1) (FAO, 2010) Vùng lãnh thổ Châu Á sản xuất có múi gồm nước Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines, Nhật Bản, Malaysia…Đây vùng có diện tích trồng lớn thứ hai giới sản lượng lại dẫn đầu Năm 2008 sản lượng vùng Châu Á đạt 268 024 tấn, chiếm 49,98% Năm 2009 đạt 138 889, chiếm 52,15% Năm 2010 đạt 415 661, chiếm 54,54% tổng sản lượng toàn giới Vùng Châu Đại Dương có diện tích, suất, sản lượng thấp giới (bảng 1.1) (FAO, 2010) Vùng Châu Á khẳng định quê hương cam, quýt Tuy diện tích chưa nhiều sản lượng đạt mức cao giới Theo số liệu thống kê FAO tình hình sản xuất có múi số nước Châu Á sau: Bảng 1.2 Tình hình sản xuất có múi số nước Châu Á Năm 2008 TT Nước Năm 2009 Năm 2010 Diện Năng Diện Năng Diện Năng tích suất tích suất tích suất (ha) (tạ/ha) (ha) (tạ/ha) (ha) (tạ/ha) Trung Quốc 180 206 221 671 184 379 254,610 174 750 279,651 Ấn Độ 36 200 125 138 50 700 125,089 55 500 137,712 Nhật Bản 600 193 333 900 179,661 700 158,947 Philippines 20 956 95 283 20 912 91,903 20 987 89,741 Afghanistan 200 86 900 200 89,400 210 90,476 Nguồn: FAOSTAT/FAO Statistics - năm 2010 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây bưởi có tên khoa học Citrus grandis Osbeck hay Citrus maxima (Burm) Merr, thuộc họ Rutaseae, họ phụ Aurantiodae, chi Citruss Bưởi có múi có phổ phân bố rộng từ vùng nhiệt đới tới vùng nhiệt đới Có thể nói bưởi có mặt hầu hết lục địa Vùng phân bố bưởi giới vào khoảng 35 vĩ độ nam bắc Hiện người ta chọn giống chịu rét mở rộng phạm vi phân bố lên đến 41-43 độ bắc Bưởi ăn có giá trị dinh dưỡng cao Thành phần hóa học có 100 gam bưởi tươi phần ăn được: Đường 6-12%, Lipit 0,1gam, Protein 0,9gam, xenluloza 0,2gam, ngồi cịn có loại vitamin B1, B2, Caroten 0.2mg, khoáng chất dạng vi lượng cần thiết cho thể người Trong 1kg bưởi phần ăn cung cấp 530-600 calo nguồn lượng dễ tiêu Cây bưởi có hệ số sử dụng cao, ngồi dùng ăn tươi bưởi cịn chế biến thành nhiều sản phẩm có giá trị nước quả, mứt, làm nước ngọt, làm tương, nấu rượu, bã rượu dùng làm cồn, làm thức ăn cho gia súc Trong công nghiệp chế biến vỏ, hạt để lấy tinh dầu, bã tép để sản xuất pectin có tác dụng bồi bổ thể, đặc biệt bưởi có tác dụng tốt để chữa bệnh đường ruột, tim mạch, chống ung thư, gỗ mịn dùng làm dụng cụ gia đình, đồ mỹ nghệ, làm nhạc cụ tốt (Vũ Công Hậu, 1998) Ở nước ta, điều kiện thời tiết khí hậu, đất đai thích hợp cho trồng bưởi thực tế bưởi trồng nước ta từ lâu đời khắp ba miền đất nước với 100 giống có nhiều chủng loại quý như: bưởi Năm Roi, bưởi Phúc Trạch, bưởi Đoan Hùng, bưởi đỏ Mê Linh Trong đó, giá trị trái Bưởi khác nhau, có loại 1000-5000 đ/quả (bưởi địa phương) , có loại 20.000-70.000 đ/quả (Da xanh, năm