LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học, nhận nhiều giúp đỡ quý báu từ phía thầy cô, bạn bè Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS Phạm Thanh Huyền, phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam người tạo điều kiện, hướng dẫn từ bước cần có, bước tiếp cận nghiên cứu khoa học, tận tâm nhiệt tình, giúp hình thành nên kỹ cần thiết suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Phí Quyết Tiến, trưởng phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam người tạo điều kiện thuận lợi phương tiện, hướng dẫn quy tắc làm việc phòng thí nghiệm suốt thời gian làm luận văn Và xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học, bạn bè người thân động viên khích lệ suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Lê Thị Ngọc Trâm MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chủng nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.2 Sự phân bố nấm Đông trùng hạ thảo tự nhiên 1.1.3 Đặc điểm hình thái học số loài nấm thuộc chi Cordyceps 1.1.4 Quá trình xâm nhiễm nấm vào thể côn trùng 1.2 Một số chất có hoạt tính sinh học từ nấm Đông trùng hạ thảo 11 1.2.1 Cordycepin 12 1.2.2 Adenosine 13 1.2.3 Polysaccharide 14 1.2.4 Các hợp chất khác 15 1.3 Giá trị dược liệu hoạt chất sinh học tới sức khỏe người 19 1.4 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo nước 23 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo giới 23 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Việt Nam 24 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 27 2.1 Vật liệu 27 2.1.1 Chủng giống 27 2.1.2 Hóa chất 27 2.1.3 Dụng cụ thiết bị 27 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Phương pháo bảo quản giống 29 2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học 29 2.2.3 Phân loại chủng nấm theo trình tự gen DNA 30 2.2.4 Lựa chọn môi trường lên men 31 2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển chủng nấm 33 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Đặc điểm sinh học chủng nấm 34 3.2 Kết phân loại chủng nấm 37 3.3 Nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng nấm 37 3.4 Bước đầu nghiên cứu lên men chủng nấm C cicadae VTD4 42 3.4.1 Lựa chọn môi trường nhân giống thích hợp 42 3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển chủng nấm 43 3.4.3 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp 47 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 KẾT LUẬN 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 iii DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung C Cordyceps sp Species- loài D Đường kính khuẩn lạc Da Dalton Đơn vị trọng lượng phân tử DO Độ hòa tan oxy rpm Tốc độ lắc vòng/phút ĐTHT Đông trùng hạ thảo iv DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Mô tả hình thái số loài nấm thuộc chiCordyceps Bảng 1.2 Mô tả mặt cắt phần thể ấu trùng bị xâm nhiễm thể loài thuộc chiCordyceps Bảng 3.1 Đặc điểm sinh học chủng nấm ký sinh côn 35 trùng Bảng 3.2 Kết so sánh trình tự gen mã hóa 18S 28S 37 rRNA chủng nấm với gen tương ứng đăng ký GenBank Bảng 3.3 Mô tả hình thái khuẩn lạc chủng nấm C 38 militaris HTD3 số môi trường nuôi cấy Bảng 3.4 Mô tả hình thái khuẩn lạc chủng nấm C 40 cicadae VTD4 số môi trường nuôi cấy Bảng 3.5 Khả phát triển chủng nấm C cicadae VTD4 42 môi trường nhân giống khác Bảng 3.6 Khả sinh trưởng chủng nấm C 43 Khả sinh trưởng chủng nấm C cicadae 45 cicadaeVTD4 nhiệt độ khác Bảng 