ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Triệu Tiến Sang NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHƠI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Triệu Tiến Sang NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHƠI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trần Văn Khoa 2 PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Trần Văn Khoa PGS.TS Đinh Đoàn Long Các số liệu, kết luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Triệu Tiến Sang LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Khoa – Chủ nhiệm Bộ môn Sinh học Di truyền y học – Học viện Qn y, Trưởng phịng Cơng nghệ Gen Di truyền tế bào –Trung tâm nghiên cứu Sinh Y dược – Học viện Quân y PGS.TS Đinh Đồn Long – Chủ nhiệm Bộ mơn Y dược học sở , Phó Chủ nhiệm Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu để hồn thành luận án tiến sĩ Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân – Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học, thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS Hoàng Văn Lƣơng – Phó giám đốc Học viện Quân y, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Sinh y Dược – HVQY; PGS.TS Nguyễn Duy Bắc, Phó Phịng Cơng nghệ Gen Di truyền tế bào đồng chí, đồng nghiệp Bộ môn Sinh học Di truyền y học; đồng chí Phịng Cơng nghệ gen Di truyền tế bào – Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dược học – Học viện Quân y nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu gen protein – Đại học Y Hà Nội, Phòng Xét nghiệm Di truyền – Bệnh Viện Từ Dũ Trung tâm Nghiên cứu Sinh Y Dược – Học viện Quân y cung cấp mẫu phục vụ cho nghiên cứu luận án Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình tất người thân, bạn bè giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Triệu Tiến Sang CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa Tiếng Việt Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh A Adenine Adenine ADN Deoxyribonucleic Acid Acid Deoxyribonucleic AF Amniotic Fluid Dịch ối AFP Alpha-fetoprotein Alpha-fetoprotein AIHW Australian Institute of Health and Viện sức khỏe phúc lợi Úc Welfare ATP Adenosine Triphosphate Adenosine Triphosphate Bp Base pairs Cặp bazơ C Cytosine Cytosine CAH Congenital Adrenal Hyperplasia Tăng sản thượng thận bẩm sinh CVS Chorionic villous sampling Lấy mẫu gai rau dNTPs Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotide Triphosphate Triphosphate Dị tật bẩm sinh DTBS EDTA FACS Ethylene Diamine Tetra Acetic Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid Acid Fluorescence-activated cell Phân loại tế bào hoạt hóa sorting huỳnh quang FISH Fluorescence in-situ hybridization Lai chỗ huỳnh quang fNRBCs Fetal nucleated red blood cells Tế bào hồng cầu có nhân phơi thai G Guanine Guanine HCĐ Down syndrome Hội chứng Down Kb Kilo base Kilo base Khoảng sáng sau gáy KSSG MACS Magnetic activated cell sorting Phân loại tế bào hoạt hóa từ tính Nhiễm sắc thể NST PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi nhờ polymerase PUBS Percutaneous umbilical cord Lấy mẫu máu cuống rốn qua da blood sampling Quantitative fluorescence - Phản ứng chuỗi định lượng Polymerase Chain Reaction huỳnh quang STR Short Tandem Repeat Lặp lại liên tiếp đoạn ngắn T Thymine Thymine Taq – Thermus aquaticus polymerase QF-PCR polymerase TBE Tris - Boric – EDTA Tris - Boric – EDTA TOP Termination of pregnancy Đình thai UV Ultra Violet Tia cực tím β hCG Beta_human chronic Beta_human chronic gonadotropin gonadotropin DANH MỤC BẢNG TRANG STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Bảng 1.1 Thống kê so sánh sản phẩm thương mại kỹ thuật NIPT Bảng 1.2 Các Kít sử dụng kỹ thuật NIPT ứng dụng Mỹ Bảng 2.1 Thành phần hóa chất QIAamp ADN blood Mini Kit Bảng 2.2 Trình tự kích thước sản phẩm khuếch đại gen SRY GAPDH Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR vòng vòng Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen mồi ngồi mồi gen SRY chu trình nhiệt nhân gen GAPDH Bảng 2.5 Trình tự mồi đầu dị phản ứng định lượng huỳnh quang gen DYS14 GAPDH Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng Realtime-PCR Bảng 2.7 Công thức ứng dụng chất gắn bề mặt hạt từ tính Bảng 2.8 Các locus STR NST 13, 18, 21 NST X, Y Bảng 2.9 Thành