roi, phúc trạch) Sở dĩ có khác biệt chất lượng trái Bưởi (Vũ Công Hậu, 1998) Trong thực tế sản xuất năm qua, chưa đầu tư thích đáng, sâu bệnh hại nhiều, thâm canh nhiều năm khơng có giải pháp cải tạo giống nên tượng thối hóa giống diễn ngày mạnh, diện tích trồng bưởi nước ta ngày thu hẹp Cho đến bưởi trồng chủ yếu vườn nhà dân có nguy thất nguồn gen q tích sản lượng có múi lại tăng lên, khu vực tư nhân, tỉnh có diện tích có múi nhiều như: Bến Tre, Tiền Giang, Nghệ An, Vĩnh Long, Tuyên Quang (Đỗ Năng Vịnh, 2008) Bảng 1.3 Tình hình sản xuất bưởi Việt Nam giai đoạn 2006-2010 Năm Tình hình sản xuất bưởi 2006 2007 2008 2009 2010 Diện tích (ha) 000 037 056 129 000 Năng suất (tạ/ha) 115 111,983 104,728 110,737 113 Sản lượng 23 000 22 811 21 532 23 576 22 600 STT Nguồn: FAOSTAT/FAO Statistics - năm 2010 Những năm đầu kỷ XXI trở lại so với năm 1975 kỷ XX diện tích, suất sản lượng có múi tăng nhiều ổn định Với số liệu thống kê bảng 1.3 diện tích trồng Bưởi ổn định qua năm từ 2006 đến 2010 Diện tích cao năm 2009 với tổng diện tích 129 Cùng với ổn định diện tích suất dần ổn định Năng suất cao năm 2006 với tổng suất 115 tạ/ha Thấp năm 2008 với 104,728 tạ/ha Tổng sản lượng đạt cao 23 576 vào năm 2009 Tuy diện tích có giảm suất sản lượng lại có xu hướng tăng Có diện tích với năm 2006 sản lượng năm 2010 22 600 (FAO, 2010) Ở nước ta nay, có nhiều vùng trồng có múi, song vùng cho suất cao, phẩm chất tốt, có tiếng nước phải kể đến vùng Bắc Trung Bộ, đồng sông Cửu Long với nhiều giống Bưởi tiếng như: Bưởi Phúc Trạch- Hà Tĩnh, Bưởi Năm Roi- Vĩnh Long, Bưởi Da Xanh- Bến Tre Trong năm gần nhìn chung xu phát triển có múi nước ta chậm lại Nguyên nhân sâu bệnh nhiều, chưa có biện pháp phịng trừ hiệu quả, chưa tạo giống tốt có khả chống chịu sâu bệnh để cung cấp cho nhu cầu tiêu thụ nước xuất 2.2 Giới thiệu chung bưởi 2.2.1 Nguồn gốc Trong loại ăn nhiệt đới nhiệt đới, bưởi có địa bàn phân bố tương đối rộng Có thể nói bưởi có mặt hầu hết lục địa Vùng phân bố bưởi giới vào khoảng 35 vĩ độ Bắc Nam bán cầu Một số giống chịu nóng tốt nên mở rộng phạm vi phân bố tới 41 vĩ độ Bắc (Vũ Công Hậu, 1996) Nguồn gốc bưởi nhiều bàn cãi chưa thống Theo số nhà khoa học giới cho bưởi có nguồn gốc Malaysia, sau trồng rộng rãi Indonesia, Trung Quốc, phía nam nước Nhật, phía tây Ấn Độ, Địa Trung Hải phía tây nước Mỹ Nhưng số giống bưởi tiếng lại trồng Thái Lan (Rriharibabu, C.B.S, 1985) Bưởi nước ta gồm nhiều giống, từ chua nhiều, đến chua, đến bưởi Các giống bưởi tiếng nước ta là: Bưởi Đoan Hùng – Phú Thọ, Bưởi Đường (Hương Sơn – Hà Tĩnh), Thanh trà Huế (trồng làng sen sông Hương), Bưởi Long Tuyền (Cần Thơ), Bưởi Biên Hòa, 2.2.2 Phân loại Theo tài liệu