3.7 VTD4 giá trị pH khác Bảng 3.8 Khả sinh trưởng chủng nấm C cicadae 46 VTD4 với độ thông khí khác Bảng 3.9 Khối lượng sinh khối khô thu chủng nấm C 47 cicadae VTD4 nuôi lắc 150rmp nhiệt độ 25oC sau ngày Bảng 3.10 Kết xác định hàm lượng chất có dịch lên men sinh khối lên men chủng thể tươi chủng nấm C cicadae VTD4 48 v DANH MỤC HÌNH Hình Nội dung Trang Hình 1.1 Nấm Đông trùng hạ thảo tự nhiên Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng nấm 34 Hình 3.2 Ảnh hiển vi điện tử chủng C militaris HTD3 sau 35 10 ngày nuôi cấy Hình 3.3 Ảnh hiển vi điện tử chủng C cicadae VTD4 sau 35 10 ngày nuôi cấy Hình 3.4 Hình ảnh dạng thể chủng nấm HTD3 36 môi trường lên men xốp sâu sau 40 ngày nuôi cấy Hình 3.5 Hình ảnh dạng thể chủng nấm VTD4 36 môi trường lên men xốp sâu sau 40 ngày nuôi cấy Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc chủng nấm C militaris 39 HTD3 môi trường khác sau 15 ngày Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc chủng nấm C cicadae VTD4 39 môi trường khác sau 15 ngày Hình 3.8 Kích thước khuẩn lạc chủng nấm 41 môi trường sau 20 ngày Hình 3.9 Kích thước khuẩn lạc chủng nấm 41 môi trường sau 25 ngày Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả phát triển 44 sinh tổng hợp chất chủng VTD4 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ tới phát triển chủng 44 nấm VTD4 đĩa petri sau ngày Hình 3.12 Ảnh hưởng pH tới khả sinh trưởng phát 45 triển chủng C cicadae VTD4 Hình 3.13 Ảnh hưởng độ thông khí đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp chất chủng 46 vi Hình 3.14 Chủng C cicadae VTD4 sau 11 ngày lên men 48 môi trường MT1 Hình 3.15 Kết đo quang phổ xác định hàm lượng 49 cordycepin adenosine dịch lên men chủng nấm C cicadae VTD4 Hình 3.16 Kết đo quang phổ xác định hàm lượng cordycepin adenosine sinh khối chủng nấm C cicadae VTD4 49 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Đông trùng hạ thảo coi dược liệu quý có khả chữa nhiều loại bệnh sử dụng từ xa xưa Nấm Đông trùng hạ thảo loại nấm ký sinh sâu non, nhộng, số loại côn trùng Vào mùa đông, số loài côn trùng bị nấm ký sinh xâm nhiễm sử dụng chất dinh dưỡng thể làm thức ăn, khiến côn trùng chết Đến mùa hè, gặp điều kiện thuận lợi độ ẩm nhiệt độ, nấm chuyển sang giai đoạn hình thành thể nhú khỏi mặt đất gốc dính liền vào thân côn trùng Vì mùa đông nấm ký sinh côn trùng, mùa hạ mọc thành nên có tên Đông Trùng Hạ Thảo Nấm ký sinh côn trùng để sản xuất dược liệu xác định khoảng 400 loài khác Nhưng nay, nghiên cứu sản xuất đa phần tập trung vào nhóm Cordyceps sp nhóm có chứa nhiều loại acid amin, vitamin, D-manitol, exopolysaccharide, adenosine, ergosterol, cordycepin nguyên tố vi lượng… Các chất có tác dụng tăng cường sức khỏe, nâng cao hệ miễn dịch, chống ôxi hóa, điều trị bệnh tim mạch, kháng tế bào ung thư, kháng vi sinh vật.Theo tài liệu ghi chép đông dược cổ, Đông trùng hạ thảo sử dụng từ lâu vị thuốc bồi bổ quý giá cho sức khỏe người Trên giới, nấm Đông trùng hạ thảo, phần lớn thuộc chi Cordyceps nhà khoa học nghiên cứu chứng minh giá trị chúng chăm sóc bảo vệ sức khỏe người Bằng kỹ thuật công nghệ sinh học tiên tiến, phương tiện đại, nhiều nước thành công việc nuôi cấy nhân tạo chủng nấm đông trùng hạ thảo quy mô công nghiệp Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan Việt Nam nước có mật độ dân số cao nên việc cải thiện chất lượng dân số, chăm sóc sức khỏe cho nhân dân nhà nước đặc biệt quan tâm Ngoài