phần thể tích phản ứng QF-PCR Bảng 2.10 Chu trình nhiệt phản ứng QF-PCR Bảng 2.11 Các thành phần cho mẫu điện di Bảng 2.12 Chu trình nhiệt biến tính sản phẩm PCR cho điện di mao quản Bảng 2.13 Phân tích tỷ lệ peak huỳnh quang STR Bảng 2.14 Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Nested PCR Realtime PCR Bảng 3.1 Nồng độ ADN (ng/µl) phương pháp tách nhiệt phương pháp tách Kít Qiagen Bảng 3.2 Kết số copy gen DYS14 (A: copy/ml) nồng độ gen DYS14/GAPDH (B: %) tuần đến 12 thai kỳ trường hợp thai nam Bảng 3.3 Kết số copy gen GAPDH (A: copy/ml) tuần đến 12 thai kỳ trường hợp thai nữ Bảng 3.4 So sánh kết kỹ thuật Nested PCR, Realtime 33 34 49 50 51 51 52 53 54 57 58 58 59 59 61 62 63 71 72 75 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 PCR với siêu âm tuần thứ 16/ sau sinh (A) Bảng 3.5 Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Nested PCR Realtime-PCR tuần tuổi thai Bảng 3.6 Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Nested PCR Realtime-PCR tuần tuổi thai Bảng 3.7 Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Nested PCR Realtime-PCR tuổi thai >8 tuần Bảng 3.8 Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Realtime PCR Nested PCR tuần tuổi thai Bảng 3.9 Kết nhân gen SRY (trước sinh: A) kiểm chứng sau sinh (B) 189 mẫu nghiên cứu tuổi thai từ 7+6 đến 9+2 Bảng 3.10 Kết nồng độ ADN biến thiên sau sinh Bàng 3.11 Nồng độ ADN phôi thai tự huyết tương mẹ mang thai nam bình thường Bảng 3.12 Nồng độ ADN phôi thai tự huyết tương mẹ mang thai nam bất thường Bảng 3.13 Kết sàng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Bảng 3.14 Kết sàng lọc bệnh loạn dưỡng Duchenne Bảng 3.15 Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen RhD Bảng 3.16 Kết chẩn đốn nhóm máu Rh thai nhi tuần thứ Bảng 3.17 Kết thử nghiệm tế bào phôi thai tự 76 76 77 77 85 87 98 99 107 110 111 112 116 DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG STT Hình1.1: Các bước chình kỹ thuật FISH 24 Hình 1.2: Nguyên tắc phản ứng Nested PCR (PCR lồng) 25 Hình 1.3 Phương pháp Real-time PCR với mẫu dị TaqMan 26 Hình 1.4 Tóm tắt chế hoạt động Taqman probe Realtime- 27 PCR Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 48 Hình 2.2 Trình tự đoạn gen DYS14 53 Hình 2.3 Trình tự đoạn gen GAPDH 53 Hình 2.4 Các chất gắn bề mặt ̣t từ tính 54 Hình 2.5 Phân tích kết QF-PCR bình thường 59 10 Hình 2.6 Phân tích tính kết tỷ lệ alen 60 11 Hình 2.7 Ảnh phân tích kết QF-PCR locus bị Trisomy 61 12 Hình 3.1 Ảnh điện di gen SRY GAPDH mẫu nghiên cứu 65 13 Hình 3.2 Ảnh điện di gen SRY GAPDH mẫu nghiên cứu từ 811 - 825 66 14 Hình 3.3 Ảnh kết điện di gen SRY GAPDH mẫu nghiên cứu từ 826 - 840 67 15 Hình 3.4 Phân tích đường chuẩn gen DYS14 gen GAPDH 70 16 Hình 3.5 Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 269 đến 78 mẫu 301 17 Hình 3.6 Ảnh nhân gen GAPDH tuổi thiai tuần tuổi từ mẫu 269 đến 297 78 18 Hình 3.7 Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 269 đến 79 mẫu 321 19 Hình 3.8 Ảnh điện di mẫu tuổi thai tuần tuổi từ mẫu 269 đến 80 mẫu 321 24 Hình 3.9 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trường hợp 269 81 25 Hình 3.10 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trường hợp 277 82 26 Hình 3.11 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trường hợp 296 83 27 Hình 3.12 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trường hợp 551 84 28 Hình 3.13 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự sau sinh 88 29 Hình 3.14 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu QF64 (tương ứng mẫu nghiên cứu BT05) nam bình thường 90 30 Hình 3.15 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu QF 61 92 (tương ứng với mẫu DT 02) nam mang hội chứng Down 31 Hình 3.16 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu DT02 với cặp mồi extra 93 Marker 21 32 Hình 3.17 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu QF56 (tương ứng với mẫu DT03) mang hội chứng Klinefelter 94 33 Hình 3.18 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu DT03 (QF56) với mồi extra marker locus X, Y 95 34 Hình 3.19 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu DT08 mang hội chứng Edward 96 35 Hình 3.20 Ảnh nhuộm FISH tế bào phơi thai mẫu số 831 101 36 Hình 3.21 Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai mẫu số 837 102 37 Hình 3.22 Ảnh điện di mao quản sản phẩm QF-PCR mẫu nghiên cứu 964 với locus NST giới tính X, Y 104 38 39 10 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Trịnh Văn Bảo (2004), Dị dạng bẩm sinh, NXB Y học [2] Trịnh Văn Bảo (2002-2007), “Tư vấn di truyền- sàng lọc chẩn đốn trước sinh mơn y sinh học- di truyền đại học y Hà Nội”, Báo cáo toàn văn, Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc chẩn đoán trước sinh, Hà Nội, tr.114-120 [3] Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương (2010), Di truyền y học, Nhà xuất giáo dục [4] Trịnh Văn Bảo (2006), “Tư vấn di truyền-một biện pháp có hiệu để phịng chữa bệnh tật di truyền”, Tạp chí Nghiên cứu y học, 40(1), tr.72-75 [5] Nguyễn Huy Cận, Bùi Thị Tía (1967), “Tật bẩm sinh sơ sinh Bệnh viện C từ 1963 đến 1966”, Nội san Sản phụ khoa, 2, tr.6 -8 [6] Huỳnh Thị Kim Chi (1994), Tình hình DTBS tỉnh Sơng Bé vai trò yếu tố nguy gây DTBS địa phương, Luận văn tốt nghiệp BSCK cấp II, Trường Đại học Y khoa Hà Nội [7] Nguyễn Trần Chiến, Trần Văn Khoa (2011), Di truyền y học, NXB Quân đội nhân dân [8] Đào Thị Chút (1994), Nhận xét 30 trường hợp DTBS bệnh viện phụ sản Hải phòng, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ chuyên khoa cấp II Trường Đại học Y khoa Hà Nội [9] Trần Danh Cường (2005), “Một số nhận xét kết chọc hút nước ối chẩn đoán trước sinh Bệnh viện phụ sản trung ương”, Nội san Sản Phụ khoa, số đặc biệt, tr.348-356 [10] Trần Danh Cường (2005), “Một số nhận xét kết siêu âm hình thái thai nhi chẩn đốn trước sinh bệnh viện Phụ sản Trung ương”, Nội san Sản Phụ Khoa, số đặc biệt, tr.336-347 11 [11] Trần Danh Cường (2007), “Hình ảnh siêu âm thai nhi bất thường nhiễm sắc thể”, Báo cáo toàn văn, Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc chẩn đoán trước sinh, Hà Nội, tr.156-167 [12] Phạm Gia Đức (1971), “Tình hình DTBS qua 12 năm 1958 đến 1970 Viện bảo vệ bà mẹ trẻ sơ sinh phương huớng nghiên cứu nay” Y học Việt Nam, 1, tr.21-29 [13] Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007), “Chẩn đoán di truyền phân tử bệnh Thalassaemia bệnh viện Từ Dũ”, Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc chẩn đoán trước sinh, Hà Nội, tr.214-218 [14] Phan Thị Hoan (2002), “Phân tích số yếu tố nguy sinh DTBS số nhóm dân miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, chuyên san di truyền - y học, số đặc biệt chào mừng 100 năm trường đại học Y Hà nội, tr.25-34 [15] Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Việt Hùng, Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương (2004), “Chẩn đoán xác định số dị tật thai nhi phân tích nhiễm sắc thể tế bào ối ni cấy”, Tạp chí nghiên cứu Y học, 28(2), tr.5-12 [16] Mai Thu Liên, Phùng Như Toàn, Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007), Kết nuôi cấy gai Bệnh viện Từ Dũ, Báo cáo hội nghị quốc tế tư vấn di truyền sàng lọc chẩn đoán trước sinh, Đại học Y Hà nội [17] Nguyễn Thị Phượng (2002), “DTBS bệnh di truyền Viện nhi quốc gia Hà Nội”, Tạp chí di truyền học ứng dụng, chuyên san di truyền - y học, số đặc biệt chào mừng 100 năm Trường Đại học Y Hà Nội, tr.16-24 [18] Ngô Gia Thạch, Trịnh Văn Bảo, Dương Tử Kỳ, Thái Phương Liên (1986), “Các DTBS qua điều tra 6661 trẻ sơ sinh” Thông tin di truyền y học, 1, tr.20-25 12 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI [19] Abudu O.O., Awonuga A.O (1989), “Fetal macrosomia and pregnancy outcome in Lagos”, Int J Gynaecol Obstet., 28(3), pp 257-62 [20] Adinolfi M (2001), “Prenatal detection of chromosomal disorders by QF-PCR”, Lancet, 358, pp 1030-1031 [21] Akolekar, Kirstin F., Ramesh K (2011), “Fetal RHD Genotyping in Maternal Plasma at 11–13 Weeks of Gestation”, Fetal Diagn Ther., 29, pp 301–306 [22] Alen Chan K.C (2004), “Size Distribution of maternal and Fetal DNA in maternal Plasma”, Clin Chimi., 50, pp 88-92 [23] Andonova S., Dimitrova V., Boneva I., Kremensky I (2008), “A case of a bloodstained amniotic fluid sample from a pregnant woman with Down syndrome analyzed by QF-PCR after low-speed centrifugation”, Prenat Diagn., 28(5), pp 457-9 [24] Aykut A., Onay H., Sagol S., Gunduz C., Ozkinay F., Cogulu O (2013), “Determination of fetal rhesus d status by