viết cam quýt thống vị trí phân loại bưởi sau: Bưởi thuộc họ cam Rutaceae Họ phụ cam quýt Aurantoideae Chi Citrus Chi phụ Eucitrus Loài Citrus Grandis (Citrus Maxima) Ngồi bưởi cịn có bưởi chùm có nguồn gốc từ hạt hay cành đột biến bưởi lai bưởi cam vùng Barbados tây Ấn Độ vào năm 1750, chùm nên người ta gọi bưởi chùm Sau người ta thấy bưởi chùm có nhiều đặc điểm khác so với bưởi nên phân bưởi chùm làm loai khác lấy tên Citrus paradis Macf (Rriharibabu, 1985) Tuy bưởi bưởi chùm hai loài khác chúng có mối quan hệ chặt chẽ với Chúng ta phân biệt bưởi bưởi chùm qua đặc điểm hình thái đặc tính sinh lý sau: + Bưởi: cành, non có lơng trắng, thường lớn, to, mọc đơn, vỏ dày lõi rỗng, múi dễ tách, tép khơ cứng, hạt đơn phôi + Bưởi chùm: cành, non khơng có lơng tơ, hình cầu dẹp hình cầu, mọc thành chùm, vỏ mỏng, lõi đặc, múi khó tách, tép mềm, ướt dễ chảy nước, hạt có nhiều phôi 2.2.3 Đặc điểm thực vật học Bưởi ăn thân gỗ lâu năm, tán rộng, xanh quanh năm, trưởng thành có thân, tán lớn, hạt đơn phơi, - Rễ: nhìn chung có múi có rễ ăn nơng, biểu bì rễ non có nấm cộng sinh Nấm có tác dụng tốt cho rễ vai trị lơng hút với trồng khác Sự phân bố rễ ăn có múi phụ thuộc vào đặc tính giống, mực nước ngầm chế độ canh tác, chăm bón nhìn chung rễ cam qt ăn nơng từ - 30 cm - Thân cành: Trong năm ăn có múi có nhiều đợt cành: + Cành xuân nảy mầm vào tháng 2, 3, + Cành hè nảy mầm vào tháng 6, 7, + Cành thu nảy mầm vào tháng 9, 10 + Cành đông nảy mầm vào tháng 11, 12 Tùy giống, tùy cây, tùy điều kiện khí hậu chăm sóc mà lượng cành thời gian đợt cành có thay đổi, cành non quang hợp được, đợt cành cành xuân thường đều, tập trung cành ngắn, cành hè thường khỏe, to, dài rải rác hơn, cành thu cành hè cành đơng yếu ớt Trong cành ăn có múi có loại: cành mẹ, cành dinh dưỡng cành + Cành mẹ: Sinh cành cành xuân, cành hè cành năm trước Qua theo dõi cho thấy tùy giống thường cành thu cành hè làm cành mẹ số cành nhiều tỷ lệ đậu cao + Cành dinh dưỡng: Cành khơng hoa, quả, có xanh có nhiệm 13 Washington Navel qua giai đoạn callus với protoplast tách từ mô tế bào trần điều khiển tới nồng độ 106 tế bào/lít ni cấy mơi trường MS có bổ sung 0,6 M Saccaroza - Năm 1989, hai nhà khoa học Israrel Ben Hayyn Gofrer tạo quýt chịu mặn phương pháp nuôi callus chồi đỉnh môi trường dinh dưỡng có hàm lượng muối cao Cây tái sinh từ tế bào callus có khả chịu mặn cao ni cấy bình thường đặc tính di truyền cho hệ sau Cũng đối tượng ăn có múi, người ta nuôi cấy mô thân, mô rễ, mô mầm mơi trường MS có bổ sung NAA với nồng độ 1mg/l, BAP với nồng độ 1mg/l kết mơ thân có tỉ lệ callus cao mô * Ứng dụng ni cấy mơ tế bào với có múi Việt Nam Các nhà khoa học lĩnh vực công nghệ sinh học tìm cách áp dụng kỹ thuật in vitro vào đối tượng có múi với mục đích sản xuất giống bệnh, bảo quản tạo nguồn gen ăn có múi bệnh, nghiên cứu gốc ghép chống bệnh… - Năm 1997, Lê Thị Thu Hồng cộng công bố quy trình sản xuất có múi bệnh trung tâm ăn Long Định - Năm 1998, Đỗ Năng Vịnh cộng cơng bố quy trình nuôi cấy mô nhằm đảm bảo tạo nguồn gen có múi bệnh điều kiện in vitro Cũng năm 1998, Đỗ Năng Vịnh cộng nghiên cứu hồn thiện quy trình vi ghép in vitro số giống cam quýt địa phương Viện nghiên cứu ăn Miền Nam tiến hành nghiên cứu nhân giống gốc ghép loài có múi Carrizo Citrange Volkamer kỹ thuật ni cấy mơ với mục đích sản xuất thử số gốc ghép chống chịu sâu bệnh phục vụ cho nhu cầu sản xuất Riêng bưởi trồng khơng phổ biến có nguy suy thoái tổ chức UTFANET xếp vào ăn cần bảo tồn phát triển Tổ chức liên kết với viện nghiên cứu rau trung ương thực công tác bảo tồn phát triển số giống bưởi quý Việt Nam điều kiện in vitro điều kiện sản xuất 14 Phần NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: giống bưởi Đoan Hùng, Năm Roi, Phúc Trạch 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng tuổi mẫu đến khả tiếp nhận gen - Nghiên cứu ảnh hưởng phương thức biến nạp gen đến khả tiếp nhận gen - Nghiên cứu thời gian lây nhiễm với vi khuẩn đến khả tiếp nhận gen Các thí nghiệm tiến hành điều kiện phịng nuôi cấy mô tế bào thực vật Cụ thể: + Nhiệt độ: 25 ± 20C + Ẩm độ: 70-75 % + Cường độ ánh sáng: 2000-2500 lux + Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm tiến hành phịng ni cấy mơ tế bào thực vật Bộ môn CNSH - Khoa CNSH & CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 3.2.2 Thời gian tiến hành Từ tháng 3/2012 đến tháng 2/2013 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Nội dung nghiên cứu Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng tuổi mẫu đến khả tiếp nhận gen giống bưởi Đoan Hùng, Năm Roi Phúc Trạch Trong thí nghiệm tuổi mẫu nghiên cứu giai đoạn khác từ 15 – 30 ngày Thí nghiệm bao gồm CT: Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi giới Việt Nam 2.1.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi giới Hiện nay, bưởi trồng khắp lục địa, phát triển vùng trồng bưởi giới có tương quan với cách mạng công nghiệp vùng Những năm gần với phát triển cam quýt diện tích trồng bưởi chiếm tỷ lệ đáng kể so với diện tích cây có múi giới [2;3] Bảng 1.1 Tình hình sản xuất có múi châu lục năm 2010 Các châu lục giới Chỉ tiêu Năm Châu Phi Châu Á Châu Mỹ Châu Âu Châu Đại Thế giới Dương 2008 824 379 279 261 91 987 3061 815 200 673 2009 862 612 299 084 88 988 006 846 256 567 2010 857 145 293 796 88 989 003 775 1245710 Năng 2008 50,061 188,642 119,434 300,222 152,135 