thuốc chữa bệnh thiết yếu, thực phẩm dinh dưỡng số thực phẩm chức từ đông trùng hạ thảo chứng minh hiệu sử dụng Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học ph ng, chống bệnh sử dụng rộng rãi Nắm bắt tiềm năng, nước phát triển Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan… có nhiều năm nghiên cứu, xây dựng thành công quy trình, sản suất với quy mô công nghiệp tạo nhiều sản phẩm thị trường Tuy nhiên, giá thành sản phẩm cao Chính thế, việc nghiên cứu phát triển ứng dụng loài nấm dược liệu nấm đông trùng hạ thảo Việt Nam đẩy mạnh Hiện nay, phần lớn chủng giống cho sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo phụ thuộc vào nguồn nhập từ nước lân cận nên giá thành cao Do vậy, việc nghiên cứu tạo chủng nấm Đông trùng hạ thảo phân lập Việt Nam đảm bảo chất lượng quan tâm thúc đẩy nhằm đáp ứng nhu cầu cho xã hội Để góp phần vào nghiên cứu phát triển nâng cao thị trường sản xuất sản phẩm từ nấm dược liệu Đông trùng hạ thảo Việt Nam, thực đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm sinh học bƣớc đầu nghiên cứu điều kiện lên men chủng nấm thuộc chi Cordyceps phân lập Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu đề tài Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Cordyceps với mục đích phân loại tìm điều kiện nuôi cấy phù hợp cho sinh trưởng, phát triển chủng nấm phân lập từ Việt Nam Bên cạnh đó, nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp với định hướng tăng khả tạo chất có giá trị dược liệu cao cordycepin, adenosine… để ứng dụng sản xuất thực phẩm chức Đối tƣợng nội dung nghiên cứu đề tài Đối tượng nghiên cứu Các chủng nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps ký hiệu HTD3 VTD4 phân lập vườn Quốc Gia Tam Đảo sưu tập giống phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps sp HTD3 Cordyceps sp VTD4 - Phân loại chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps sp VTD4 theo trình tự gen - Lựa chọn môi trường thích hợp cho nuôi cấy bước đầu nghiên cứu điều kiện lên men chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps sp VTD4 Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu Trong nhiều nghiên cứu, môi trường nuôi cấy cho chủng nấm thường giá trị pH acid Giá trị pH đầu ảnh hưởng không nhỏ đến sinh trưởng sinh tổng hợp chủng giống Trong đó, pH môi trường đầu tác dụng đến sinh trưởng chủng giống vphát triển sinh hoạt chất quý cordycepin, adenosine… Kết nghiên cứu trình bày 3.7 Bảng 3.7 Khả sinh trƣởng chủng nấm C cicadae VTD4 giá trị pH khác Thời gian Sinh khối khô dịch lên men thau đổi giá trị pH ban đầu (g/l) 6,5 ngày 36 36 36 34 34 ngày 40 42 41 38 35 ngày 45 48 48 41 40 Hình 3.12 Ảnh hƣởng pH tới khả sinh trƣởng phát triển chủng C cicadae VTD4 Kết cho thấy pH 6- 6,5 chủng nấm sinh trưởng phát triển tốt so với giá trị pH khác Nghiên cứu phù hợp với nhiều nghiên cứu giới, chủng nấm ký sinh côn trùng C cicadae VTD4 phân Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 45 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học lập Việt Nam có khả sinh trưởng tốt môi trường có giá trị pH 6-6,5 Ảnh hưởng độ thông khí Trong lên men nuôi cấy chủng vi sinh vật nói chung cần phải lưu ý đến khả thông khí môi trường Cụ thể nghiên cứu tác động tốc độ lắc, thể tích dịch nuôi với thể tích bình nuôi quan trọng, ảnh hưởng đến khả phát triển chủng giống Bảng 3.8 Khả sinh trƣởng chủng với độ thông khí khác Thời gian Sinh khối khô thu đƣợc có