BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY GÁO VÀNG, NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L (RUBIACEAE) S K C 0 9 MÃ SỐ: T2015-66TĐ S KC 0 Tp Hồ Chí Minh, 2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY GÁO VÀNG, NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L (RUBIACEAE) Mã số: T2015-66TĐ Chủ nhiệm đề tài: TS Phan Thị Anh Đào Thành viên đề tài: TS Võ Thị Ngà TP HCM, 2015 DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI ST T Đơn vị công tác lĩnh vực chuyên môn Họ tên Phan Thị Anh Đào Bộ môn CN Hóa học- Khoa CN Hóa Nội dung nghiên cứu giao Chủ trì học& Thực phẩm, ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP HCM Võ Thị Ngà Bộ môn Hóa Phân Tich, Khoa Hóa, ĐH Khoa học Tự Nhiên TP HCM Tham gia ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Tên đơn vị nước Nội dung phối hợp nghiên cứu Họ tên người đại diện đơn vị Phòng thí nghiệm Hóa Dược– ĐH Khoa học Tự nhiên Tp HCM Thử hoạt tính kháng oxy Nguyễn Xuân Hải hóa Phòng phân tích trung tâm-– ĐH Khoa học Tự nhiên Tp HCM Phân tích phổ nghiệm iii Nguyễn Huỳnh Hoa MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA……………………………………4 1.1.1 Khái niệm gốc tự 1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự thể 1.1.3 Vai trò gốc tự thể 1.1.4 Khái niệm chất kháng oxy hóa 12 1.1.5 Phân loại 12 1.1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa 16 1.2 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.), L ………………………………………………………………………………20 1.2.1 Mô tả thực vật phân bố sinh thái Nauclea orientalis (L.) L 20 1.2.2 Nghiên cứu dược học N orientalis 21 1.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học N orientalis 22 1.2.4 Nghiên cứu thành phần hóa học chi Nauclea 25 1.3 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU………………………………………………….30 1.3.1 Những vấn đề tồn 30 1.3.2 Định hướng nghiên cứu 31 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 32 2.1 TRÍCH LY VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT………………… 32 2.1.1 Hóa chất 32 2.1.2 Thiết bị 32 2.1.3 Trích ly phân lập hợp chất từ thân N.orientalis 33 2.2 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 35 2.2.1 Thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 35 2.2.2 Khảo sát hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipid 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 iv 3.1 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY NUCLEA ORIENTALIS (L.) L 39 3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY NUCLEA ORIENTALIS (L.) L 40 3.2.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất benzopyranoid 40 3.2.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất monoterpenoid 47 3.3 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA…………… ………………… 59 3.3.1 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 59 3.3.2 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipid 60 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 CÔNG TRÌNH KHOA HỌC PHỤ LUC THUYẾT MINH ĐỀ TÀI v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Một số chất kháng oxy hóa tổng hợp 13 Hình 1.2 Công thức cấu tạo acid L-ascorbic acid dehydro ascorbic 15 Hình 1.3 Công thức cấu tạo vitamin E 15 Hình 1.4 Công thức cấu tạo β-carotene 15 Hình 1.5 Công thức cấu tạo taurine hypotaurine [84] 16 Hình 1.6 Công thức cấu tạo acid α-lipoic 16 Hình 1.7 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 18 Hình 1.8 Phản ứng tạo phức malonyldialdehyde acid thiobarbituric 19 Hình 1.9 Ảnh minh họa cây, hoa N orientalis 21 Hình 1.10 Cấu trúc số hợp chất alkaloid phân lập từ N orientalis 24 Hình 1.11 Cấu trúc số hợp chất steroid chất béo phân lập từ N orientalis 24 Hình 1.12 Cấu trúc số hợp chất