87,774 suất 2009 52,697 205,256 116,824 291,756 142,541 93,671 (tạ/ha) 2010 49,673 218,371 117,234 311,518 94,433 Sản 2008 126 889 5268 024 098 637 91 898 12 399 10 538 810 lượng 2009 545 749 138 889 039 592 87 702 12 059 11 770 353 (tấn) 2010 257 713 415 661 043 254 93 549 11 880 11 763 628 Diện tích (ha) 153,29 Nguồn: FAOSTAT/FAO Statistics - năm 2010 Nhìn chung diện tích trồng có múi giới có xu hướng tăng dần qua năm kéo theo suất sản lượng tăng lên Năm 2008, diện tích trồng có múi toàn giới 200 673 ha, suất trung bình đạt 87,774 tạ/ha, sản lượng đạt 10 538 810 Đến năm 2010 diện tích tăng lên 245 710 ha, sản lượng đạt 11 763 628 tấn, suất 94,433 tạ/ha (bảng 1.1) (FAO, 2010) 16 3.3.2.2 Phương pháp nuôi cấy nảy mầm Hạt khử trùng tách bỏ vỏ lụa nuôi cấy nảy mầm môi trường MS để lấy mẫu tiến hành thí nghiệm Điều kiện ni cấy, nhiệt độ 25 ± 20C; thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày 3.3.2.3 Phương pháp tạo mẫu thí nghiệm Cây nảy mầm sau 15 đến 30 ngày tiến hành lấy mẫu: Dùng dao số 15 cắt bỏ phần mầm, trụ rễ mẫm Thân mầm cắt thành đoạn ngắn (khoảng 1cm) để sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen Xâm nhiễm với vi khuẩn Chủng vi khuẩn A.tumefaciens EHA105 mang hệ thống vector pCambia3301 chứa gen thị GUS sử dụng cho biến nạp Vi khuẩn nuôi lắc 200v/p; 280C môi trường YEP Nồng độ vi khuẩn OD600 = 0,6-0,8 sử dụng cho lây nhiễm Trước xâm nhiễm, tiến hành ly tâm thu tế bào vi khuẩn hịa tan mơi trường đồng nuôi cấy Mẫu nuôi cấy xâm nhiễm với vi khuẩn thời gian 20 phút Kết thúc xâm nhiễm, mẫu nuôi cấy môi trường đồng nuôi cấy ngày Đánh giá khả tiếp nhận gen Khả tiếp nhận gen đánh giá thông qua biểu tạm thời gen GUS Phương pháp nhuộm GUS tiến hành theo Jefferson R (1987) + Tỷ lệ biểu gen (%) = Mẫu GUS+ ∑ mẫu nhuộm x100 17 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng tuổi mẫu đến khả tiếp nhận gen số giống bưởi Bảng 4.1 Ảnh hưởng tuổi mẫu đến khả tiếp nhận gen số giống bưởi Đoan Hùng Tuổi mẫu Số mẫu nhuộm Gus Tỷ lệ mẫu nhuộm Gus + (%) Năm Roi Tỷ lệ Mức độ biểu mẫu nhuộm Gus + (%) Mức độ biểu Phúc Trạch Tỷ lệ mẫu nhuộm Gus + (%) Mức độ biểu 15 ngày 40 7,5 + 12,5 + 32,5 + 20 ngày 40 17,5 ++ 22,5 ++ 37,5 +++ 25 ngày 40 12,5 ++ 30,0 ++ 52,5 ++ 30 ngày 40 10,5 ++ 20,0 ++ 42,5 ++ +: Mức độ biểu gen thấp ++: Mức độ biểu gen trung bình +++: Mức độ biểu gen cao Qua kết bảng 4.1 cho thấy, mẫu từ 20-25 ngày tuổi có tỷ lệ biểu gen tương đối cao, dao động từ 17,5 đến 52,5% tùy giống Giống bưởi Phúc Trạch có tỷ lệ biểu gen cao hai giống bưởi Đoan Hùng Năm Roi (52,5% so với 17,5 30,0%) Kết cho thấy khả tiếp nhận gen bị chi phối giống Tuổi mẫu từ 20-25 ngày phù hợp cho biến nạp gen 