VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH KHÁNG SINH DEMETHYL DIHYDROCHALCOMYCIN TẠO RA TỪ STEPTOMYCES SP.KCTC0041BP/∆ GER MI Giáo viên hướng dẫn:T.STẠ THỊ THU THỦY Sinh viên:ĐỖ THỊ TRANG Lớp: 1203–K19 Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo – TS.Tạ Thị Thu Thủy – người định hướng nghiên cứu, tận tình giúp đỡ chúng em trình thực đề tài Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo ThS.Nguyễn Thành Chung toàn thể thầy cô giáo Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử - Khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội, anh chị kỹ thuật viên - Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để chúng em hoàn thành đề tài Qua đây, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, toàn thể bạn Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử động viên giúp đỡ chúng em nhiều trình thực đề tài Trong trình nghiên cứu đề tài, thân có nhiều cố gắng, tránh khỏi thiếu sót, hạn chế nên chúng em mong nhận góp ý quý thầy – cô bạn lĩnh vực nghiên cứu Chúng em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 23 tháng 02 năm 2016 Sinh viên Đỗ Thị Trang MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Lịch sử kháng sinh 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.1.5 Các nghiên cứu gần kháng sinh 1.2 Xạ khuẩn 1.2.1 Vai trò xạ khuẩn tự nhiên 1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 10 1.2.3 Chủng xạ khuẩn Steptomyces sp.KCTC 0041BP/∆ Ger MI 11 1.3 Kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin 12 1.3.1 Cấu trúc Demethyl dihydrochalcomycin 13 1.3.2 Vai trò hoạt tính sinh học 14 1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất ứng dụng kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin nước giới 14 1.4 Mục tiêu nội dung đề tài 19 1.4.1 Mục tiêu 19 1.4.2 Nội dung 19 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Thiết bị, hóa chất, vật liệu 22 2.1.1 Vật liệu 22 1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Dụng cụ thiết bị 24 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp vi sinh 25 2.2.1.1 Phương pháp nuôi cấy chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh 25 2.2.1.2 Phương pháp nuôi chủng VSV kiểm định 26 2.2.1.3 Phương pháp bảo quản giống 27 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 27 2.2.2.1 Phương pháp tách chiết kháng sinh thô 27 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 28 2.2.2.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC 29 2.2.2.4 Phương pháp sắc ký Cột 31 PHẦN III: KẾT QUẢ 34 3.1 Ảnh hưởng điều kiện lên men tổng hợp kháng sinh 34 3.1.1 Điều kiện nhiệt độ 34 3.1.2 Điều kiện pH dịch nuôi 34 3.1.3 Tỷ lệ giống thích hợp để sinh kháng sinh 35 3.1.4 Ảnh hưởng thời gian 36 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả thu nhận tinh kháng sinh 37 3.2.1 Hệ dung môi thích hợp để thu nhận kháng sinh thô 37 3.2.2 PH thích hợp để thu nhận kháng sinh thô 38 3.2.2 Hệ dung môi thích hợp để tinh kháng sinh 39 3.2.3 Tinh kháng sinh chạy cột sắc ký Silica gel 39 3.2.4 Phân tích kháng sinh sau chạy cột mỏng TLC 41 3.2.5 Phân tích kháng sinh phương pháp kháng khuẩn 43 3.2.6 Phân tích kháng sinh phương pháp khối phổ LC-Mass 43 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 49 4.1 Kết Luận 49 4.2 Đề xuất 49 Tài liệu tiếng việt 50 Tài liệu tiếng anh: 50 Trang web tham khảo: 51 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích Amp Ampicillin Apr Apramycin Bp Base paire C Carbon CKS Chất kháng sinh Cm Chloramphenicol DMI Downstream MI DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxyribonucleotides ORFs Open reading frames RNA Ribonucleic Acid Gr+ Gram dương Gr- Gram âm HTKS Hoạt tín kháng