VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN DUNG HỢP SUMO_IL-11 TRONG CHỦNG ESCHERICHIA COLI Người hướng dẫn : TS LÊ THỊ THU HỒNG Sinh viên thực : HOÀNG ANH HÀ Lớp : 12.03 HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp cố gắng thân nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, bạn bè người thân Trước tiên xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Thu Hồng, phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam không người tận tình hướng dẫn kiến thức, mà dành nhiều thời gian, công sức bảo tạo điều kiện cho suốt trình làm luận văn Nội dung khóa luận phần nội dung đề tài khoa học công nghệ cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng y học (điều trị)” GS.TS Trương Nam Hải làm chủ nhiệm Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy cô Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực luận văn Để thực luận văn này, nhận hướng dẫn kịp thời giúp đỡ quý báu toàn thể cán phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt ThS Dương Thu Hương, NCS Nguyễn Thị Quý KS Đặng Thị Ngọc Hà nhiệt tình hướng dẫn, hỗ trợ, giúp đỡ việc học tập, thực hành kỹ thuật chỉnh sửa luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân, bạn bè quan tâm, cổ vũ động viên nhiều trình học tập, hoàn thành luận văn Chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên HOÀNG ANH HÀ MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Interleukin-11 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Đặc tính phân tử cấu trúc IL-11 1.1.3 Vai trò ứng dụng IL-11 1.1.4 Tình hình nghiên cứu nước 1.2 Hệ biểu E coli 1.2.1 Chủng biểu E.coli 1.2.2 Vector biểu E coli 10 1.2.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu protein tái tổ hợp 12 1.2.3.1 Ảnh hưởng yếu tố môi trường 13 1.2.3.2 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng 13 1.2.3.3 Ảnh hưởng pH môi trường 14 1.2.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng 14 1.2.3.5 Ảnh hưởng thời điểm cảm ứng biểu 15 1.2.3.6 Ảnh hưởng thời gian thu mẫu biểu 16 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 17 2.1.1 Các chủng vi sinh vật plasmid 17 2.1.2 Hoá chất enzyme 17 2.1.3 Các môi trường dung dịch 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coli tái tổ hợp sốc nhiệt 20 2.2.2 Biểu protein tái tổ hợp SUMO_IL-11 hệ biểu E coli21 i 2.2.3 Khảo sát điều kiện biểu protein SUMO_IL-11 từ chủng E coli tái tổ hợp 22 2.2.3.1 Khảo sát điều kiện môi trường 22 2.2.3.2 Khảo sát điều kiện nồng độ chất cảm ứng 22 2.2.3.3 Khảo sát điều kiện nhiệt độ biểu 23 2.2.3.4 Khảo sát điều kiện pH môi trường 23 2.2.3.5 Khảo sát mật độ tế bào lúc cảm ứng 23 2.2.3.6 Khảo sát thời gian thu mẫu 23 2.2.4 Phương pháp siêu âm phá tế bào E coli tái tổ hợp 24 2.2.5 Điện di protein gel Polyacrylamide 24 2.2.6 Phương pháp lai Western blot 25 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Biểu protein SUMO_IL-11 E coli R2 27 3.2.Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men biểu SUMO_IL-11 30 3.2.1 Khảo sát thành phần môi trường lên men biểu SUMO_IL-11 30 3.2.