4.2 Ảnh hưởng phương thức xâm nhiễm tới hiệu chuyển gen Qua bảng 4.2 cho thấy tỷ lệ biểu tạm thời gen Gus dao động khoảng 25-75,0%, vậy, phương thức biến nạp ảnh hưởng lớn đến hiệu chuyển gen 18 Bảng 4.2 Ảnh hưởng phương thức biến nạp tới hiệu chuyển gen Đoan Hùng Phương CT thức biến nạp Số Tỷ lệ mẫu mẫu nhuộm nhuộm Gus Gus + (%) Mức độ biểu Năm Roi Tỷ lệ mẫu nhuộm Gus + (%) Mức độ biểu Phúc Trạch Tỷ lệ mẫu nhuộm Gus + (%) Mức độ biểu CT S20D30 40 25,0 + 27,5 + 40,0 + CT S20V30D20 40 42,5 ++ 62,5 ++ 75,0 +++ CT S20V30D30 40 37,5 + 50,0 ++ 45,5 ++ Ghi chú: S20: siêu âm 20 giây V30: hút chân không 30 giây D30: ngâm 30 phút +: Mức độ biểu gen thấp ++: Mức độ biểu gen trung bình +++: Mức độ biểu gen cao Ở CT1, sau siêu âm 20 giây tiến hành ngâm với dịch khuẩn 30 phút cho tỷ lệ biểu tạm thời gen gus thấp, dao động từ 25-40% Bưởi Phúc Trạch có tỷ lệ biểu tạm thời gen gus cao đạt 40% Tiếp theo bưởi Năm Roi với tỷ lệ biểu tạm thời gen gus 27,5%, thấp bưởi Đoan Hùng với tỷ lệ đạt 25% Mức độ biểu gen giống đạt mức thấp Ở CT 2, sau siêu âm 20 giây tiến hành hút chân không 30 giây ngâm với dịch khuẩn khoảng thời gian 20 tỷ lệ biểu gen gus có tăng lên rõ rệt Cao bưởi Phúc Trạch với tỷ lệ biểu tạm thời gen gus đạt 75% Bưởi Đoan Hùng bưởi Năm Roi có tỷ lệ biểu tạm thời gen gus thấp đạt 62,5% Mức độ biểu tạm thời gen gus có khác Biểu cao bưởi Phúc Trạch, bưởi Năm Roi bưởi Đoan Hùng có mức độ biểu gen trung bình 19 Đối với CT3, sau siêu âm hút chân không tiến hành ngâm với dịch khuẩn khoảng thời gian 30 phút Kết cho thấy bưởi Đoan Hùng Phúc Trạch cho tỷ lệ biểu tạm thời gen gus thấp đạt 37,5% 45,5 Bưởi Năm Roi cho tỷ lệ biểu tạm thời gen gus cao đạt 50,0% Mức độ biểu gen bưởi Năm Roi Phúc Trạch trung bình, bưởi Đoan Hùng thấp Như vậy, phương thức biến nạp khác cho hiệu chuyển gen khác Trong thí nghiệm CT2 (S20V30D20) cho hiệu chuyển gen cao a b Hình 4.1 Ảnh hưởng phương thức biến nạp tới khả tiếp nhận gen giống bưởi Phúc Trạch Ghi chú: a S20V30D20; b S30V30D30 S20: siêu âm 20 giây; V30: hút chân không 30 giây; D30: ngâm 30 phút (Mẫu có phần màu xanh đậm có gen gus chuyển vào; mẫu màu trắng khơng có gen gus chuyển vào) 20 4.3 Ảnh hưởng thời gian xâm nhiễm đến hiệu chuyển gen Qua bảng 4.3 cho thấy thời gian xâm nhiễm nhân tố ảnh hưởng đến hiệu biến nạp gen Bảng 4.3 Ảnh hưởng thời gian xâm nhiễm đến hiệu chuyển gen Giống Thời gian xâm nhiễm (phút) Đoan Hùng Số mẫu Tỷ lệ Mức nhuộm mẫu độ Gus nhuộm + biểu Gus (%) Năm Roi Tỷ lệ mẫu nhuộm Gus + (%) Mức độ biểu Phúc Trạch Tỷ lệ mẫu Mức độ nhuộm biểu Gus + (%) 10 40 10,0 + 5,0 ++ 10,0 + 20 40 32,5 +++ 20,0 ++ 45,5 ++ 30 40 25,0 ++ 42,5 ++ 32,5 ++ 40 40 20,0 + 15,0 + 20,0 + Ghi