sinh Kb Kilobase Neo Neomycin Neor Gen kháng neomycin PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate Ter Tetramycin TLC Thin layer chromatography IPTG Isopropyl-thio-β-galactoside DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế tác dụng kháng sinh…………………………………… Hình 1.2 Cấu trúc Demethyl dihydrochalcomycin…………………… …14 Hình 1.3 Dự đoán đường sinh tổng hợp gốc đường khử bước cuối hoàn thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin ……………………………….19 Hình 3.1 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ………………………………34 Hình 3.2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống thích hợp thu nhận kháng sinh thô…35 Hình 3.3 Thử hoạt tính kháng khuẩn (A ethylacetate; B:Chloroform; D: nbutanol)…………………………………………………………………………37 Hình 3.4a chloroform :methanol……………………………………………….39 Hình 3.4b ethylacetat:methanol……………………………………………… 39 Hình 3.5 :Chạy sắc ký cột tỷ lệ dung môi chloroform:methanol khác … 40 Hình 3.6 :Hình ảnh tách kháng sinh thu sau chạy cột……………… 41 Hình 3.7: Phân tích kháng sinh sau chạy cột mỏng TLC ………… 41 Hình 3.8: Mẫu thử hoạt tính kháng sinh phân đoạn…………………… 43 Hình 3.9a Kháng sinh thô sau tinh phân tích LC-Mass.43 Hình 3.9b kháng sinh thô sau tinh phân tích khối lượng phân tử phương pháp LC-Mass………………………………………………… 44 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Dự đoán chức gen ORFs nhóm gen sinh tổng hợp dimethyl dihydrochalcomycin…………………………………………………16 Bảng 2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng đề tài………………………………… 25 Bảng 3.1 Ảnh hưởng điều kiện pH dịch nuôi……………………… ……35 Bảng 3.2 :Khảo sát thời gian thích hợp cho sinh kháng sinh …………… … 36 Bảng 3.3 :Kết thử hoạt tính kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin với loại dung môi…………………………………………………………………37 Bảng 3.4 :Khảo sát pH thích hợp sinh kháng sinh…………………………….38 Bảng 3.5 : Tỷ lệ dung môi Chloroform: Methanol để tinh kháng sinh … 40 Bảng 3.6: Giá trị Rf phân đoạn có hoạt tính 3,4,5,6,7,8……………………….42 Bảng 3.7: Bảng so sánh giá trị Ovelay với TLC………………………… 42 Viện Đại Học Mở Hà Nội LỜI MỞ ĐẦU Bệnh nhiễm khuẩn nỗi kinh hoàng người Những trận đại dịch làm thay đổi sức mạnh đoàn quân thiện chiến, chí dẫn đến diệt vong đế chế hùng mạng Chính điều thúc nhà khoa học giới phải tìm chất có khả phòng chống điều trị bệnh nhiễm khuẩn Năm 1928, Alexander Fleming phát penicillin – chất kháng sinh (CKS) có nguồn gốc từ nấm Penicillium phải 10 năm sau, năm 1941- penicillin thức sử dụng y học cứu sống bệnh nhân nhiễm trùng máu đầu tiên, từ kỷ nguyên CKS bắt đầu Đây thành tựu vĩ đại nhân loại kỷ XX Hiện với phát triển công nghệ thông tin công nghệ sinh học coi ngành công nghệ hàng đầu giới Trong phải kể đến công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin hoạt chất ứng dụng y học lĩnh vực khác phục vụ đời sống người có phát triển vượt bậc Từ phương pháp sinh tổng hợp bán tổng hợp công nghệ vi sinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò Trong số 10.000 CKS tìm có khoảng 2.000 chất thực vật tạo ra, khoảng 8.000 chất kháng sinh vi sinh vật tổng hợp, xạ khuẩn tổng hợp 80% [1] Tuy nhiên, việc sử dụng CKS không hợp lý làm cho tượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển ngày lan rộng Việc sử dụng số chất đặc hiệu để chữa trị số loại bệnh không mang lại hiệu mong muốn Số lượng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày gia tăng Chính vậy, việc tìm kiếm CKS thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Demethyl dihydrochalcomycin kháng sinh thuộc nhóm macrolide 16C, sử dụng điều trị nhiễm trùng đường hô hấp Nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu loại kháng sinh nhiều ưu điểm vượt