terpenoid phân lập từ N orientalis 25 Hình 1.13 Cấu trúc số hợp chất phenol phân lập từ N orientalis 25 Hình 1.14 Cấu trúc số hợp chất alkaloid phân lập từ chi Nauclea 28 Hình 1.15 Cấu trúc số hợp chất steroid, terpenoid phân lập từ chi Nauclea 29 Hình 1.16 Cấu trúc số hợp chất polyphenol phân lập từ chi Nauclea 29 Hình 3.1 Tương quan HMBC (mũi tên) hợp chất GV-8 41 Hình 3.2 Tương quan HMBC (mũi tên) hợp chất GV-9 42 Hình 3.3 Tương quan HMBC (mũi tên) COSY (kẻ đậm) hợp chất GV-10 44 Hình 3.4 Tương quan HMBC (mũi tên) hợp chất GV-12 47 Hình 3.5 Tương quan HMBC (mũi tên) COSY (kẻ đậm) hợp chất GV-17 48 Hình 3.6 Tương quan HMBC (mũi tên) COSY (kẻ đậm) hợp chất GV-18 50 Hình 3.7 Tương quan HMBC (mũi tên) COSY (kẻ đậm) hợp chất GV-19 52 Hình 3.8 Tương quan HMBC (mũi tên) COSY (kẻ đậm) hợp chất GV-20 54 Hình 3.9a Cấu trúc tương quan HMBC (mũi tên) COSY (kẻ đậm) phần aglycone hợp chất GV-21 57 Hình 3.9b Cấu trúc tương quan HMBC (mũi tên) COSY (kẻ đậm) phần đường hợp chất GV-21 58 Hình 3.9c Tương quan HMBC (mũi tên) COSY (kẻ đậm) hợp chất GV-21 58 Hình 3.38c Tương quan HMBC (mũi tên) COSY (kẻ đậm) hợp chất GV-21 58 Hình 3.9d Tương quan NOESY (mũi tên) hợp chất GV-21 59 Hình 4.1 Cấu trúc 10 hợp chất phân lập từ thân N orientalis 62 vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các dạng hoạt động nitroge…………………………………………….4 Bảng 1.2 Các dạng hoạt động oxygen Bảng 1.3 Các hợp chất phân lập từ N orientalis 23 Bảng 1.4 Các hợp chất phân lập từ chi Nauclea 25 Bảng 2.1 Khối lượng thu suất loại cao từ thân N.orientalis 33 Bảng 2.2 Kết sắc ký cột cao ethyl acetate thân N orientalis 35 Bảng 3.1 Kết thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH cao phân đoạn từ thân N orientalis 39 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH phân đoạn từ cao ethyl acetate thân N orientalis 39 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR hợp chất GV-8 so sánh với umbelliferone 41 Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR hợp chất GV-9 so sánh với skimmin 43 Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR hợp chất GV-10 so sánh với adicardin 45 Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR hợp chất GV-11 so sánh với esculetin 46 Bảng 3.7 Số liệu phổ NMR hợp chất GV-12 so sánh với scopoletin 47 Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR hợp chất GV-17 so sánh với loganetin 49 Bảng 3.9 Số liệu phổ hợp chất GV-18 so sánh với loganin 50 Bảng 3.10 Số liệu phổ hợp chất GV-19 so sánh với sweroside 52 Bảng 3.11 Số liệu phổ hợp chất GV-20 so sánh với grandifloroside 54 Bảng 3.12 Số liệu phổ hợp chất GV-21 57 Bảng 3.13 Hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 10 hợp chất phân lập thân N orientalis 59 Bảng 3.14 Hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipid hai hoạt chất lựa chọn 60 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 Các phận thể bệnh lý liên quan tới gốc tự Sơ đồ 1.2 Phân loại chất kháng oxy hóa tự nhiên 13 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ điều chế loại cao từ thân N.orientalis 34 Sơ đồ 2.2 Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 36 Sơ đồ 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipid 38 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AO (AH) : Antioxidant (chất kháng oxy hóa) Asc : Ascorbic acid (vitamin C) BHA : Butylated hydroxyanisole br : Broad (rộng) BHT : Butylated hydroxytoluene CHCl3 : Chloroform CTPT : Công thức phân tử d : Doublet (mũi đôi) DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide DNA : Acid deoxyribonucleic DPPH : 2,2-diphenylpicrylhydrazyl EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ET : Electron transfer methods GSH : Glutathione HAT : Hydrogen atom transfer methods HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation HR-ESI-MS : High resolution electro spray ionization mass spectroscopy HSQC : Heteronuclear single quantum coherence IC50 : Nồng độ mẫu mà ức chế 50 % gốc tự J : Hằng số ghép m : Multiplet (mũi đa) MDA : Malonyldialdehyde NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NMR : Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) NOS : Nitrogen oxygen species NP : Nomal phase (pha thường) PBS : Phosphate buffered saline PG : Propyl gallate Pr : Protein PTLC : Preparative thin layer chromatography (sắc ký mỏng điều chế) quin : quintet (mũi năm) viii RNS : Reactive nitrogen species ROS : Reactive oxygen species s : Singlet (mũi đơn) SEM : Standard error of the mean (sai số chuẩn giá trị trung bình) SKC : Sắc ký cột TBA : Acid thiobarbituric TBHQ : tert-Butylhydroquinone TCA : Acid Trichloroacetic TLC : Thin layer chromatography (sắc ký mỏng) Trolox : Acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic UV : Ultraviolet (tử ngoại) XO : Xanthine oxidase YHCT : Y học cổ truyền ix TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập - Tự - Hạnh phúc ĐƠN VỊ: KHOA CNHH VÀ TP Tp HCM, Ngày 28 tháng 10 năm 2015 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa thân Gáo Vàng, Nauclea orientalis (L.)L (Rubiaceae) - Mã số: T2015-66TĐ - Chủ nhiệm: Phan Thị Anh Đào - Cơ quan chủ trì: ĐH Sư phạm Kỹ thuật Tp HCM - Thời gian thực hiện: 6/2014-12/2015 Mục tiêu:  Cô lập hợp chất từ thân Gáo vàng, Nauclea orientalis (L.)L (Rubiaceae)  Xác định cấu trúc hóa học hợp chất cô lập  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa phương pháp ức chế gốc tự DPPH, ức chế trình peroxyde hóa lipid Tính sáng tạo:  Đây nghiên cứu có tính định hướng hoạt tính kháng oxy hóa phân lập hoạt chất kháng oxy hóa- Một xu hướng nghiên cứu Hóa dược  Đây nghiên cứu thành phần hoạt tính kháng oxy hóa Nauclea orientalis (L.)L (Rubiaceae) Việt nam  Đề tài công bố 10 hợp chất lần cô lập từ thân chi Nauclea Kết nghiên cứu: Từ thân Nauclea orientalis (L.)L (Gáo vàng), phân lập 10 hợp chất bao gồm: Umbelliferone (GV-8), skimmin (GV-9), adicardin (GV-10), esculetin (GV-11), scopoletin (GV-12), Loganetin (GV-17), Loganin (GV-18), Sweroside (GV-19), Grandifloroside (GV-20), Naucleaorinoside A (GV-21) Đây 10 hợp chất lần cô lập từ thân chi Nauclea x  10 hợp chất phân lập từ nghiên cứu thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 02 hợp chất thể hoạt tính ức chế gốc tự mạnh GV-11 GV20 với IC50 < 15 µM  02 hoạt chất lựa chọn để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa mô hình ức chế trình peroxide hóa lipid Theo kết IC50 nhận thấy, 02 hợp chất có hoạt tính mạnh chất đối chứng dương Trolox (IC50, 2265,5 µM) Sản phẩm:  01 báo đăng Natural Product Communications Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết nghiên cứu khả áp dụng: Đề tài góp phần cung cấp thông tin khoa học thành phần hoạt tính kháng oxy hóa thân Gáo Vàng, Nauclea orientalis (L.)L (Rubiaceae) Do vậy, tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên ngành Hóa, Sinh Dược học Bên cạnh đấy, kết nghiên cứu đề tài giúp đẩy mạnh ứng dụng thuốc Gáo vàng y học cổ truyền Việt Nam Ngày 28 tháng 10 năm 2015 Trưởng Đơn vị Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên) xi INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information: - Project title: Study on antioxidant activity of the stem of Nauclea orientalis (L.) L (Rubiaceae) - Code number: T2015- 66TĐ - Coordinator: Phan Thi Anh Dao - Implementing institution: HCM City University of Technology and Education - Duration: from 6/2014 to 12/2015 Objective(s): - Isolating compounds from the