thay đổi lƣợng dịch nuôi bình (g/l) 50 ml 100 ml 150 ml 200 ml 250 ml ngày 34 38 36 34 30 ngày 35 40 40 36 34 ngày 32 46 44 40 32 Hình 3.13 Ảnh hƣởng độ thông khí đến khả sinh sinh trƣởng sinh tổng hợp chất chủng Tốc độ thông khí giới hạn định ảnh hưởng đến phát triển chủng nấm, làm tăng khả phát triển thể rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao sinh khối Cung cấp khí tạo chất Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 46 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học chuyển hóa thứ cấp đồng nghĩa với thúc đẩy chuyển hóa chất, tạo sản phẩm hòa tan oxy Do đó, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng thông khí tới phát triển chủng nấm C cicadae VTD4 thông qua thay đổi thể tích dịch lên men chứa bình có dung tích 500ml (Bảng 3.8 Hình 3.13) Kết nhận với thể tích dịch lên men 100ml/500ml cho giá trị sinh khối khô cao 3.4.3 Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp Sau nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới điều kiện lên men nuôi cấy chủng C cicadae VTD4, tiến hành lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho môi trường sau: MT1, MT4, MT5 MT6 Việc lựa chọn môi trường kiểm khả sinh trưởng chủng môi trường thích hợp cho lên men mẻ lớn Bảng 3.9 Khối lƣợng sinh khối khô thu đƣợc chủng nấm nuôi lắc 150rmp nhiệt độ 25oC sau ngày Môi trƣờng Sinh khối (g/l) MT1 57 MT4 30 MT5 34 MT6 53 Trong lên men chìm nấm đông trùng hạ thảo thời gian dài 1015 ngày nên khả nhiễm lớn, môi trường PDA PDAN lên men khó phát nhiễm giai đoạn đầu, mặt khác, đo sinh khối nấm thiếu môi trường có nhiều chất lắng cặn Do vậy, lựa chọn môi trường cho nghiên cứu lên men chủng nấm C cicadae VTD4 Kết thể Bảng 3.3 Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 47 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Hình 3.14 Chủng C cicadae VTD4 sau 11 ngày lên men môi trƣờng MT1 Qua kết cho thấy, môi trường MT1 chủng có khả phát triển tốt nhất, có giá trị sinh khối đạt cao so với môi trường lại sau 11 ngày lên men Môi trường phù hợp để tiếp tục nghiên cứu lên men mẻ lớn thành phần môi trường gồm có: saccharose, pepton, chất có giá thành rẻ, tính ổn định cao thuận lợi cho thu hồi sản xuất số lượng lớn không gây tác động tiêu cực môi trường sản phẩm sau Sau 12 ngày lên men bình tam giác, chủng nấm C cicadae VTD4 phân tích hàm lượng chất cordycepin adenosine dịch lên men sinh khối khô, kết trình bày Bảng 3.10 , Hình 3.16 3.17 Bảng 3.10 Kết xác định hàm lƣợng chất có dịch lên men sinh khối lên men chủng thể tƣơi chủng nấm C cicadae VTD4 Hàm lƣợng (µg/ml µg/g) Phƣơng pháp thử Cordycepin Adenosine Dịch lên men (µg/ml) HPLC 340 310 Sinh khối tươi (µg/g) HPLC 1520 360 Mẫu thử Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 48 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Hình 3.15 Kết đo phổ xác định hàm lƣợng cordycepin adenosine dịch lên men chủng nấm C cicadae VTD4 Hình 3.16 Kết đo phổ xác định hàm lƣợng cordycepin adenosine sinh khối chủng nấm C cicadae VTD4 So sánh với nghiên cứu Shashidhar cộng năm 2015 cho thấy, kết nghiên cứu nhóm chủng C sinensis CS1197 có hàm lượng cordycepin sinh khối tươi 714 ± 31,74 673 ± 44,58 µg/g sinh khối nuôi thời gian 14 ngày, lượng sinh khối khô thu 2,13g/l (Shashidhar et al., 2015) Trong mẫu chủng nấm C cicadae Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 49 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học VTD4 đạt hàm