Chương 2: SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 2.1 Khái niệm 2.1.1 Lịch sử phát triển • • Phươ ng pháp đờ i từ năm 1967-1968 sở phát triển cải tiến từ ph ươ ng pháp sắc ký cột cổ điển Hiện phươ ng pháp HPLC ngày phát triển đạ i hoá cao nh s ự phát tri ển nhanh chóng ngành chế tạo máy phân tích • 2.1.2 Các Lực Liên Kết Trong Hệ Sắc Ký Chất Phân Tích Fa Pha Tĩnh (Silicagen) Fb Fc Pha Động (Hexan,metanol, ) • 2.1.2 Các Lực Liên Kết Trong Hệ Sắc Ký • Châu cho up video Principles of Chromatography.mp4 giải thích Đây phần ví dụ • • • • 2.1.3 Các lực liên kết sắc ký Lực phân tử Lực van-de-van( lực phân tán) Lực tương tác đặc biệt • • 2.1.4 Qúa trính sắc ký định nghĩa 2.1.4.1 Qúa trình sắc ký Châu phần châu cho mở video CHROMATOGRAPHY- Technique for separating mixtur… mp4 lên nha hảo up vào mà ko ok • • • 2.1.4 Qúa trính sắc ký định nghĩa 2.1.4.2 Định nghĩa HPLC kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp cột với đặc điểm sau: + Nhồi hạt có kích thước < 10µm (pha tĩnh) + Dùng bơm cao áp có áp suất gần 300 atm với tốc độ dòng vài ml/phút cho phép phân giải nhanh lượng mẫu nhỏ • 2.1.4.2 Định nghĩa b) Khác nhau: so sánh với sắc ký thường • Giống nhau: + Các lực liên kết hệ sắc ký + Qúa trình tách sắc ký Sắc ký thường Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC + Áp suất thường + Áp suất cao gần 300 atm + Chiều dài cột lớn( 50 500 cm) + Chiều dài cột nhỏ (525cm ) + Kích thước hạt nhồi cột + Kích thước hạt nhồi cột < 10 (150 200 + Hiệu suất tách không cao + Hiệu suất tách cao 2.1.5 Phân Loại Dựa vào khác chế tách chiết sử dụng HPLC, người ta chia HPLC thành loại: • • Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography) Sắc ký phân bố (partition chromatography) + SKPT (normal phase chromatography) + sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography) Sắc ký ion (ion chromatography) • • Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography) 2.2 Các kĩ thuật phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao: - Sắc kí lỏng hiệu cao bao gồm nhiều phương pháp ( kĩ thuật) như: sắc kí lỏng pha lien kết, sắc kí lỏng – rắn, sắc kí trao đổi ion, sắc kí cặp ion… -Trong có kĩ thuật chính, là: +Sắc kí lỏng pha liên kết +Sắc kí trao đổi ion 2.2.1 Sắc kí lỏng pha liên kết: 2.2.1.1 Pha tĩnh - Pha tĩnh gắn hóa học (liên kết) với chất mang (hạt silicagen) tạo nên hợp chất cơ- siloxan Silicagen có đặc tính đặc biệt : xốp, bề mặt gồ ghề, có hạt mao quản nên diện tích bề mặt lớn -Trên bề mặt Silicagen có nhóm silanol tham gia liên kết với chất phân tích nên dung để tách sắc kí 2.3.4 Lọc tiền cột ( cột bảo vệ) -Gắn đầu cột phân tích -Được nhồi chất hấp phụ giống cột kích thước lớn ⇒Hấp phụ, giữ lại tạp chất mẫu phân tích pha động 2.3.5 cột HPLC -Cột thủy tinh dùng áp suất thấp (< 50 at) cột thép không gỉ dùng phổ biến, chịu áp suất cao (đến 500 at) - Cột dài 10 – 30 cm, đường kính d = – 10 mm, hạt chất nhồi cỡ – 10 µm Với chất nhồi từ - µm dùng cột ngắn (3 – 10 cm) nhỏ (d = – mm) Loại cột có hiệu lực cao, số đĩa lý thuyết lên đến 100.000 đĩa cho m cột • - Chất nhồi thường silicagen, dùng nhôm ôxyt, polyme xốp, chất trao đổi ion 2.3.6 Detector -Trong HPLC có hai loại detector: + Loại theo dõi tính chất pha động : dựa vào tính hóa học vật lý pha động có liên quan đến chất phân tích + Loại theo dõi tính chất chất phân tích : dựa vào phản ứng đặc trưng chất phân tích - Hai detector thường dùng + Detector quang phổ hấp thụ phân tử; + Detector đo độ dẫn 2.4 Phân loại Dựa vào khác chế tách chiết sử dụng HPLC, người ta chia HPLC thành loại: -Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn -Sắc ký phân bố -Sắc ký -Sắc ký rây phân tử Sắc ký phân bố (SKPB) ứng dụng nhiều phân tích hợp chất từ không phân cực đến hợp chất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không lớn ([...]