stem of Nauclea orientalis (L.) L (Rubiaceae) - Indentification the isolated compounds - Study on DPPH free radical scavenging and lipid peroxidation inhibitory activities of isolated compounds Creativeness and innovativeness:  Study on antioxidant activity is a new trending research in chemical pharmacy  Until now, this is the first scientific report on chemical constituents and biological activities of this plant in Vietnam  Project was reported ten compounds which is the first time from this plant and Tetrastigma genius Research results:  Ten compounds were isolated from the stem of N.orentalis including : Umbelliferone (GV-8), skimmin (GV-9), adicardin (GV-10), esculetin (GV-11), scopoletin (GV-12), Loganetin (GV-17), Loganin (GV-18), Sweroside (GV-19), Grandifloroside (GV-20), Naucleaorinoside A (GV-21) These compounds were isolated for the first time from this plant and Nauclea genius  All isolated compounds from the stem of T.erubescens were assayed and compared were assayed and compared for their DPPH inhibitory activity to the positive control, trolox The results indicated that 02 compounds GV-11 and GV-20 showed significant free radical scavenging capacities with IC50 values below 15 µM  Based on the results obtained from the DPPH assay, three compounds which exhibited strong DPPH inhibitory were tested for lipid peroxidation inhibition by xii the thiobarbituric acid assay (TBA assay) All the studied compounds showed antioxidant activity much more active than trolox (IC50, 2265,5 µM) Products: one paper public on Natural Product Communications Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability: This project which has supplied results about chemical constituents and biological activities of stem of Nauclea orientalis (L.) L (Rubiaceae) helpful for student in chemistry, biology and pharmacy In addition, this investigation of antioxidant phenolic compounds suggested that the potency of these compounds could provide a chemical basis for some of the health benefits claimed for N.orientalis in foods and folk medicine xiii MỞ ĐẦU * Tính cấp thiết: Trong năm gần đây, nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến vấn đề gốc tự do, chất kháng oxy hóa hoạt tính kháng oxy hóa Trong thể người, lượng gốc tự lớn, vượt qua mức kiểm soát hệ thống miễn dịch, gốc tự công vào đại phân tử DNA, protein, lipid gây rối loạn trình sinh hóa thể Gốc tự biết thủ phạm có liên quan tới nhiều bệnh mà phải kể tới bệnh nguy hiểm ung thư, viêm khớp, huyết áp, tim mạch, Alzheimer, Parkinson …Chất kháng oxy hóa đưa vào thể người thông qua thực phẩm, dược phẩm có khả ngăn ngừa, ức chế loại bỏ tác dụng độc hại gốc tự cách trực tiếp gián tiếp Nhu cầu thị yếu người ngày cao, đòi hỏi tìm tòi, nghiên cứu nhà khoa học sâu rộng, hiệu kịp thời Ngày này, xu hướng nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm thay cho chất kháng oxy hóa tổng hợp sử dụng nhiều thực phẩm, y học sống ngày Vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, An Giang có hệ thực vật phong phú đa dạng, sử dụng nhiều y hoc cổ truyền (YHCT) Có nhiều thuốc sử dụng dân gian để điều trị nhiều bệnh lý liên quan tới gốc tự ung thư, tim mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp…Tuy nhiên, nay, chưa có nghiên cứu qui mô hệ thống thuốc Việt Nam có hoạt tính kháng oxy hóa Từ kết sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa 90 thuốc An Giang (3/2012), nhóm tìm cao MeOH trích ly từ thân Gáo vàng có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh với giá trị IC50= 6,0 µg/ml (phương pháp thử ức chế gốc tự DPPH) IC50= 95,1 µg/ml (phương pháp ức chế trình peroxide hóa lipid) Ở Việt Nam giới, chưa có công trình