lượng cordycepin adenosine 1520 360 µg/g tring sinh khối khô 12 ngày nuôi cấy Như vậy, thấy hàm lượng cordycepin adenosine có sinh khối tươi chủng C cicadae VTD4 sau 12 ngày lên men cao so với dịch lên men cao so sánh với chủng C sinensis CS1197 Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 50 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ chủng nấm HTD3 VTD4 thuộc chi Cordyceps phân lập từ Việt Nam nhận từ sưu tập giống phòng Công nghệ lên men, nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điểm hình thái học chủng Đã tiến hành nghiên cứu định tên đến loài chủng, cụ thể là: chủng HTD3 định tên thuộc loài Cordyceps militaris, chủng VTD4 định tên loài Cordyceps cicadae Đã nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng nấm là: chủng C militaris HTD3 có khả sinh trưởng tốt môi trường MT1 PDAN; chủng C cicadae VTD4 có khả sinh trưởng tốt môi trường PDAN Đã lựa chọn chủng C cicadae VTD4 cho định hướng lên men sản xuất chất có hoạt tính sinh học cao để sản xuất quy mô lớn Đã nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men sinh trưởng phát triển chủng C cicadae VTD4 lựa chọn điều kiện tốt cho lên men bao gồm: pH ban đầu 6-6,5; nhiệt độ 25oC; độ thông khí thích hợp 1/5 (v/v) Môi trường nhân giống thích hợp môi trường lên men phù hợp MT1 với thành phần sau (g/l): Saccharose 20; Pepton 5; KH2PO4 1; MgSO4 0,15 Bước đầu lên men chủng C cicadae VTD4 bình tam giác, sau 12 ngày thu hồi xác định hàm lượng chất cordycepin adenosine có mặt sinh khối dịch lên men là: 1520 360 µg/ml; 360 310 µg/g Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 51 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học KIẾN NGHỊ - Tiếp tục tiến hành nghiên cứu điều kiện tối ưu cho lên men chủng nấm C cicadae VTD4 quy mô lớn nhằm thu hồi hàm lượng cao chất có hoạt tính sinh học cordycepin, adenosine polysaccaride - Nghiên cứu tách chiết thu hồi chất có hoạt tính sinh học từ chủng nấm C militaris HTD3 C cicadae VTD4 để ứng dụng sản xuất thực phẩm chức Việt Nam Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 52 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đái Duy Ban cộng (2009) Nghiên cứu phát loài đông trùng hạ thảo Isaria cerambycidae NSP Việt Nam xác định số hoạt chất sinh học đông trùng hạ thảo Thông tin Y học Bộ Y Tế tháng 8/2009 Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trần Thạnh Phong, Trương Thị Hồng Vân (2010) Nấm côn trùng Vườn Quốc gia Cát Tiên: nguồn tài nguyên quý cho ứng dụng sinh học Tuyển tập Hội nghị khoa học Kỹ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 1975-2010 109-118 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Liên Hoa, Lê Hoàng Yến, Nguyễn Văn Bắc (2006) Chương trình vi sinh vật học- Nấm sợi Nguyễn Mậu Tuấn, Trương Phi Hùng, Nguyễn Thái Huy, Dương Thị Ngọc (2009) Hiệu dịch chiết nấm đông trùng hạ thảo tằm dâu Paecilomyces tenuipes đến khả bơi chuột Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam 2(15): 110-115 Pham Quang Thu (2009) Điều tra phát nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps nutans Pat Phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử, Sơn Động, Bắc Giang Tạp chí NN&PTNT 4: 91-94 Phạm Quang Thu (2009) Phát nấm ký sinh côn trùng vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc Tạp chí NN&PTNT 6: 96-99 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân (2009) Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh trưởng hệ sợi nuôi cấy khiết số loài nấm ký sinh côn trùng Tạp chí NN&PTNT 11: 97-102 Phạm Thị Thùy (2010) Nghiên cứu phát triển nguồn nấm Beauveria Metarhizium để ứng dụng phòng trừ sâu hại trồng, rừng phát nguồn nấm Cordyceps sp làm thực phẩm chức cho người Báo cáo Hội thảo Quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam 24/4- 25/4/2010 Nhà xuất Nông nghiệp Trang 224-231 Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 53 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Trần Ngọc Lân (2008) Đa dạng sinh học nấm ký sinh côn trùng Vườn Quốc gia Pù Mát đánh giá khả ký sinh số loài nấm số loài sâu hại trồng Đề tài cấp Giáo dục & Đài tạo Mã số: B2007- 27-25 10 Trịnh Tam Kiệt tác giả (2001) Danh mục loài thực vật Việt Nam (phần Nấm) Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội 11 Trịnh Tam Kiệt (2011) Nấm lớn Việt Nam Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ Hà Nội Tiếng Anh Ahn YJ, Park SJ, Lee SG, Shin SC, Choi DH (2000) Cordycepin: selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp J Agric Food Chem 48:2744-2748 Chen L.T., Cao H.F & Huang W.F, 2005 Components, pharmacological activities and application of Cordyceps militaris, Modern Food Science 21(3) 192-195 Dong JZ, Liu MR, Lei C, Zheng XJ, Wang Y (2012) Effects of Selenium and Light Wavelengths on Liquid Culture of Cordyceps militaris Link Applied Biochemistry and Biotechnology 166:2030 2036 H Lee, YJ Kim, HW Kim, DH Lee, MK Sung, T Park (2006) Induction of Apoptosis by Cordyceps militaris through Activation of Caspase-3 in Leukemia HL-60 Cells Biological and Pharmaceutical Bulletin,Vol 29 No P 670-674 Hardeep Singh Tuli, Anil K Sharma, Sardul Singh Sandhu (2014) Optimization of fermentation conditions for cordycepin production using Cordyceps militaris 3936 Journal of Biological and Chemical Sciences Vol.1, no 1, 35-47 Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 54 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Hermann, S.C.; Feigl, E.O (1992) Adrenergic blockade blunts adenosine concentration and coronary vasodilation during hypoxia Circ Res 70: 1203–1216 Ho Gyoung Kim, Bhushan Shrestha, So Yeon Lim, Deok Hyo Yoon, Woo Chul Chang, Dong-Jik Shin, Sang Kuk Han, et al., (2006) Cordycepin inhibits lipopolysaccharide-induced inflammation by the suppression of NFκB through Akt and p38 inhibition in RAW 264.7 macrophage cells European Journal of Pharmacology 545 (2006) 192–199 Hui LJ, Hao BH, Chu C, Qin L, Ping L (2011) Morphological and microscopic identification studies of Cordyceps and its counterfeits Acta Pharmaceutica Sinica B 3: 189-195 Jian HX, Dai MX, Qing X, Zong QL and Jian JZ (2009) Optimum extraction and high-throughput detection of cordycepic acid from medicinal macrofungi Cordyceps jiangxiensis, Cordyceps taii and Cordyceps gunnii Journal of Food, Agriculture & Environment (3&4): 328- 333 10 John H, Malt C (2008) Medicinal value of the caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) International Journal Medicinal Mushroom 10(3): 219-234 11 John H, Matt C, Aloha M Inc, SantaCruz, California, U.S.A (2005) Cordyceps Wasser SP Institute of Evolution, University of Haifa, Mt.Carmel, Haifa, Israel 12 Kim H, Yun JW (2005) A comparative study on the production of exopolysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures Journal of Applied Microbiology 99: 728-738 13 Klaunig JE, Kamendulis