trội độc, dung nạp tốt, thải trừ nhanh, đặc biệt có hoạt tính kháng khuẩn mạnh chưa xuất hiện tượng kháng thuốc.Demethyl dihydrochalcomycin dẫn xuất kháng sinh dihydrochalcomycin chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP/∆Ger MI, có tác dụng ức chế tiêu diệt vi khuẩn Gr- (Gram âm) Gr+ (Gram dương) cách liên kết vào tiểu phần 50S ribosome, ngăn cản trình sinh tổng hợp protein vi khuẩn Vì tiến hành lựa chọn đề tài:” Nghiên cứu xây dựng quy trìnhtách chiết tinh kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin tạo từ Streptomyces sp KCTC 0041BP/∆GerMI Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Lịch sử kháng sinh Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh Alexander Fleming nghiên cứu tụ cầu ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp petri nuôi tụ cầu tạo thành vòng vô khuẩn.Hiện tượng kì lạ Fleming nghiên cứu, phân lập khiết xác định mốc xanh Penicillium notatum – chủng tạo penicillin Năm 1938, Fleming nhận thư hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford Ernst Boris Chain Howard Walter Florey, với lời đề nghị hợp tác với ông để tiếp tục thực công trình nghiên cứu penicillin họ thử nghiệm thành công penicillin chuột vào 1940 Năm 1941, nhóm chọn loại nấm Penicillium ưu việt chủng Penicillum chrysogenium, chế loại penicillin có hoạt tính cao triệu lần penicillin Fleming tìm thấy lần đầu năm 1928 Năm 1945, Fleming giải thưởng Nobel y học với Ernst Boris Chain Howard Walter Florey Một số kháng sinh khác : sulfornamid Gerhard Domard (Đức) tìm vào năm 1932 streptomycin Selman Waksman Albert Schat tìm vào năm 1934.Sau đặc biệt hai thập kỷ cuối kỷ XX, công nghệ sinh học hóa dược phát triển mạnh, người ta tìm nhiều loại kháng sinh mới.Ngày người biết khoảng 8000 chất kháng sinh khác có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn vi khuẩn, 100 loại dùng Y khoa Thú y 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh Thời kì vàng son kháng sinh sản xuất penicillin để dùng lâm sàng (1941) Khi người ta định nghĩa:" Kháng sinh sản phẩm trao đổi chất tự nhiên vi sinh vật tiết (vi khuẩn, vi nấm), có Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Kết cho thấy sử dụng hệ dung môi ethyacetate:dịch nuôi (1:1) có hiệu thu nhận kháng sinh tốt vởi thời điểm xuất Demethyl dihydrochalcomycin có màu đậm, sắc nét, rõ rệt (hình A) so với hệ dung môi khảo sát khác có khả tách chiết không cao 3.2.2 PH thích hợp để thu nhận kháng sinh thô Tiến hành kiểm tra kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin thô thu từ dịch nuôi với dải pH 6,6; 6,8; 7,0; 7,2; 7,4;7,6; 7,8; 8,0; 8,2; 8,4 khảo sát phương pháp thử hoạt tính kháng sinh đục lỗ thạch khoanh giấy lọc.Ta bảng số liệu sau: Bảng 3.4 Khảo sát pH thích hợp sinh kháng sinh STT Giá trị pH D1(cm) D2(cm) 6,6 1,1 0,9 6,8 1,4 1,1 7,0 2,0 1,2 7,2 2,1 1,4 7,4 2,5 1,4 7,6 2,6 1,6 7,8 2,8 2,1 8,0 2,6 2,0 8,2 1,5 1,7 10 8,4 1,1 1,2 Chú thích: D1(cm): Đường kính vòng kháng khuẩn đục lỗ thạch V=500µl D2(cm):Đường kính vòng kháng khuẩn khoanh giấy lọc V=50 µl Kết cho thấy pH dung dịch có ảnh hưởng lớn đến khả hòa tan kháng sinh dung môi, pH 7,4 đến 7,8 cho thấy lượng kháng sinh thu nhiều hơn, đường kính vòng vô khuẩn lớn D1= 2,8cm;D2=2,1 Tại giá trị pH khác lượng kháng sinh thu hơn, đặc biệt giá trị nhỏ từ 6,6 đến 6,8 8,2 đến 8,4 vòng kháng khuẩn nhỏ hơn.Với pH từ 7,5 đến 38 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 7,8 phù hợp để tách kháng sinh thô dung môi.Vì nhóm nghiên cứu sử dụng pH=7,8 để nuôi xạ khuẩn sinh kháng sinh 3.2.2 Hệ dung môi thích hợp để tinh kháng sinh Hình 3.4a chloroform:methanol(9:1)Hình 3.4b ethylacetate:methanol(1:1) Kết phân tích mỏng