khoa học nghiên cứu thành phần hoạt tính Gáo vàng nói chúng thân Gáo vàng nói riêng Do vậy, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng oxy hóa thân Gáo vàng cần thiết hứa hẹn kết khả quan * Tổng quan tình hình nghiên cứu nước Tình hình nước: hoạt tính kháng oxy hóa hoạt tính sinh học nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhiều vào khoảng 20 năm trở lại Trên giới có số công trình nghiên cứu mang tính qui mô đối tượng lớn thuốc Xu hướng nghiên cứu phân lập hoạt chất từ mẫu dược liệu phát triển mạnh Cây N.orientalis (Gáo vàng) nghiên cứu thành phần hoạt tính kháng oxy hóa theo định hướng phân lập alkaloid từ cao ethyl acetate-amoniac cao chloroform trích ly từ phận Bằng phương pháp sắc ký, phổ nghiệm, nhà khoa học giới phân lập, xác định cấu trúc định danh 40 hợp chất có giá trị từ cao amoniac cao chloroform phận khác (rễ, thân, vỏ, lá) từ N orientalis Các hợp chất chủ yếu alkaloid, có thêm số chất béo, nhóm hợp chất terpenoid polyphenol Tuy nhiên, định hướng nghiên cứu hoạt chất kháng oxy hóa chưa tiến hành Tình hình nước: nước ta nước nhiệt đới có thảm thực vật phong phú giới với khoảng 12.000 loài, chưa kể tới rong, rêu, nấm Bên cạnh đó, YHCT Việt Nam phát triển với bề dày kinh nghiệm lưu truyền qua hệ Có nhiều thuốc sử dụng dân gian để điều trị nhiều bệnh lý phải kể tới bệnh liên quan tới gốc tự ưng thư, tim mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp Tuy nhiên, chứng khoa học thuốc chưa có hạn chế Ở Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu mang tính qui mô, sâu rộng theo định hướng hoạt tính kháng oxy hóa - Cây N.orientalis ứng dụng dân gian để chữa trị bệnh xơ gan cổ trướng Tuy nhiên, nghiên cứu hóa học hoạt tính loài chưa triển khai Việt Nam * Mục tiêu:  Cô lập hợp chất từ thân Gáo vàng, Nauclea orientalis (L.), L., Họ Cà phê (Rubiaceae)  Xác định cấu trúc hóa học hợp chất cô lập  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa phương pháp ức chế gốc tự DPPH, ức chế trình peroxyde hóa lipid * Cách tiếp cận  Tham khảo tài liệu  Thực nghiệm * Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: Điều chế mẫu cao phương pháp trích nóng dung môi MeOH cô lập hợp chất phương pháp sắc ký cột, sắc ký mỏng điều chế  Phương pháp nghiên cứu phân tích tổng hợp: Phân tích tổng hợp liệu phổ nghiệm phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13 C, DEPT, COSY, HMBC, HMQC khối phổ để xác định cấu trúc hóa học hợp chất polyphenol cô lập * Đối tượng phạm vi nghiên cứu  Đối tượng nghiên cứu: thân Gáo vàng  Phạm vi nghiên cứu : - Cô lập 10 hợp chất tinh khiết * Nội dung nghiên cứu  Cô lập hợp chất tinh khiết từ thân Gáo vàng phương pháp trích ly, sắc ký cột, sắc ký mỏng, sắc ký mỏng điều chế  Xác định cấu trúc hóa học hợp chất cô lập phương pháp phổ nghiệm đại cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều, khối phổ,  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa phương pháp ức chế gốc tự DPPH hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipid CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA 1.1.1 Khái niệm gốc tự Gốc tự (free radical) định nghĩa phân tử, nguyên tử, nhóm nguyên tử có chứa hay nhiều electron tự (electron độc thân) lớp cùng.