maternal plasma DNA analysis”, Balkan J Med Genet., 16(2), pp 33-8 [25] Babochkina, Mergenthaler S., Dinges T.M., Holzgreve W., and Hahn S (2005), “Direct detection of fetal cells in maternal blood: a reappraisal using a combination of two different Y chromosome-specific FISH probes and a single X chromosome-specific probe”, Arch Gynecol Obstet., pp 1-4 [26] Bayrak-Toydemir P., Pergament E., Fiddler M (2003), “Are fetal cells in maternal plasma Really there? We think they are”, J Hum Genet., 48, pp 665667 [27] Benn P (2002), “Advance in prenatal screening for Down syndrome: General principles and second trimester testing”, Clin Chimi Acta., 323, pp.1-16 13 [28] Bianchi D., Flint A., Pizzimenti M., Knoll J., Latt S (1990), “Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood”, Proc Natl Acad Sci USA., 87, pp 3279-3283 [29] Bianchi D., Mahr A., Zickwolf G., Houseal T., Flint A., Klinger K (1992), “Detection of fetal cells with 47,XY,+21 karyotype in maternal peripheral blood”, Hum Genet., 90, pp 368-370 [30] Bianchi D., Simpson J., Jackson L (2002), “Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study”, Prenat Diagn., 22, pp 609-615 [31] Bianchi D., Williams J., Sullivan L (1997), “PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploid pregnancies”, Am J Hum Genet., 61, pp 822-829 [32] Bianchi D., Zickwolf, Gretchen K., Weil, Gary J (1996), “Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum”, Proc Natl Acad Sci USA, 93, pp 705-708 [33] Bischoff F (1998), “Prenatal diagnosis of fetal cell isolated from maternal blood: Five-color fluorecent in situ hybridization analysis on flow-sorter cells for chromosomes X, Y, 13, 18 and 21”, Am J Obstet Gynecol., 170(1), pp 203209 [34] Bombard, Akolekar, Farkas, (2011), “Fetal RHD genotype detection from circulating cell-free fetal DNA in maternal plasma in non-sensitized RhD negative women”, Prenat Diagn., 31, pp 802–808 [35] Boyd P., Chamberlain P., Hicks N (1998), “6-year experience of prenatal diagnosis in an unselected population in Oxford, UK”, Lancet, 352, pp 15771581 [36] Buchanan A., Sachs A., Toler T., Tsipis J (2014), “NIPT: current utilization and 14 implications for the future of prenatal genetic counseling”, Prenat Diagn., 34, pp 850–857 [37] Buscaglia M., Ghisoni L., and Levi-Setti P (1996), “Alpha-fetoprotein elevation in maternal serum after percutaneous umbilical blood sampling (PUBS)”, Prenat Diagn, 16, pp 375-376 [38] Bussani C., Cioni R., Mattei A., Fambrini M., Marchionni M., Scarselli G (2007), “Prenatal diagnosis of common aneuploidies in transcervical samples using quantitative fluorescent-PCR analysis”, Mol Diagn Ther., 11(2), pp 117121 [39] Cacheux V., Milesi-Fluet C., Tachdjian G., Druart L., Bruch J., Hsi B., Uzan S (1992), “Detection of 47,XYY trophoblast fetal cells in maternal blood by fluorescence in situ hybridization after immunomagnetic lymphocyte depletion and flow cytometric sorting”, Fetal Diagn Ther., 7, pp 190-194 [40] Campbell R (1998), The latest in ultrasound:three-demensional imaging Part II Europe J Radiol, 27, pp 183-187 [41] Canfield M., Honein M., Yuskiv N., Xing J., Mai C., Collins J., Devine O., Petrini J., Ramadhani T., Hobbs C., Kirby R (2006), “National estimates and race/ethnic-specific variation of selected birth defects in the United States 19992001”, Birth Defects Res A Clin Mol Teratol., 76(11), pp 747-756 [42] Chetty S., Garabedian J., Norton E (2013), “Uptake of noni nvasive prenatal testing (NIPT) in women following positive aneu ploidy screening”, Prenat Diagn., 33, pp 542–546 [43] Chiu R., Chan K., Gao Y., Lau V., Zheng W., Leung T (2008), “Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma”, Proc Natl Acad Sci USA.,105, pp 20458–20463 [44] Chris M.,Tianhua H (2003), “Accuaracy of trisomy 18 screening using the 15 second-trimester triple test”, Prenat Diagn., 23, pp 443-446 [45] Chung S., Wong S., Clarke B., Patterson M., Walker W., Chui D (1984), “Human embryonic zeta-globin chains in adult patients with alphathalassemias” Proc Natl Acad Sci USA., 81, pp 6188-6191 [46] Chungwen W (2001), “Screening cell-free fetal DNA in maternal plasma”, Clin Chem., 47, pp 336 [47] Chungwen W., Devereux N., Saller (2001), “Detection and Quantification by Homogeneous PCR of Cell-free Fetal DNA in Maternal Plasma”, Clin Chem., 47(2), pp 336-338 [48] Clayton E., Feldhaus W., Whiteacre F (1964), “Fetal erythrocytes in the maternal circulation of pregnant women”, Obs Gynecol., 23, pp 915-919 [49] Costa J., Benachi A., Gautier E., Jouannic J., Ernault P., Dumez Y (2001), “First-trimester fetal sex determination in maternal serum using Real-time PCR”, Prenat Diagn., 21, pp 1070–1074 [50] Cuckle H., Aitken D., Goodburn S (2004), “Age- standardisation when target setting and auditing performance of Down syndrome screening programmes”, Prenat Diagn., 24(11), pp 851-856 [51] Cullough M., Almasri A., Guan X., Jennifer A., Susan C., Amin R., Cosmin D., Paul O., Allan T (2014), “Non- Invasive Prenatal Chromoso mal Aneuploidy Testing - Clinical Experience: 100,000 Clinical Samples” PLoS ONE, 9(10), pp 1-9 [52] Dai L., Zhu J., Liang J Wang H., Mao M (2011), “Birth defects surveillance in China”, World J Pediatr., 7(4), pp 302-310 [53] Dennis L., Zhang, Leung, Lau, (1999), “Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma” Am J Hum Genet 64, pp 218–224 [54] Douglas G., Thomas L., Carr M., Cullen N., Morris R (1959), “Trophoblast in the circulating blood during pregnancy” Am J Obstet Gynecol.,78, pp 960-973 16 [55] Du J., Zou X., Pan Y (2009), “Noninvasive prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia in cell–free fetal DNA with cold-PCR”, de ES Ramos., pp 395 [56] Dugo N., Padula F., Mobili L., Brizzi C., D’Emidio L., Cignini L, Mesoraca A., Bizzoco D., Cima A., Giorlandino C (2014), “Six consecutive false positive cases from cell-free fetal DNA testing in a single referring centre”, J O Prenat Medic., 8(1/2), pp.31-35 [57] Durm M., Haar F.M, Hausmann M., Ludwig H., Cremer C (1997), “Optimized Fast-FISH with alpha-satellite probes: acceleration by microwave activation”, Braz J Med Biol Res., 30, pp.15-23 [58] Durrant L., Martin W., McDowall K., Liu D (1996), “Isolation of fetal trophoblasts and nucleated erythrocytes from the peripheral blood of pregnant women for prenatal diagnosis of fetal aneuploides”, Early Hum Dev., 47, pp 7983 [59] Edwards J., Dent T., Kahn J (1966), “Monozygotic twins of different sex”, J Med Genet., 3, pp 117–123 [60] Elena P., Gian C., Federica T., Vittorio B., Michela C., Luana P., Fabiana G., Mara M., Giuliana C (2015), “Non-Invasive Prenatal RHD Genotyping Using Cell-Free Fetal DNA from Maternal Plasma: An Italian Experience”, Transfus Med Hemother., 42, pp.22–28 [61] Fairbrother G., Johnson S., Musci J., Song K (2013), “Clinical experience of noninvasi ve prenatal testing with cell-free DNA for fetal trisomies 21, 18, and 13, in a general screening population”, Prenat Diagn., 33, pp 580–583 [62] Fernández-Martínez F., Galindo A., Moreno-Izquierdo A (2007), “Application of QF-PCR for the prenatal assessment of discordant monozygotic twins for fetal sex”, Prenat Diagn., 27(7), pp 648-652 17 [63] Finegan J., Quarrington B., Hughes H (1990), “Child outcome following midtrimester amniocentesis: development, behaviour, and physical status at age years”, Br J Obstet Gynaecol, 97, pp 32-40 [64] Fodor F., Kamory E., Csokay B., Kopa Z., Kiss A., Lantos I., Tisza T (2007), “Rapid detection of sex chromosomal aneuploidies by QF-PCR: application in 200 men with severe oligozoospermia or azoospermia”, Genet Test., 11(2), pp 139-145 [65] Gahan J., Porto M (1994), Diagnostic Obtetrical Ultrasound Lippincotte Company, chapter 8,9,10,11,12, pp.134-282; chapter 16 – 21, pp 326-475 [66] Ganshirt D., Borejesson-Stoll R., Burschyk M (1994), “Successful prenatal diagnosis from maternal blod bwith magnetic-activated cell sorting”, Ann NY Acad Sci., 731, pp 103-114 [67] Ganshirt-Ahlert D., Burschyk M., Garritsen, H (1992), “Magnetic cell sorting and the transferrin receptor as potential means of prenatal diagnosis from maternal blood”, Am J Obs Gynecol., 166, pp 1350-1355 [68] Gole L., Lian N., Rauff M., Biswas A., Choolani M (2008), “Prenatal detection of isochromosome 21 by QF-PCR A comparison between FISH and traditional karyotyping”, Fetal Diagn Ther., 24(1), pp 47-50 [69] Groisman B., Bidondo M., Barbero P., Gili J., Liascovich