... ít phân cực; còn pha động là dung môi không phân cực như hexan, toluene thì ta có sắc kí pha thường - Khi silicagen gắn với nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl và pha động là dung môi phân cực như H2O, methanol, acetonitril thì có sắc kí pha đảo (hay sắc kí pha ngược) 2. 2.1.2Pha động: - Trong sắc kí pha thường , pha động là dung môi không phân cực như benzene, nhexan Còn trong... trong công nghiệp; -Các mẫu từ các bệnh viện; -Mẫu phân tích trong dược phẩm 2. 2 .2 Sắc kí trao đổi ion - Ionit được sử dụng là Ionit thiên nhiên ( có đặc điểm: dung lượng trao đổi thấp, độ lặp lại kém) và ionit tổng hợp( có đặc điểm: dung lượng trao đổi cao, độ bền lí học và hóa học tốt, độ lặp lại của phép tách sắc kí tốt) 2. 2 .2. 1 Tổng hợp ionit  Các nhựa trao đổi ion được chế tạo bởi sự đồng trùng... thời gian lưu thật của một cấu tử - Hệ số dung lượng k’: -Hiệu năng hay Với : W1 /2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút) W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút) - Độ phân giải: 2. 5 ứng dụng - Định tính ( dựa vào thời gian lưu) + Thời gian này được tính từ thời điểm mẫu được bơm đến thời điểm sắc ký đồ hiển thị độ cao, cao điểm tối đa cho hợp chất gọi là thời gian lưu,hay... của chất phân tích - Hai detector thường dùng là + Detector quang phổ hấp thụ phân tử; + Detector đo độ dẫn 2. 4 Phân loại Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: -Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn -Sắc ký phân bố -Sắc ký -Sắc ký rây phân tử Sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến... nhau hoặc bazo yếu có Kb khác nhau, vì vậy hấp dung của ionit thay đổi lien tục • 2. 3 Sơ đồ thiết bị sắc kí lỏng hiệu nâng cao: 3 phần chính: Đầu vào – Tách – Phát hiện và xử lý số liệu Vòng bơm mẫu Bơm cao áp Van điều chỉnh tỷ lệ dung môi Van điều tiết xung Cột bảo vệ Cột SK Bể chứa pha động Detector • 2. 3.1 Pha động: -Cột được làm bằng thủy tinh trung tính, có nắp đậy thích hợp để tránh bay hơi dung... rửa giải (gradient) 2. 3 .2 Hệ thống bơm cao áp: Dung để hút pha động từ bình chứa dung môi và đẩy chúng qua cột sắc ký -Yêu cầu: + Tạo áp suất cao: khoảng 25 0-500 at + Lưu lượng bơm khoảng 0.1-10 ml/phút + Bơm không bị ăn mòn bởi nhiều loại dung môi Trong phân tích hay dùng bơm tốc độ hằng định -Bơm cơ: + Kiểu syringe đẩy dung môi liên tục, + Bơm kiểu piston thì đẩy hút luân phiên 2. 3.3 Hệ tiêm mẫu (... methanol… - Ngoài ra , người ta thường dung hỗn hợp 2 hay 3 dung môi để tạo pha động có độ phân cực phù hợp; - Đối với hỗn hợp phân tích thì pha động có thành phần là hỗn hợp các dung môi; * Các điều kiện thỏa mãn của pha động:  Trơ với pha tĩnh;  Hòa tan được mẫu phân tích;  Bền trong thời gian chạy sắc kí;  Có độ tinh khiết cao;  Phù hợp với detector 2. 2.1.3.Ứng dụng: -Phân tích các mẫu trong nông... động đẩy mẫu vào cột 2. 3.4 Lọc tiền cột ( cột bảo vệ) -Gắn đầu cột chính phân tích -Được nhồi chất hấp phụ giống cột chính nhưng kích thước lớn hơn ⇒Hấp phụ, giữ lại tạp chất trong mẫu phân tích hoặc pha động 2. 3.5 cột HPLC -Cột bằng thủy tinh dùng ở áp suất thấp (< 50 at) hoặc cột bằng thép không gỉ được dùng phổ biến, chịu được áp suất cao (đến 500 at) - Cột dài 10 – 30 cm, đường kính trong d = 4 –... Tùy vào bậc amin đưa vào phản ứng mà có anionit bazo mạnh – yếu khác nhau  Nhựa tạo phức 2. 2 .2. 2 Phân loại ionit Ionit loại 1: là ionit thể hiện tính chất như axit mạnh hoặc bazo mạnh    Đặc điểm: Có thể làm việc ở mọi giá trị pH Dung lượng hấp thu ít thay đổi theo pH Là ionit đơn chức ( -SO3H ) Ionit loại 2: : là ionit thể hiện tính chất như một axit yếu hoặc bazo yếu Đặc điểm:    Làm việc ở... chức, có 2 giá trị hấp dung  Với cacionit có cả -SO 3H, -COOH, -OH làm việc ở pH cao, khi pH thấp chỉ có -SO 3H làm việc  Với anionit, ở pH cao amin bậc 4 -N+(R)3OH làm việc ở pH thấp, tất cả các amin bậc 1, 2, 3, 4 đều làm việc Ionit loại 4: : là ionit thể hiện tính chất như một hỗn hợp nhiều axit yếu có Ka khác nhau hoặc bazo yếu có Kb khác nhau, vì vậy hấp dung của ionit thay đổi lien tục • 2. 3 Sơ