cho thấy với hệ dung môi chloroform: methanol (hình 3.6a) có vết tách kháng sinh rõ nét, tạo khoảng cách rõ rệt với tạp chất khác Vì áp dụng hệ dung môi chạy cột tinh kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin 3.2.3 Tinh kháng sinh chạy cột sắc ký Silica gel Chất hấp phụ sắc ký cột silicagel.Dung môi hỗn hợp gồm loại dung môi methanol: chloroform có tỷ lệ thích hợp.Sau chuẩn bị cột nhồi cột ta tiến hành đưa kháng sinh thô vào cột để tinh Tiến hành giải ly chất khỏi cột hệ dung môi chloroform: methanol với dải tỷ lệ thể tích bảng sau: 39 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Bảng3.5: Tỷ lệ dung môi Chloroform:Methanol để tinh kháng sinh STT Phân đoạn Chloroform(ml) Methanol(ml) 1 99 2 98 3 97 4 96 5 95 6 94 7 93 8 92 9 91 10 10 90 10 Hình 3.5 :Chạy sắc ký cột tỷ lệ dung môi chloroform:methanol khác Sau chạy cột ta thu thể tích dung môi chứa mẫu cần phân tích 10 phân đoạn với tỷ lệ khác nhau.Đem thể tích 10 phân đoạn quay cô chân không,sau hòa tan chất quay cô 10 phân đoạn riêng biệt với methanol ta hình ảnh sau : 40 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 3.6 :Hình ảnh tách kháng sinh thu sau chạy cột 3.2.4 Phân tích kháng sinh sau chạy cột mỏng TLC Sau chạy cột ta thu 10 phân đoạn riêng biệt,lần lượt đem 10 phân đoạn phân tích mỏng TLC thử hoạt tính kháng sinh phương pháp Overlay với vi sinh vật kiểm định làBacillus subtilis ATCC 11778 Hình 3.7: Phân tích kháng sinh sau chạy cột mỏng TLC Bảng 3.6: Giá trị Rf phân đoạn có hoạt tính 3,4,5,6,7,8 Phân đoạn Rf1 Rf2 Rf3 Rf4 41 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 0,67 0,41 0,52 0,61 0,14 0,21 0,41 0,14 0,21 0,27 0,15 0,18 0,07 0,07 0,14 0,55 Qua bảng số liệu ta thấy phân đoạn có hoạt tính 0,67 phân đoạn mạnh 0,41;0,52;0,64 phân đoạn có hoạt tính mạnh 0,14;0,21, Có hoạt tính yếu 0,41 0,55 phân đoạn có hoạt tính mạnh 0,14;0,21 0,27 phân đoạn 7,8 có hoạt tính thấp phân đoạn 1,2,9,10 có hoạt tính thấp Bảng 3.7:Bảng so sánh giá trị Ovelay với TLC Phân đoạn Overlay Bản TLC Rf 0,67 0,67 Rf1 0,41 0,29 Rf1 0,52 0,49 Rf2 0,61 0,64 Rf3 0,14 0,07 Rf1 0,21 0,21 Rf2 0,41 0,49 Rf3 0,55 Rf4 0,14 0,14 Rf1 0,21 0,21 Rf2 0,27 0,31 Rf3 0,43 Rf4 0,54 Rf5 0,15 0,17 Rf1 0,18 0,21 Rf2 0,31 Rf3 Phân tích theo báo GERI-155, a New Macrolide Antibiotic Related to chalcomycin SHIN-DUK KIM, IN-JA RYOO, CHANG-JIN KIM cộng 42 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội đăng tạp chí kháng sinh ( The Journal Of Antibiotics ) giá trị Rf=0,21 phân đoạn 5,6 kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin tạo từ chủng xạ khuẩn Steptomyces sp.KCTC0041BP/∆ Ger MI thu sau tinh 3.2.5 Phân tích kháng sinh phương pháp kháng khuẩn Sau chạy cột ta thu 10 phân đoạn riêng biệt hình 3.4,lần lượt đem 10 phân đoạn phân tích kháng sinh phương pháp kháng khuẩn với thể tích chấm lên khoanh giấy lọc phân đoạn mẫu 20 µl 50 µl với vi sinh vật kiểm định làBacillus subtilis ATCC 11778 Hình 3.8: Mẫu thử hoạt tính kháng sinh 3.2.6 Phân tích kháng sinh phương pháp khối phổ LC-Mass Hình 3.9a Kháng sinh thô sau tinh phân tích LC-Mass 43 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 3.9b Kháng sinh thô sau tinh phân tích khối lượng phân tử phương pháp LC-Mass 44 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Quy trình bước khảo sát điều kiện lên men tổng hợp kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin Chủng xạ khuẩn Steptomyces sp.KCTC0041BP/∆Ger MI Tăng sinh cấp 1trong môi trường R2YE lỏng 50ml,trong 96 280C,200 vòng/phút Tăng sinh cấp ,R2YE lỏng 150ml,96 giờ,280C,200 vòng/phút Dịch sau lên men chuẩn pH=7,8 NaOH 1N Bổ sung ethylacetate: dịch nuôi (1:1) Lắc phân pha Ly tâm Loại xác