chú: +: Mức độ biểu gen thấp ++: Mức độ biểu gen trung bình +++: Mức độ biểu gen cao Đối với CT1 thời gian xâm nhiễm 10 phút tỷ lệ biểu tạm thời gen gus thấp Bưởi Năm Roi có tỷ lệ biểu tạm thời gen gus thấp đạt 5%, bưởi Đoan Hùng bưởi Phúc Trạch có tỷ lệ biểu tạm thời gen gus cao đạt 10% mức độ biểu gen thấp Mức độ biểu gen bưởi Năm Roi trung bình Ở CT2 thời gian xâm nhiễm 20 phút tỷ lệ biểu tạm thời gen gus tăng Cao bưởi Đoan Hùng Phúc Trạch với tỷ lệ biểu tạm thời gen gus đạt 32,5 45,5% Bưởi Năm Roi có tỷ lệ biểu tạm thời gen gus thấp đạt 20% Bưởi Đoan Hùng có mức độ biểu gen cao, bưởi Năm Roi Phúc Trạch có mức độ biểu gen trung bình 21 Đối với CT3 thời gian xâm nhiễm 30 phút tỷ lệ biểu tạm thời gen gus giảm so với CT2 Tỷ lệ biểu tạm thời gen gus giống Đoan Hùng 15%, giống Năm Roi Phúc Trạch 12,5% Mức độ biểu gen giống trung bình Đối với CT4, thời gian xâm nhiễm 40 phút tỷ lệ biểu tạm thời gen gus dao động khoảng 10-20% Cao bưởi Đoan Hùng với tỷ lệ biểu tạm thời gen gus 20% Tiếp theo bưởi Năm Roi với tỷ lệ 15% Thấp bưởi Phúc Trạch với tỷ lệ biểu tạm thời đạt 10% Mức độ biểu gen giống thấp Như vậy, thí nghiệm CT2 (thời gian xâm nhiễm 20 phút) cho hiệu biến nạp gen cao Tỷ lệ biểu tạm thời gen gus dao động từ 20-22,5%, mức độ biểu gen cao a b Hình 4.2 Ảnh hưởng thời gian xâm nhiễm đến hiệu chuyển gen bưởi Đoan Hùng Ghi chú: a thời gian xâm nhiễm 20 phút; b thời gian xâm nhiễm 30 phút (Mẫu có phần màu xanh đậm có gen gus chuyển vào; mẫu màu trắng khơng có gen gus chuyển vào) 22 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu kết luận Tuổi mẫu 20-25 ngày sau nảy mầm thích hợp cho biến nạp gen Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn 20 phút kết hợp siêu âm 20 giây hút chân không 30 giây cho hiệu biến nạp tốt Thời gian lây nhiễm 20 phút cho hiệu biến nạp cao giống bưởi Đoan Hùng Năm Roi, 30 phút cho giống bưởi Phúc Trạch 5.2 Đề nghị Cần tiến hành đánh giá ảnh hưởng số chất AS đến hiệu biến nạp gen So sánh diện tích trồng có múi năm Châu lục năm 2010, Châu phi có tổng diện tích lớn sau đến Châu Á, Châu Mỹ, Châu Âu vùng có diện tích nhỏ Châu Đại Dương 775 (FAO, 2010) Vùng Châu Phi: nước sản xuất nhiều như: Nigeria, Guinea, Angola…đã đưa Châu Phi lên đứng vị trí số diện tích trồng Bưởi năm 2010 857 145 Tuy có diện tích trồng lớn suất sản lượng lại chưa cao Châu Á châu lục có diện tích trồng lớn thứ hai giới sản lượng lại cao 415 661 Châu Âu có diện tích nhỏ thứ hai suất trung bình lại cao Năm 2008 suất đạt 300,222 tạ/ha, năm 2009 đạt 291,756 tạ/ha, năm 2010 đạt 311,518 tạ/ha (bảng 1.1) (FAO, 2010) Vùng lãnh thổ Châu Á sản xuất có múi gồm nước Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines, Nhật