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG 33 3.2.3 Khảo sát nhiệt độ đến biểu SUMO_IL-11 34 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường 37 3.2.5 Khảo thời điểm cảm ứng biểu SUMO_IL-11 39 3.2.6 Khảo sát thời gian thu mẫu lên men SUMO_IL-11 41 3.3 So sánh hiệu biểu SUMO_IL-11 trước sau tối ưu điều kiện biểu 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribo nucleic APS Amonium persulphate Amp Ampicillin Bp Base pair EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid E coli Escherichia coli TEMED N, N, N', N' - tetramethyl ethylendiamine dNTP 2' - deoxyribonucleoside - 5' triphosphate IL-11 Interleukin-11 IPTG Isopropyl 𝛽-D-1thiogalactopyranoside kDa Kilo Dalton SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis OD Optical density PBS Phosphate buffer saline iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số chủng E coli thường sử dụng để biểu protein ngoại lai đặc điểm chúng [23] Bảng 2.1: Thành phần gel điện di biến tính SDS-PAGE 19 Bảng 3.1: Mật độ tế bào chủng E coli biểu SUMO_IL-11 môi trường khác .32 Bảng 3.2: Mật độ tế bào chủng E coli biểu SUMO_IL-11 nồng độ IPTG khác 34 Bảng 3.3: Mật độ tế bào chủng E coli biểu SUMO_IL-11 nhiệt độ cảm ứng khác 37 Bảng 3.4: Mật độ tế bào chủng E coli tái tổ hợp biểu SUMO_IL-11 pH môi trường khác 38 Bảng 3.5: Mật độ tế bào thu thời điểm OD600 cảm ứng từ 0,4 – 4,0 40 Bảng 3.6: Mật độ tế bào thời điểm thu mẫu khác 42 Bảng 3.7: So sánh điều kiện kết biểu trước sau tối ưu 43 iv DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Mô cấu trúc không gian IL-11 Hình 1.2: Sơ đồ vector pE SUMOpro3 có chứa gen kháng Ampicllin 12 Hình 3.1: Phân tích SDS-PAGE biểu SUMO_IL-11 E coli Rosetta 28 Hình 3.2: Western blot phân tích biểu SUMO_IL-11 E coli Rosetta 28 Hình 3.3: Phân tích tính tan protein SUMO_IL-11 biểu chủng E coli tái tổ hợp 29 Hình 3.4: SDS-PAGE kiểm tra mức độ biểu SUMO_IL-11 môi trường khác 31 Hình 3.5: Kiểm tra mức độ biểu SUMO_IL-11 nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau: a) mẫu đưa giá trị OD = 10; b) mẫu điện di theo giá trị OD600 thực 33 Hình 3.6: Kiểm tra mức độ biểu SUMO_IL-11 nhiệt độ khác 35 Hình 3.7: Kiểm tra protein pha tan, không tan nhiệt độ khác 36 Hình 3.8: Kiểm tra mức độ biểu protein SUMO_IL-11 pH môi trường khác 38 Hình 3.9: Kiểm tra biểu protein SUMO_IL-11 cảm ứng mật độ tế bào (OD600) khác 40 Hình 3.10: Điện di protein mẫu biểu protein SUMO_IL-11 thời điểm từ đến qua đêm (20 giờ) 41 Hình 3.11: Kiểm tra biểu protein SUMO_IL-11 với điều kiện trước sau tối ưu 43 v MỞ ĐẦU Cùng với phát triển mạnh mẽ ngành công nghệ sinh học, ngành công nghiệp sinh phẩm với sản phẩm có nguồn gốc vi sinh vật sử dụng lĩnh vực y dược ngày trọng Số lượng loại protein tái tổ hợp tạo cho mục đích dược phẩm có tăng trưởng vượt bậc, cytokine tái tổ hợp dạng sinh phẩm quan trọng hệ miễn dịch Interleukin-11 (IL-11) người có chất protein biết tới cytokine tạo máu Nó yếu tố sinh tưởng tế bào nguồn u tương bào, tế bào tạo máu tạo máu tiềm năng, nguyên