[1-3] Gốc tự gồm hai dạng hoạt động là: dạng hoạt động nitrogen (RNSreactive nitrogen species) (bảng 1.1) dạng hoạt động oxygen (ROS-reactive oxygen species) (bảng 1.2) Bảng 1.1 Các dạng hoạt động nitrogen [1] Các dạng hoạt động Ký hiệu Thời gian tồn Hoạt động Nitric oxide NO● 1s Nitrogen dioxide Acid peroxynitrous Peroxynitrite NO2● 1s Vai trò quan trọng hệ thống thần kinh trung ương ngoại biên Hình thành trình ô nhiễm không khí ONOOH Khá ổn định Được hình thành ONOO─ nhận thêm proton ONOO─ 10-3 s Hoạt tính cao, hình thành từ NO● O2●─ Bảng 1.2 Các dạng hoạt động oxygen [1] Các dạng hoạt động Ký hiệu Thời gian tồn Superoxide O2●─ 10-6s Gốc hydroxyl HO● 10-9s Alkoxyl Gốc peroxyl Hydroperoxide hữu Hydrogen peroxide RO● ROO● 1s 1s ROOH Ổn định H2O2 Bền Oxygen đơn bội 10-6s Ozon O3 O2 1s Hoạt động Tạo ty thể (mitochondria), hệ thống tim mạch phận khác Hoạt tính cao, tạo tình trạng thể dư chất sắt (phản ứng Fenton) Hoạt tính cao, hình thành đại phân tử bị gốc tự công Phản ứng với ion kim loại chuyển tiếp để tạo dạng hoạt động Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng nhận electron để chuyển hóa thành gốc tự HO● Hoạt tính cao, hình thành trình quang học (photosensitization) phản ứng hóa học Là chất gây ô nhiễm khí quyển, phản ứng với phân tử khác để tạo 1O2 Các gốc tự thường bền có lượng cao, dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng polymer hóa… Gốc tự có hoạt tính cao nên thời gian tồn chúng thường ngắn, phụ thuộc nhiều yếu tố: cấu hình không gian, đặc tính cộng hưởng, hiệu ứng liên hợp.[4] Hai gốc tự quan trọng chứa nitrogen NO• ONOO-, NO• gốc tự quan tâm nhiều có vai trò quan trọng hệ thống thần kinh trung ương, ngoại biên tác nhân điều hòa huyết áp Nếu dạng hoạt động nitrogen có ý nghĩa lâm sàng dạng hoạt động oxygen lại tác nhân nguy hiểm gây nhiều bệnh lý.[1,5] Các dạng oxygen hoạt động có lượng cao, bền dễ dàng phản ứng với đại phân tử sinh học protein, lipid, DNA… gây rối loạn trình sinh hóa thể Đồng thời phân tử sống bị gốc tự công, điện tử trở thành gốc tự mới, tiếp tục phản ứng với phân tử khác tạo thành chuỗi phản ứng thường gọi phản ứng dây chuyền thể, gây biến đổi có tác hại thể.[1,5] 1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự thể 1.1.2.1 Nguồn nội sinh Gốc tự thể tạo trình sinh lý (quá trình hô hấp tế bào), trình bệnh lý (quá trình viêm nhiễm), hệ thống enzyme thân oxy hóa (prooxidant enzyme) có mặt ion kim loại chuyển tiếp thể a) Quá trình hô hấp tế bào [6-8] Quá trình hô hấp tế bào chuỗi phản ứng oxy hóa-khử gốc tự sản phẩm trung gian sinh trình Ví dụ: trình khử oxygen tạo nước trình hô hấp tạo gốc tự - O2● , HO● thông qua phản ứng sau: + O2 + H + 4e  2H2O O2 + e  O2 H2O2  ●- ●O2 + (1.1) (1.2) + + 2H + e (1.3) ● (1.4) HO + H + e  H2O (1.5) H2O2 + H + e  HO + H2O ● + Bên cạnh đó, phản ứng phụ gốc tự trình hô hấp hình thành gốc tự mới, độc hại Một phản ứng phụ đáng ý phản ứng - Haber-Weiss (phản ứng 1.6), xảy gốc O2● H2O2 tạo nên gốc HO● oxygen đơn bội: ●- O2 + H2O2  ● - O2 + HO + HO (1.6) Phản ứng 1.6 xảy nhanh xúc tác ion kim loại chuyển tiếp sắt, đồng, coban,… Oxygen đơn bội gốc hydroxyl hình thành gốc tự có khả phản ứng mạnh độc hại Chúng nguyên nhân gây trình peroxide hóa màng lipid b) Hội chứng viêm nhiễm [6,9] Hội chứng viêm nhiễm phản ứng tự vệ thể sống nhằm chống lại công vi khuẩn sinh vật lạ từ bên xâm nhập vào thể sinh thể Khi vi khuẩn sinh vật lạ xâm nhập vào thể bị bạch cầu đa nhân trung tính (neutrophil) bao kín để làm nhiệm vụ thực bào Lúc này, enzyme NADPH oxidase màng bạch cầu hoạt hóa, xúc tác phản ứng O2 NADPH tạo nên gốc tự O2●- (phản ứng 1.7), từ tạo nhiều gốc tự khác nhằm phân hủy sinh vật lạ Một phần gốc tự bị thoát bạch cầu, gây nên phản ứng viêm 2O2 + NADPH NADPH oxidase ●- 2O2 + NADP + H + (1.7) c) Các enzyme thân oxy hóa [5,6,10] Một hệ thống enzyme thân oxy hóa thể có khả tạo gốc tự xanthine oxidase (XO), nitric oxide synthase, myeloperoxidase … Gốc O2●- NO● hai gốc tự sinh xúc tác enzyme thân oxy hóa - Xanthine oxidase enzyme quan trọng trình thoái hóa hợp chất purine XO dùng O2 chất chuyển electron trình phản ứng kết dẫn đến hình thành gốc O2●- Điều minh họa phản ứng 1.8 sau: O HN O O H N + N H H2 