Bản, Malaysia…Đây vùng có diện tích trồng lớn thứ hai giới sản lượng lại dẫn đầu Năm 2008 sản lượng vùng Châu Á đạt 268 024 tấn, chiếm 49,98% Năm 2009 đạt 138 889, chiếm 52,15% Năm 2010 đạt 415 661, chiếm 54,54% tổng sản lượng tồn giới Vùng Châu Đại Dương có diện tích, suất, sản lượng thấp giới (bảng 1.1) (FAO, 2010) Vùng Châu Á khẳng định quê hương cam, quýt Tuy diện tích chưa nhiều sản lượng đạt mức cao giới Theo số liệu thống kê FAO tình hình sản xuất có múi số nước Châu Á sau: Bảng 1.2 Tình hình sản xuất có múi số nước Châu Á Năm 2008 TT Nước Năm 2009 Năm 2010 Diện Năng Diện Năng Diện Năng tích suất tích suất tích suất (ha) (tạ/ha) (ha) (tạ/ha) (ha) (tạ/ha) Trung Quốc 180 206 221 671 184 379 254,610 174 750 279,651 Ấn Độ 36 200 125 138 50 700 125,089 55 500 137,712 Nhật Bản 600 193 333 900 179,661 700 158,947 Philippines 20 956 95 283 20 912 91,903 20 987 89,741 Afghanistan 200 86 900 200 89,400 210 90,476 Nguồn: FAOSTAT/FAO Statistics - năm 2010 24 Phụ lục THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MS Bottle I II III IV V Component Stock Solution (g/l) NH4NO3 KNO3 MgSO4 7H2O MgSO4 4H2O ZnSO4 7H2O CuSO4 5H2O 82,5 95 37,0 2,23 1,058 0,0025 CaCl2.2H2O KI CoCl2.6H2O 44,0 0,083 0,0025 KH2PO4 H3BO3 Na2MoO4.2H2O FeSO4 7H2O Na2EDTA 2H2O 17,0 0,62 0,025 2,784 3,724 Amount to take preparation (ml) 20 10 Final concentratic (mg/ l) 1.650,0 1.900,0 370,0 22,3 10,6 0,025 10 440,0 0,83 0,025 10 170,0 6,2 0,25 10 27,85 37,25 0,5 2,0 0,1 0,5 0,5 2,0 0,1 0,5 mg/100ml Vitamin Nicotinic acid Glycine ThiamineHCl PyridoxineHCl 100 100 100 100 Inositol 100,0 Sucrose 30.000,0 Agar 6.000,0 pH 5,8 25 Phụ lục Môi trường LB (pH = 7) Thành phần Lượng (g/l) Trypton 10 Yeast extract NaCl 10 Phụ lục Thành phần dung dịch nhuộm X-Gluc X-Gluc: 5-bromo-4chloro-3indolyl- β-D-glucoronic acid 20mM X-Gluc: pha 100mg X-Gluc 9,6 ml N.N-dimethyl formamide (DMF) để dung dịch mẹ 20mM, trữ 20 0C Dung dịch đệm NaPO4 1M, pH = 7,0: dùng NaH2PO4 1M để chỉnh pH đến pH=7,0 toàn NaH2PO4 1M Dung dịch nhuộm X-Gluc Thành phần Dung dịch mẹ Nước cất Trong 10 ml 8,2 ml Đệm phosphate 100 mM Đệm NaPO4 1M,pH = 7,0 1,0 ml EDTA 10 mM EDTA 0,5 M 0,2 ml Triton X- 100 0,1% Triton X- 100 10% 0,1 ml X-Gluc 1mM X-Gluc 20 mM 0,5 ml Tổng cộng 10,0 ml 26 DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BAP OD DNA YEP FAO GMCs IAA IBA MS cs X-Gluc CT : : : : : : : : : : : : 6- Benzylaminopurine Optical density Deoxyribonucleic Acid Yeast extract medium Food and Agriculture Organization Genetically Modified Crops Indole -3- acetic acid β – Indol butyric acid Murashige & Skoog (1962) Cộng 5-bromo-4chloro-3indolyl- β-D-glucoronic acid Công thức