R (2013), “RENAC: National Registry of Congenital Anomalies of Argentina”, Arch Argent Pediatr., 111(6), pp 484-494 [70] Grosset L., Barelet V., Ordatchenko N (1974), “Antenatal fetal sex determination from maternal blood during pregnancy”, Am J Obs Gynecol., 120, pp 60-63 [71] Haddow J (1994), “Reducing the need for amniocentesis in women 35 years of age or older with serum marker for screening”, NEJM, 330(16), pp 1114-1118 [72] Hahn S, Schoot C., Chitty L (2008), “Non-invasive prenatal diagnosis and determination of fetal Rh status”, Semin Fet Neonatal Med 13, pp 63–68 18 [73] Hahn S., Zhong X., Holzgreve W (2002), “Single cell PCR in laser capture microscopy”, Methods Enzymol, 356, pp 295-301 [74] Hahnemann J., Vejerslev L (1997), “European collaborative research on mosaicism in CVS (EUCROMIC)-fetal and extrafetal cell lineages in 192 gestations with CVS mosaicism involving single autosomal trisomy”, Am J Med Genet., 70, pp 179-187 [75] Herzenberg L., Bianchi D., Schrder J., Cann H., Iverson G (1979), “Fetal cells in the blood of pregnant women: detection and enrichment by fluorescenceactivated cell sorting”, Proc Natl Acad Sci USA., 73, pp 1453-1455 [76] Himmetoglu O., Erdem A., Erdem M., Arslan M., Yazici G., Eskandari R (2002), “The effect of maternal anemia and iron deficiency on fetal erythropoiesis: comparison between serum erythropoietin, hemoglobin and ferritin levels in mothers and newborns”, J Matern Fet Neonatal Med., 11(5), pp 329-332 [77] Iverson G., Bianchi D., Cann H., Herzenberg L (1981), “Detection and isolation of fetal cells from maternal blood using the flourescenceactivated cell sorter (FACS)”, Prenat Diagn., 1, pp 61-73 [78] Khoshnood B., Greenlees R., Loane M., Dolk H (2011), “EUROCAT public health indicators for congenital anomalies in Europe”, Birth Defects Res A Clin Mol Teratol., 91(1), pp 16-22 [79] Kolialexi A., Tsangaris G T., Antsaklis A., Mavrou A (2004), “Fetal cells in maternal plasma are found in a late state of apoptosis”, Prenat Diagn., 24, pp 719-721 [80] Kondo T., Sekizawa A., Saito H., Jimbo M., Sugito Y., Okai T (2002), “Fate of fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood: apoptosis is induced by maternal oxygen concentration”, Clin Chem., 48, pp 1618-1620 [81] Lau T., Cheung S., Lo P., Pursley A., Chan M., Jiang F., Zhang H., Wang W., 19 Jong L., Yuen O., Chan H., Chan W., Choy K (2014), “Non-invasive prenatal testing for fetal chromosomal abnormalities by low-coverage whole-genome sequencing of maternal plasma DNA: review of 1982 consecutive cases in a single center”, Ultrasound Obstet Gynecol., 43, pp 254–264 [82] Lazjuk G., Nykolaev D., Novykova I (1996b), “Congential and hereditary pathology in Belarus in view of the Chernobyl catastrophe” Medicne, 3(12), pp.7-8 [83] Lin H., Lin S., Chen Y., Hung H., Kao H., Hsu C., Chen M., Chang J., Ho C., Huang F., Shyur S., Lin D., Lee H (2006), “Clinical characteristics and survival of trisomy 18 in a medical center in Taipei, 1988-2004”, Am J Med Genet A., 140(9), pp 945-951 [84] Lo Y., Bowell P., Selinger M (1993), “Prenatal determination of fetal RhD status by analysis of peripheral blood of rhesus negative mothers”, Lancet, 341, pp 1147-1148 [85] Lo Y., Corbetta N., Chamberlain P (1997), “Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum”, Lancet, 350, pp 485–487 [86] Lo Y., Lau T., Zhang J., Leung T., Chang A., Hjelm N (1999), “Increased fetal DNA concentrations in the plasma of pregnant women carrying fetuses with trisomy 21”, Clin Chem., 45, pp.1747–1751 [87] Lo Y., Patel P., Wainscoat J., Sampietro M., Gillmer M., Fleming K (1989), “Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood”, Lancet, 2, pp 1363-1365 [88] Lo Y., Tein M., Lau T., Haines C., Leung T., Poon P (1998), “Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis”, Am J Hum Genet 62, pp 768–775 [89] Lothar K., Karsten R (2000), “Detection of aneuploidy in chromosomes X, Y, 13, 18 and 21 by QF-PCR in 662 selected pregnancies at risk”, Mol Hum 20 Reprod., 6(9), pp 855-860 [90] Mann K., Petek E., Pertl B., (2009), “Prenatal detection of chromosome aneuploidy by quantitative fluorescence PCR”, Methods Mol Biol., 444, pp 7194 [91] Marden P., Smith