O + 2O2 XO HN N O N H H N 2O2 O + + 2H+ (1.8) N H Sự tạo thành gốc O2●- XO đóng vai trò quan trọng việc gây tổn thương tượng thiếu máu cục (ischaemia injury) - Nitric oxide synthase enzyme xúc tác oxy hóa L-arginine thành citrulline tạo gốc NO● Enzyme dùng NADPH làm chất chuyển electron trình phản ứng Nếu phản ứng có tồn gốc O2●- gốc O2●- dễ dàng phản ứng với gốc NO● tạo ONOO- (một hợp chất có hại DNA) - Enzyme myeloperoxidase tạo hoạt hóa bạch cầu đa nhân trung tính, sử dụng H2O2 để oxy hóa ion Cl- tạo HOCl, hợp chất gốc tự có khả oxy hóa mạnh, gây nguy hại cho mô trình viêm nhiễm d) Các ion kim loại chuyển tiếp [6,9] Phản ứng ion kim loại chuyển tiếp hợp chất peroxide góp phần sản sinh gốc tự thể Phản ứng phân hủy H2O2 thành gốc HO● xúc tác ion sắt ví dụ điển hình (phản ứng 1.9 1.10) Fe 2+ Fe 3+ - ● 3+ + H2O2  HO + HO + Fe + H2O2  H + ● 2+ + HOO + Fe (1.9) (1.10) Hai phản ứng gọi phản ứng Fenton Ngoài sắt, ion kim loại chuyển tiếp khác đồng, cobalt tham gia trình 1.1.2.2 Nguồn ngoại sinh Ngoài yếu tố nội sinh, gốc tự hình thành thể yếu tố ngoại sinh ô nhiễm môi trường, xạ, khói thuốc, ozon … a) Sự xạ [6] Thành phần chủ yếu thể nước, xạ có lượng cao (tia X, tia UV…) chiếu vào thể phân hủy phân tử nước thành gốc tự do, có khả phản ứng mạnh (phản ứng 1.11 1.12): ● + ● ● H2O  HO + H + e H2O  HO + H -aq (1.11) (1.12) Nếu nước có oxygen xảy phản ứng sau (phản ứng 1.13 1.14): O2 + e ● -aq ●-  O2 (1.13) ● H + O2  HOO (gốc hydroperoxide) (1.14) Như vậy, tác dụng xạ, gốc tự HO●, O2●-, HOO● hình thành thể Điều giải thích lão hóa da người tăng lên vùng bị phơi bày ánh sáng Đó xạ mặt trời, tia cực tím làm sản sinh gốc tự có khả tham gia trình peroxide hóa lipid tế bào da Bức xạ khơi mào phản ứng gốc tế bào, chẳng hạn tự oxy hóa lipid Đồng thời, phân tử DNA mục tiêu bị nguy hại xạ gốc tự sản sinh từ phân giải nước công base DNA b) Khói thuốc [11] Khói thuốc chứa lượng lớn hợp chất aldehyde, epoxide, peroxide gốc tự nitric oxide, gốc peroxyl, gốc với trung tâm carbon diện pha khí Theo ước tính, thuốc có khoảng 1015 gốc tự Chúng có khả tồn thời gian dài chúng công túi phổi Bên cạnh đó, khói thuốc chứa gốc tự bền nhựa thuốc Sự vi xuất huyết nguyên nhân chủ yếu kết tủa sắt tìm thấy mô phổi người hút thuốc Sắt thể dễ dàng xúc tác cho phản ứng Fenton, sinh gốc HO● độc hại c) Ozon [12] Ozon tác nhân độc hại tạo gốc tự ảnh hưởng thể sống biểu chủ yếu qua tổn thương phổi máu Ozon phản ứng trực tiếp với hợp chất bất bão hòa acid béo lipid tự phân hủy sinh O2, từ gia tăng khả hình thành gốc tự thể 1.1.3 Vai trò gốc tự thể Theo ước tính, trung bình ngày có khoảng 10 000-20 000 gốc tự hoạt động thể người.[3] Xét phương diện có lợi, gốc tự cần thiết hoạt động thể sống Trong trình trao đổi chất, gốc tự đóng vai trò trung gian di chuyển điện tử từ phân tử sang phân tử khác nhằm tạo lượng Gốc tự góp phần với bạch cầu tiêu diệt vi sinh vật có hại, tăng cường khả bảo vệ cho hệ thống miễn dịch thể Gốc tự giúp tiêu diệt vi sinh vật lạ, gốc tự góp phần quét dọn tế bào già, chết thể tạo điều kiện cho tế bào sinh sôi, phát triển tiêu diệt tế bào bất thường tế bào ung thư Ngoài ra, gốc tự tham gia vào nhiều trình có lợi khác cho thể đóng vai trò chất dẫn truyền thần kinh (NO•) tác nhân điều hòa huyết áp S K L 0 [...]