tế bào Quay cô chân không Kháng sinh thô Ethyl acetate thuhồi Hòa tan kháng sinh MeOH Bảo quản tủ -200C 45 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Giải thích quy trình: 1) Chủng xạ khuẩn Steptopmyces sp KCTC0041BP/∆ GerMI nuôi tăng sinh cấp bình tam giác 250ml với thể tích 50ml/bình môi trường R2YE lỏng 96 giờ,280C,lắc 200 vòng/phút 2) Lấy 3ml từ môi trường tăng sinh cấp cấy tăng sinh cấp sang bình tam giác 500 ml với thể tích nuôi cấy 150ml/1 bình nhiệt độ 280C, 200 vòng/phút ,96 3) Dịch lên men sau nuôi chuẩn pH=7,8 NaOH 1N 4) Sau bổ sung ethylacetate:dịch nuôi (1:1) lắc phân pha tiếng đem ly tâm loại bỏ xác tế bào thu dịch chiết 5) Dịch chiết đem quay cô chân không 40C,126mbarthuđược kháng sinh thô ethylacetate thu hồi 6) Hòa tan kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin thô với MeOH với tỉ lệ dịch chiết: methanol (50ml:1ml) bảo quản tủ -200C 46 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Quy trình tinh kháng sinh Demethyl diydrochalcomycin Demethyl dihydrochalcomycin Nạp vào cột nhồi silicagel cân Khuấy với cloroform Hạt silicagel hòa với cloroform Rửa lại cột cloroform Kiểm tra pH dịch thoát từ cột, kiểm tra độ tinh dịch Nạp dung môi rửa giải Chloroform: Methanol (99:1) (98:2),(97:3),(96:4),(95:5),(94:6),(93:7), (92:8),(90:10) Thu phân đoạn chạy cột.Kiểm tra sắc ký mỏng (TLC) Hệ dung môi Aceton:Chloroform(3:7) Thu phân đoạn chứa demethyl dihydrochalcomycin Rf= 0,21kiểm tra UV Thu demethyl dihydrochalcomycin tinh Kiểm tra độ tinh 47 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Giải thích quy trình: 1) Kháng sinh thô, tách cầu mỡ chạy qua cột điều chế hấp phụ hoàn toàn với silicageltheo nguyên lý tách phân cực Để rửa chất kháng sinh, cột silicagel hấp phụ rửa nhiều lần với chloroform dịch thu từ cột thoát suốt 2) Hệdung môi rửa giải hỗn hơp dung môi gồm Chloroform: Methanol Thu phân đoạn chạy cột kiểm tra khả nhả hấp phụ kháng sinh phương pháp chạy mỏng TLC với hệ dung môi Aceton:Clorofom (3:7) Thu Demethyl dihydrochalcomycin tinh phân đoạn có kháng sinh xuất giá trị Rf =0,21 với chấm mỏng 3) Kiểm tra độ tinh kháng sinh thu được, phương pháp đánh giá phân tích gồm: phân tích phương pháp kháng khuẩn,chạy phân tích mỏng TLC, phân tích độ tinh sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ,phân tích độ tinh phương pháp LC-Mass ,của kháng sinh thu 48 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết Luận • Tìm điều kiện thích hợp để lên men kháng sinh • Đã tách chiết tinh kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin từ chủng Steptomyces sp.KCTC0041BP/∆ Ger MI 4.2 Đề xuất • Tiến hành xác định công thức phân tử công thức cấu tạo kháng sinh từ chủng đột biến để khẳng định chắn vai trò gen MI • Tách dòng biểu gen MI, thực phản ứng invitro để chứng minh vai trò gen MI 49 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Tài liệu tiếng việt Cao Văn Thu (2000), Bài giảng kháng sinh vitamin, Bộ môn công nghiệp dược, Đại học dược Hà Nội Kiều Hữu Ảnh (2007), Giáo trình vi sinh vật học (tập 2), Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học – Tập III NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lê Đỗ Huyền Trang (2012), Nghiên cứu biểu gen GerF nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường dTDP-6-deoxy-D-allose cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Công nghệ sinh học-Viện đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Phương Thảo (2013) Thiết kế vector đột biến gen MI chứng minh khả sinh tổng hợp kháng sinh Dihydrochalcoycin gen MI,Khóa luận tốt nghiệp ,Khoa Công nghệ sinh học –Viện đại học Mở Hà Nội - Tài liệu tiếng anh: Xuemei M., and Hung-wen Liu, Formation