mẫu tiểu cầu, đại thực bào Với vai trò vậy, yếu tố tăng trưởng hữu ích việc hỗ trợ điều trị bệnh máu Trong năm gần đây, bệnh máu nói chung đặc biệt bệnh hệ thống tạo máu có xu hướng gia tăng mạnh mẽ Do đó, việc nghiên cứu vai trò khả ứng dụng yếu tố hỗ trợ điều trị bệnh ngày quan tâm IL-11 người tái tổ hợp (rhIL-11) số sản phẩm Interleukin (IL) quan Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ cấp phép cho sử dụng để điều trị người Tên thương mại cấp phép cho loại rhIL-11 NEUMEGA công ty Wyeth định cho mục đích cảm ứng sinh tiểu cầu để bảo vệ bệnh nhân trước sau hoá trị liệu Sinh phẩm cung cấp số hãng dược phẩm Pfizer, Biocompare, Millipore với giá trung bình khoảng 200 - 300 USD/10µμg Hiện nước ta chưa sản xuất IL-11 Các sản phẩm IL-11 phải nhập với chi phí đắt đỏ, khó khăn việc chi trả kinh phí nhiều đối tượng bệnh nhân Vì để chủ động nguồn nguyên liệu nước giảm giá thành sản phẩm IL-11, Viện Công nghệ sinh học nhà nước đầu tư cho chủ trì đề tài “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng y học (điều trị)” Trong nghiên cứu trước, Phòng Kỹ thuật di truyền tạo chủng E coli Rosetta tái tổ hợp biểu protein dung hợp SUMO_IL-11 Do đó, để tạo điều kiện thuận lợi cho bước nghiên cứu tiếp theo, phải khảo sát để tìm điều kiện biểu tối ưu protein dung hợp SUMO_IL-11 người tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E coli, tạo sở cho việc nghiên cứu sản xuất IL-11 tái tổ hợp hỗ trợ điều trị bệnh máu Từ lý trên, hướng dẫn thực nội dung cho khoá luận với tên đề tài tốt nghiệp "Nghiên cứu lựa chọn điều kiện biểu protein dung hợp SUMO_IL-11 chủng Escherichia coli" Đề tài thực Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Interleukin-11 1.1.1 Giới thiệu chung Với chất protein glycoprotein, Interleukin (IL) bốn nhóm cytokine (Interferron, IL, nhân tố hoại tử ung thư, nhân tố sinh trưởng) Tính đến thời điểm tại, số lượng IL phát lên tới 37 loại [1] Theo chức sinh học, IL xác định chất tác động bạch cầu, hoạt hóa lympho bào Nó sản phẩm dòng tế bào T hỗ trợ tiết đại thực bào hay tế bào khác hệ miễn dịch Các IL có vai trò trung gian việc liên kết với thụ thể đặc hiệu để điều khiển trình hoạt động tế bào, trình phân chia tế bào trình chết theo chương trình tế bào (apoptosis) Mỗi nhóm IL có vai trò khác hệ thống miễn dịch chúng tạo loại tế bào khác Ví dụ, IL-1 tác dụng hoạt hóa tế bào T, giúp tăng sinh trưởng thành tế bào B; IL-2 có tác dụng kích thích phát triển tế bào T, đồng kích thích tế bào B phát triển biệt hóa, tăng cường tế bào giết tự nhiên NK (natural killer) tế bào giết kích hoạt lymphokine LAK (Lymphokine-activated killer); IL-3 kích thích biệt hóa tế bào gốc tạo máu đa thành tế bào tiền thân dòng tủy kích thích phân chia tất tế bào thuộc dòng tủy; IL-4 có tác dụng tăng sinh biệt hóa lên nhiều loại tế bào T, B, đại thực bào, tế bào mast; IL-5 tác dụng hiệp đồng với IL-4 để sản xuất kháng thể IgE, kích thích sinh trưởng biệt hóa bạch cầu toan; IL-7 tăng cường tiết IL-2, kích thích tăng sinh tế bào B, IL-11 có tác dụng kích