... nào nghiên cứu về thành phần và hoạt tính của cây Gáo vàng nói chúng và thân cây Gáo vàng nói riêng Do vậy, nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây Gáo vàng là hết sức cần thiết và hứa hẹn những kết quả khả quan * Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước Tình hình ngoài nước: hoạt tính kháng oxy hóa là một hoạt tính sinh học được các nhà khoa học tập trung nghiên. .. kỳ một nghiên cứu qui mô và hệ thống nào về các cây thuốc Việt Nam có hoạt tính kháng oxy hóa Từ kết quả sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của 90 cây thuốc An Giang (3/2012), nhóm chúng tôi đã tìm ra cao MeOH trích ly từ thân cây Gáo vàng có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh với giá trị IC50= 6,0 µg/ml (phương pháp thử ức chế gốc tự do DPPH) và IC50= 95,1 µg/ml (phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid)... những cây thuốc này chưa có hoặc còn rất hạn chế Ở Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu mang tính qui mô, sâu rộng theo định hướng hoạt tính kháng oxy hóa - Cây N .orientalis đã được ứng dụng trong dân gian để chữa trị các bệnh xơ gan cổ trướng Tuy nhiên, nghiên cứu hóa học và hoạt tính của loài cây này thì chưa được triển khai ở Việt Nam * Mục tiêu:  Cô lập các hợp chất từ thân cây Gáo vàng, Nauclea. .. phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng: Đề tài góp phần cung cấp thông tin khoa học về thành phần và hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây Gáo Vàng, Nauclea orientalis (L.)L (Rubiaceae) Do vậy, đây là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên ngành Hóa, Sinh và Dược học Bên cạnh đấy, kết quả nghiên cứu của đề tài giúp đẩy mạnh ứng dụng của cây thuốc Gáo vàng trong y học cổ truyền... học được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhiều vào khoảng 20 năm trở lại đây Trên thế giới 1 có một số ít các công trình nghiên cứu mang tính qui mô trên đối tượng lớn các cây thuốc Xu hướng nghiên cứu phân lập các hoạt chất từ các mẫu dược liệu hiện đang phát triển mạnh Cây N .orientalis (Gáo vàng) đã được nghiên cứu về thành phần và hoạt tính kháng oxy hóa theo định hướng phân lập alkaloid từ... 10 hợp chất được phân lập từ cây nghiên cứu đều được thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 02 hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế gốc tự do mạnh là GV-11 và GV20 với IC50 < 15 µM  02 hoạt chất này được lựa chọn để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình ức chế quá trình peroxide hóa lipid Theo kết quả IC50 nhận thấy, 02 hợp chất này đều có hoạt tính mạnh hơn chất đối chứng dương Trolox... lập các hợp chất từ thân cây Gáo vàng, Nauclea orientalis (L.), L., Họ Cà phê (Rubiaceae)  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH, ức chế quá trình peroxyde hóa lipid * Cách tiếp cận  Tham khảo tài liệu  Thực nghiệm 2 * Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: Điều chế các mẫu cao bằng phương... chế  Phương pháp nghiên cứu phân tích tổng hợp: Phân tích và tổng hợp các dữ liệu phổ nghiệm như phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13 C, DEPT, COSY, HMBC, HMQC và khối phổ để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất polyphenol cô lập được * Đối tượng và phạm vi nghiên cứu  Đối tượng nghiên cứu: thân cây Gáo vàng  Phạm vi nghiên cứu : - Cô lập 10 hợp chất tinh khiết * Nội dung nghiên cứu  Cô lập các hợp... tinh khiết từ thân cây Gáo vàng bằng các phương pháp trích ly, sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký bản mỏng điều chế  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, khối phổ,  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH và hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 3... + NADP + H + (1.7) c) Các enzyme thân oxy hóa [5,6,10] Một hệ thống các enzyme thân oxy hóa trong cơ thể có khả năng tạo gốc tự do như xanthine oxidase (XO), nitric oxide synthase, myeloperoxidase … Gốc O2●- và NO● là hai gốc tự do chính được sinh ra dưới sự xúc tác của các enzyme thân oxy hóa này - Xanthine oxidase là một enzyme quan trọng trong quá trình thoái hóa của các hợp chất purine XO dùng O2