Of Unusual Sugars: Mechanistic Studies and Biosynthetic Applications, Annu Rev Biochem 71, 2002, 701-754 Hansen, J L., Ippolito, J A., Ban, N., Nissen, P., Moore, P B., Steitz, T A., The Structures of Four Macrolide Antibiotics Bound to the Large Ribosomal Subunit , 2002, Mol Cell., 10, 117-128 9.Goo, Y M., Y Y Lee, and B T Kim, A new 16-membered chalcomycin type macrolide antibiotic, 1997, J Antibiot 50, 85-88 10 Yoo JC, Kim JH, Ha JW, Park NS, Sohng JK, Production and biological activity of laidlomycin, anti – MRSA/ VRE antibiotic from Streptomyces sp CS684, J Microbiol, 2007/ 2, 45 (1): – 16 11 Tresner H D, M C Davies, and E Jackus, Electron icroscopy of Streptomyces spore morphology and its role in species ifferentiation, 1961, J Bacterio 50 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 12.Kim, S.D., IJ Ryoo., CJ Kim., WG Kim., JP.Kim., JY Kong., H Koshino., M Uramoto and ID 13 Kirst HA, Sides GD, New directions for macrolide antibiotics: structural modifications and in vitro activity Antimicrob Agents Chemother, 1989 Sep, 33(9), 1413–1418 14 Asolkar, R N., Maskey, P R., Helmke, E., Laatsch, H., Chalcomycin B, new macrolide antibiotic from the marine isolate Streptomyces sp B7064.J Antibiot.2002,55, 893-898 15.Kim, S.D., IJ Ryoo., CJ Kim., WG Kim., JP.Kim., JY Kong., H Koshino., M Uramoto and ID Yoo, GERI‐155 a new macrolide antibiotic related to chalc omycin, 1996, J Antibiot 49, 955‐957 16 Poehlsgaard, J., Douthwait, S., The macrolide binding site on the bacterial ribosome.Current drug targets Infectious disorders, 2002, 2(1), 67-78 17 Jaishy, Bharat Prasad, Si Kyu Lim, Ick Dong Yoo, Jin Cheol Yoo, Jae Kyung Sohng, and Doo Hyun Nam, Cloning and Characterization of a Gene Cluster for the Production of Polyketide Macrolide Dihydrochalcomycin in Streptomyces sp KCTC 00841BP, 2006, J Microbiol Biotechnol.,16, 764-770 18 Bate N, Cundliffe E The mycinose-biosynthetic genes of Streptomyces fradiae, producer of tylosin, 1999, J Ind.Microbiol.Biotechnol.23, 118-122 19 Ta Thi Thu Thuy, Biosynthesis pathway of dihydrochalcomycin produced by Streptomyces sp KCTC 0041BP: deoxysugar and glycosyltransferase, 2006 20 Rohr, J Deoxysugar, polyketides and related class: Synthesis, biosynthesis, enzymes Bioorganic Chemistry, 1997, 47-50 Trang web tham khảo: - 21http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/showthread.php?tid=584.html - 22 http://luanvan.co/luan-van/vector-cac-dac-tinh-quan-trong-vector-can-cocac-loai-vector-3117/ - 23 http://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_conjugation 51 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 24 http://dulieu.tailieuhoctap.vn/books/khoa-hoc-ky-thuat/cong-nghe-sinhhoc/file_goc_779730.pdf 25 https://issuu.com/daykemquynhon/docs/adppskcvsklmvgdhhpt 26 http://www.ued.edu.vn/khoahoa/file.php/1/_themem/Phan_tich_sac_ki_khi_ Th_Vung_.pdf 52 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp [...]... dung -Nghiên cứu điều kiện thích hợp sinh tổng hợp kháng sinhDemethyl dihydrochalcomycin của chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP/∆ Ger MI -Xây dựng quy trình thu nhận và tách chiết và tinh sạch kháng sinh -Tìm điều kiện thích hợp đểthunhận và tinh sạch kháng sinh Demethyl dihydochalcomycin 19 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN 2VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các... gen, tách được nhóm gen 14 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội tham gia vào con đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP/∆ Ger MI Bảng 1.1Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng hợp dihydrochalcomycin Tên Số amino acid Ger1 Ger2 Ger3 Ger4 GerA GerB GerMIG erN GerR GerPI GerPII GerG GerD GerE GerF GerMII GerPIII... GerF và enzyme này được sinh ra ở dạng tan là ở 26oC, trong 8h, nồng độ IPTG 10mmol.