D., Donald M (1964), “Congential anomalist in the newborn infant, including minor variations a study of 4412 babies by suface examination for anomalies and buccal smear for sex chromatin”, J Pediatr., 64, pp 357-371 [92] Mary R., Narelle G., Elizabeth A., A review of the National Congenital Malformations and Birth Defects Data Collection, AIHW National Perinatal Statistics Unit Sydney, AIHW Cat, No PER 23 [93] Meagan S., Kimberly M., Alexandrea H., Jeannie V (2014), “A case of false negative NIPT for Down syndrome – lesson learned”, Hidawi Publishing Corporation Case Reports in Genetics, 2014, pp.1-3 [94] Mergenthaler S., Babochkina T., Kiefer V., (2005), “FISH analysis of all fetal nucleated cells in maternal whole blood: improved specificity by the use of two Y-chromosome probes”, J Histochem Cytochem., 53, pp 319-322 [95] Morain S., Michael F., Michelle M (2013), “A New Era in Noninvasive Prenatal Testing” N Engl J Med., 369(6), pp 499-501 [96] Mueller U., Hawes C., Wright A (1990), “Isolation of fetal trophoblast cells from peripheral blood of pregnant women”, Lancet, 336, pp 197-200 [97] Nakonieczny M., Jezierski G., Woźniak I (2008), “Prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidies using quantitative fluorescent PCR (QF-PCR)”, Przegl Lek., 65(3), pp 119-21 [98] Oepkes D., Yaron Y., Kozlowski P., Rego M , Bartha J., Akker E., Dornan S., Krampl-Bettelheim E., Schmid M., Wielgos M., Cirigliano V., Renzo G., Cameron A., Calda P., Tabor A (2014), “Counseling for non-invasive prenatal testing (NIPT): what pregnant women may want to know”, Ultrasound Obstet 21 Gynecol., 44, pp 1–5 [99] Padilla C., Cutiongco E., Sia J (2003), “Birth defects ascertainment in the Philippines”, Southeast Asian J Trop Med Public Health., 34(3), pp 239-243 [100] Palomaki G., Deciu C., Kloza E., Lambert G, Haddow J., Neveux L (2012), “DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study”, Genet Med., 14, pp.296–305 [101] Pangkanon S., Sawasdivorn S., Kuptanon C., Chotigeat U., Vandepitte W (2014), “Establishing of National Birth Defects Registry in Thailand”, J Med Assoc Thai., 97(6), pp 182-188 [102] Papp C., Ban Z., Szigeti Z., Csaba A., Beke A., Papp Z (2007), “Role of second trimester sonography in detecting trisomy 18: a review of 70 cases”, J Clin Ultrasound, 35 (2), pp 68–72 [103] Pertl B (1997), “Quantitative fluorescence polymerase chain reaction for rapid prenatal detection of common aneuploidies and fetal sex”, Am J Obstet Gyneco.l, 177(4), pp 899-906 [104] Peter A., Benn, James F (2007), “Second trimester prenatal ultrasound and screening for Down syndrome”, Prenat Diagn., 27, pp 884 [105] Phillips O., Elias S., Shulman L., Andersen R., Morgan C., Simpson J (1992), “Maternal serum screening for fetal Down syndrome in women less than 35 years of age using alpha-fetoprotein, hCG, and unconjugated estriol: a prospective 2year study”, Obstet Gynecol., 80, pp.353-358 [106] Quezada M., Gil M., Francisco C., Orosz G., Nicolaides K (2014), “Screening for trisomies 21, 18 and 13 by cell-free DNA analysis of maternal blood at 10–11 weeks’ gestation and the combined test at 11–13 weeks”, Ultrasound Obstet Gynecol, 45, pp 36–41 [107] Richard P., Thomas J., Maurel K (2014), “Noninvasive prenatal screening for 22 fetal trisomies 21, 18, 13 and the common sex chromosome aneuploidies from maternal blood using massively parallel genomic sequencing of DNA”, Am J Obstet Gynecol., 211(365), pp 1-12 [108] Rossa W., Chiu K., Allen C., Yuan G (2008), “Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma”, Proc Natl Acad Sci USA., 105(51), pp 20458– 20463 [109] Samura O., Pertl B., Sohda S., Johnson K., Sekizawa A., Falco V., Elmes R., Bianchi D (2000), “Female fetal cells in maternal blood: use of DNA polymorphisms to prove origin”, Hum Genet., 107, pp 28-32 [109] Schmorl G (1893), “Pathologisch-anatomische Untersuchungen über Publereklampsie”, Leipzig: Vogel [110] Sekizawa A., Kimura T., Sasaki M., Nakamura S., Kobayashi R., and Sato T., (1996), “Prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy using a single fetal nucleated erythrocyte in maternal blood”, Neurology., 46, pp 1350-1353 [111] Sekizawa A., Purwosunu Y., Matsuoka