LM (2004) The role of oxidative stress in carcinogenesis Annu Rev Pharmacol 44: 239-267 14 Kodama, E.N.; McCaffrey, R.P,; Yusa, K.; Mitsuya, H (2000) Antileukemic activity and mechanism of action of cordycepin against terminal deoxynucleotidyl tranferase-positive (TdT+) leukemic cells Biochem Pharmacol 59: 273–281 Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 55 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 15 Li, S P., Yang, F Q., & Tsim, K W K (2006) Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41: 1571–1584 16 Li, Sakurai A, Imai H, Ejiri T, Endoh K, Usami S (1991) Citric acid production by surface culture using Aspergillus niger: kinetics and simulation J Ferment Bioeng 72:15–9 17 Lo HC, Chienyan H, Fang YL and Hsu TH (2013) A systematic review of the mysterious DongChongXiaXao caterpillar and fungus Relates OphioCordyceps Bioactive ingredients sinensis in Journal of Traditional and Complementary Medicine 3(1): 16-32 18 Lu LX, Xu Q, Liu ZH, Sun Y, Djing Z, Li YQ (2012) Optimization of production of intracellular polysaccharides from Cordyceps ophiolossoides L2 in submerged culture and its antioxidant activities intro Chinese Journal of Chemical Engineering 20(2): 294-301 19 Mao XB, Zhong JJ (2004) Hyperproduction of Cordycepin by Two-Stage Dissolved Oxygen Control in Submerged Cultivation of Medicinal Mushroom Cordyceps militaris in Bioreactors Biotechnol Prog 20: 14081413 20 Mao XL (2000) The macrofungi in China Henam Technical and Science Publication House 21 Mina Masuda, Eriko Urabe, Akihiko Sakurai, Mikio Sakakibara (2005) Production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris ScienceDirect 39 (4): 641–646 22 Nakamura K, Yamaguchi Y, Kagota S, Shinozuka K, Kunitomo M (1999) Activation of in vivo Kupffer cell function by oral administration of Cordyceps sinensis in rats Jpn J Pharmacol 79: 505–508 23 Ohta Y Lee, J B Hayashi, K F ujita A., Park D K, (2007) Invivo antiinfluenza virus activity of animmun omodulatory acidicpolysaccharide isolated from Cordyceps militaris grow on genninated soybeans Journal of Agricutural and Food Chemistry, 55 (25), 10194-10199 Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 56 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 24 Park JP, Kim SW, Hwang HJ, Yun JW (2001) Optimization of submerged culture conditions for the mycelialgrowth and exo-biopolymer production by Cordyceps militaris Letters in Applied Microbiology 33: 76-81 25 Seok KL, Lee JS, Shin CW, Lee KE, Hong EK (2009) Optimization of culture conditions and medium components for the production of mycelia biomass and exo-polysaccharide with Cordyceps militaris in liquid culture Biotechnology and Bioprocess Engineering 14: 756-762 26 Shashihara MG, Giridhare P, Udaya SK, Manohar BI (2013) Bioactive principles from Cordyceps sinensis: A potent food supplement – A review Journal of functional foods 910-8507 27 Shashidhar M Ghatnur, Giridhar Parvatam, Manohar Balaraman (2015) Culture conditions for production of biomass, adenosine, and cordycepin from Cordyceps sinensis CS1197: Optimization by desirability function method Pharmacognosy Magazine, 11(44): 448-456 28 Shi Z, Huijuan P, Leifa F, Guoying L, Yongzhi W, Binod P, Ashok P and Carlos R Soccol (2009) Advances in Research of Polysaccharides in Cordyceps Species Food Technology and Biotechnol 47(3): 304-312 29 Shih IL, Tsai KL, Hsieh C (2007) Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactivemetabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris Biochemical Engineering Journal 33: 193–201 30 Shrestha B, Zhang W, Zhang Y, Liu X (2010) What is the Chinese caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis (Ophiocordycipitaceae) Mycology 1:22836 31 Sung GH, Nigel L, Jones H, Sung JM, Luangsa-ard JJ, Shrestha B and Spatafora JW (2007) Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi Studies in Mycology 57: 5–59 32 Sung JM (2000) Insect-born fungus of Korea, Kangwon National Univ., Korea 33 Thao DT, Phuong DT, Hanh TTH, Thao NP, cuong NX, Nam NH (2014) Two new neoclerodane diterpenoids from Scutellaria barbata D Don growing in Vietnam J Asian Nat Prod Res 16, 364–369 Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 57 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 34 Won SY, Park EH (2005) Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris J Ethnopharmacol 96: 555- 561 35 Xiao JH, Chen DX, liu JW, Liu LZ, Wan WH, Fang N, Xiao Y, Qi Y, Liang ZQ (2004) Optimization of submerged culture requirements for the production of mycelial growth and exopolysaccharide by Cordyceps jiangxiensis JXPJ 0109 Journal of Applied Microbiology 96: 1106-1116 36 Xuanwei Z, Gonga Zhenghua, Sua Ying, Linb Juan, Tang K (2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and development products Journal of Pharmacy and Pharmacology 61(3): 279291 37 Yang JK, Wang WQ, Ma HL, Wu JY (2013) Sulfation and enhanced antioxidant capacity of an exopolysaccharide produced by the medicinal fungus Cordyceps sinensis Molecules 18: 167-177 38 Yoo, H S., Shin, J W., Cho, J H., Son, C G., Lee, Y W., Park, S Y., Cho, C K (2004) Effects of Cordyceps militaris extract on angiogenesis and tumor growth Acta Pharmacol Sin 25: 657–665 39 Zhoua X, Gonga Z, Sua Y, linb J, Tang K (2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products Journal of Pharmacy and Pharmacology 61(3): 279-291 Trang web: http://luanvan.co/luan-van/nghien-cuu-moi-truong-nuoi-cay-nam-dongtrung-ha-thao-cordyceps-militaris-5927/ Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 58 Luận Văn Tốt Nghiệp Khoa Công nghệ sinh học PHỤ LỤC Trình tự gen chủng HTD3 TTGCCCCCCCAGATTACCCGGCCGAGTTGAAGCCGGCAACAGCTTCAAAT TTTGAAAATCTGGCCCTCCGGGTCCGAGTTTGTAATTTTGCAGAGGAATG CTTTCGGGCGAGGTTGCCTTCCGAGTTTCCCTGGAACGGGACGCCATAGA GGGTGAGAGCCCCGTCTGGTCGGACACCGAGCCCGTGTGAAGCTCCTTCG AAGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGGGAGGTATATGTCTT CTAAAGCTAAATATTGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCG AAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGCGCCCATGACCAGACTTGGGCCCGGTGAATCATCCGGCGT TCTCGCCGGTGCACTTTGCCGGGCACAGGCCAGCATCAGTCTGGCGCGGG GGATAAAGGCTTCGGGAATGTGGCTCCCTCGGGAGTGTTATAGCCCGTTG CGCAATACCCTGCGCCGGACTGAGGTACGCGCATCGCAAGGATGCTGGCG TATGGTCTCAGCGACCTTGAAAAAAAAACCACAAAAAAAAAATAAACCGA GT GAAAGGGAAGCGCCCATGACCAGACTTGGGCCCGGTGAATCATCCGGC Trình tự gen chủng VTD4 CTCCCACCCTTCTGTGACCTACCCATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCGT CCGGACGGCCCTGCGCCGGCCCGCGACCTGGACCCAGGCGGCCGCCGGAGAC CACGCAACCCTGTATCCATCAGTCTCTCTGAATCCGCCGCAAGGCAACACAAA TGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACG CAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATC TTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGT CATTTCAACCCTCGACGTCCCCTGGGACGTCGGCCTTGG Lê Thị Ngọc Trâm 1202- CNSH 59