[5] 18 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 1.4 Mục tiêu và nội dung đề tài 1.4.1 Mục tiêu -Lựa chọn phương pháp và xây dựng quy trình tách chiết kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin từchủng Streptomyces sp KCTC 0041BP/∆ Ger MImục đích để tách chiết thế hệ kháng sinh mới từ dẫn xuất dihydrochalcomycin. .. vậy kháng sinh nhóm macrolide 16C là nhóm kháng sinh đang được nỗ lực nghiên cứu bởi rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới với mục tiêu chính là: tạo ra các kháng sinh không bị ảnh hưởng bởi cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn và từ đó nghiên cứu và phát triển nhóm kháng sinh polyketide synthase (PKS) thế hệ mới 1.3.1 Cấu trúc của Demethyldihydrochalcomycin Demethyl dihydrochalcomycin thuộc nhóm kháng sinh. .. Loại bỏ xác tế bào Tách chiết Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc Lựa chọn điều kiện tối ưu 20 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Các bước thực hiện trong nghiên cứu tách chiết và tinh sạch kháng sinh Demethyl dihydrochalcomycin Demethyl dihydrochalcomycin thô Tinh sạch kháng sinh bằng chạy cột sắc kí Silicagel Phân tích kháng sinh sau khi chạy cột... Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất 4 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội - Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid - Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ - Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy - Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no - Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm - Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng 1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Các kháng sinh. .. chalcosylglycosyltransferase (GerTII) và cuối cùng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí C3 nhờ hoạt động của enzyme O-methyltransferase (GerMI) tạo gốc đường D-chalcose - Gốc đường D-mycinose đã được nghiên cứu trong cấu trúc kháng sinh tylosin vì vậy con đường sinh tổng hợp đã được chứng minh trong các nghiên 16 Đỗ Thị Trang-CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội cứu về kháng sinh này [15] Phản ứng sinh. .. sinh Demethyl dihydrochalcomycin trong nước và trên thế giới Lập thư viện gen và giải trình tự nhóm gen sinh tổng hợp Demethyl dihydrochalcomycin Qua thời gian nghiên cứu cấu trúc dihydrochalcomycin, kháng sinh này được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR – Nuclear Magnetic Resonance) và được phân loại thuộc nhóm kháng sinh PKS loại I Nhóm nghiên cứu đã tách và lập được... trò và hoạt tính sinh học Qua nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng ,kháng sinhDemethyl dihydrochalcomycin đã biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh có thể ức chế và tiêu diệt cả vi khuẩn Gr- và Gr+ Chủng xạ khuẩn tạo ra Demethyldihydrochalcomycin đã được phân lập, đồng thời cấu trúc hóa học của chúng cũng được xác định bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc, kháng sinh này được xác định là chất dẫn xuất của kháng. .. của kháng sinh, nhóm của Hansen đã chứng minh được cấu trúc nhân macrocyclic lacton của kháng sinh này hình thành phức hệ và gắn với tiểu phần lớn của ribosome vi khuẩn tại điểm tách chuỗi polypeptide ra khỏi tâm hoạt động của enzyme peptidyltransferase Từ đó kháng sinh này có hoạt tính ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn [8], [15] 1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng về kháng sinh Demethyl