R (2007), “Recent advances in noninvasive prenatal DNA diagnosis through analysis of maternal blood”, J of Obste Gynecol Res., 33,pp 747-764 [112] Sekizawa A., Samura O., Zhen D., Falco V., Farina A., and Bianchi D (2000), “Apoptosis in fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood, Prenat Diagn., 20, pp 886-889 [113] Shengnan J., Xueqin Michelle L., Haiyang L., Kenneth Y., George S., Chunming D (2012), “Further Improvement in Quantifying Male Fetal DNA in Maternal Plasma”, Clin Chem., 58(2), pp 465–468 [114] Shi L (2002), “Prevalence of birth defects and parental work in Singapore live births form 1994 to 1998: A population-based study”, Occup Med., 52(6), pp 325-331 23 [115] Shirly I (1992), “Rontine radiographer screening for fetal abnor malities by ultrasound in an unselected lanrisk population”, Br J Radiol., 65, pp 564-567 [116] Simpson J (2013), “Cell-free fetal DNA and maternal serum analytes for monitoring embryonic and fetal status”, Fertility and Sterilitym, 99(4), pp 11241134 [117] Sípek A., Gregor V., Horáček J., Langhammer P (2012), “Course of congenital malformation incidences and their changes over time in children born in the Czech Republic”, Ceska Gynekol., 77(5), pp 424-436 [118] Sparks A., Wang E., Struble C., Barrett W., Stokowski R., McBride C., (2012), “Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy” Prenat Diagn., 32, pp.3–9 [119] Stephensen S., Sigfússon G., Eiríksson H., Sverrisson J., Torfason B., Haraldsson A., Helgason H (2002), “Congenital heart defects in Iceland 1990-1999”, Laeknabladid, 88(4), pp 281-287 [120] Tabor A., Philip J., Madsen M., Bang J., Obel E., and Norgaard-Pedersen B (1986), “Randomised controlled trial of genetic amniocentesis in 4606 lowrisk women”, Lancet, 1, pp 1287-1293 [121] Tan K., Tan T., Tan J., Tan I., Chew S., Yeo G (2005), “Birth defects in Singapore: 1994-2000”, Singapore Med J., 46(10), pp 545-552 [122] Thomas, Tutschek, Fros (1995), “The time of appearance and disappearance of fetal DNA from the maternal circulation”, Prenat Diagn., vol 15, pp 641-646 [123] Thompson and Thompson Genetics in Medicine – 6th edition - chapter [124] Thompson and Thompson Genetics in Medicine – 6th edition – Chapter [125] Troeger C., Zhong X., Burgemeister R., Minderer S., Tercanli S., Holzgreve W., Hahn S (1999), “Approximately half of the erythroblasts in maternal blood are of fetal origin”, Mol Hum Reprod, 5, pp 1162-1165 24 [126] Umberto N., Faustina L., Federica N., Cristina C., Hung B (2008), “The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration” Hum Reprod Update, 10(6), pp 541–548 [127] Van L., Arends J., Leffers P., Fuente A., Looij H., Geraedts J (1993) “The value of histomorphological features of chorionic villi in early spontaneous abortion for the prediction of karyotype”, Histopathology, 22, pp 557-563 [128] Vankayalapati P., Hollis B (2004), “Role of ultrasound in obstetrics”, Current Obstet Gynecol., 14, pp 92-98 [129] Wald N., (2000), “Advances in antenatal screening for Down’s syndrome”, Bailliere’s Clin Obstet Gynaecol., 14, pp 563-580 [130] Walknowska J., Conte F., Grumbach M (1969), “Practical and theoretical implications of fetal-maternal lymphocyte transfer”, Lancet, 1, pp 1119-1122 [131] Wang J., Zhen D., Falco V., Farina A., Zheng Y., Delli-Bovi L., Bianchi D (2000), “Fetal nucleated erythrocyte recovery: fluorescence activated cell sortingbased positive selection using anti-gamma globin versus magnetic activated cell sorting using anti-CD45 depletion and anti-gamma globin positive selection”, Cytometry, 39, pp 224-230 [132] Willems P., Dierickx H., Vandenakker E., Bekedam D., Segers N., Deboulle K., Vereecken A (2014), “The first 3,000 Non-Invasive Prenatal Tests (NIPT) with the Harmony test in Belgium and the Netherlands”, Facts Views Vis Obgyn., 6(1), pp 7–12 [133] Zeinab K., Leili M., Reza R., Farzaneh A., Abbas B., Masooma A., Sedigheh S (2015), “Evaluation of a Modified DNA Extraction Method for Isolation of CellFree Fetal DNA from Maternal Serum”, A J O Medic Biotech., 7(2), pp.85-88 [134] Zolotukhina T.V (2005), “Analysis of Cell-free Fetal DNA in Plasma and Serum of Pregnant Women”, J Histochem Cytochem, 53, pp 297-299 25