thích tủy xương tạo tiểu cầu, giúp cải thiện tình trạng giảm tiểu cầu trình hóa trị liệu [2][3] Trong thực tế, hầu hết loại IL phát tạo theo đường tái tổ hợp chúng sử dụng không việc điều trị bệnh mà sử dụng vào mục đích chẩn đoán nghiên cứu khác Hình 3.6 cho thấy băng protein SUMO_IL-11 đậm biểu 37℃ Nhiệt độ 37℃  thuận lợi cho việc biểu SUMO_IL-11 là nhiệt độ thích hợp để enzyme xúc tác cho trình sinh tổng hợp protein mạnh [42] Càng hạ thấp nhiệt độ băng protein bé nhạt hơn, nhiệt độ 20℃ 25℃ băng protein bé nhạt màu Như nhiệt độ thấp khả biểu SUMO_IL-11 Băng protein bé nhiệt độ tăng lên 40℃ Các mẫu kiểm tra trạng thái tan hay không tan, kết thể hình 3.7 Có thể thấy protein SUMO_IL-11 nằm pha tan tất điểm nhiệt độ khảo sát Pha cặn băng protein mảnh, hạn chế siêu âm không phá 100% tế bào mẫu 20oC 25oC 30oC 37oC 40oC TS T C TS T C TS T C TS T C TS T C     Hình  3.7:  Kiểm  tra  protein  ở  pha  tan,  không  tan  ở  các  nhiệt  độ  khác  nhau   20  -­  40:  Các  mẫu  cảm  ứng  ở  nhiệt  độ  từ  20oC  đến  40oC;;  M:  Thang  protein  chuẩn;;   TS:  Protein  tổng  số;;  T:  Pha  tan;;  C:  Pha  không  tan   Mật độ tế bào lúc thu mẫu tiêu để đánh giá lượng protein SUMO_IL-11 tổng hợp đơn vị thể tích nuôi cấy Kết đo mật độ tế bào chủng E coli tái tổ hợp sau cảm ứng từ bảng 3.3 cho thấy mật độ tế bào tăng dần nhiệt độ biểu tăng dần Mật độ tế bào thấp nhiệt độ 20℃ (OD600 = 2,43) có giá trị tương đương khoảng 36 nhiệt độ từ 25℃  đến 37℃ (OD600 dao động từ 5,33 đến 5,73) Khi tăng nhiệt độ lên 40℃  thì sinh khối tế bào giảm nhẹ Bảng  3.3:  Mật  độ  tế  bào  chủng  E  coli  biểu  hiện  SUMO_IL-­11  ở  các  nhiệt  độ   cảm  ứng  khác  nhau   Nhiệt độ cảm ứng 20℃ 25℃ 30℃ 37℃ 40℃ 2,43 5,73 5,08 5,33 4,12 OD600 thu mẫu Như vậy, vào độ đậm băng protein, mật độ tế bào thu mẫu protein pha tan nhiệt độ nghiên cứu, định lựa chọn nhiệt độ 37℃ nhiệt độ biểu để nghiên cứu tiếp ảnh hưởng pH môi trường, thời gian thu mẫu, mật độ tế bào lúc cảm ứng lên tổng hợp protein SUMO_IL-11 tế bào E coli tái tổ hợp 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường Nồng độ ion H+ môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến hoạt động vi khuẩn chúng có khả làm thay đổi diện tích chất vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu chất dinh dưỡng Mỗi vi sinh vật vật hoạt động tốt pH định Hầu hết vi khuẩn sinh trưởng tốt xung quanh giá trị pH trung tinh (6,5-7,0) số lại phát triển mạnh điều kiện acid Do cần tìm pH thích hợp cho sinh vật sinh trưởng sản xuất protein tái tổ hợp Sau tìm điều kiện biểu protein SUMO_IL-11 thích hợp môi trường TB, nhiệt độ cảm ứng 37℃, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,05 mM, tiếp tục tiến hành cảm ứng biểu pH môi trường khác (5; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0) Mật độ tế bào tăng dần theo chiều tăng pH môi trường (Bảng 3.4) Trong mật độ tế bào khoảng pH trung tính (từ - 8) cao không chênh nhiều, mật độ tế bào môi trường pH acid (pH - 5,5) thấp Như vậy, môi trường có pH trung tính thuận lợi cho tế bào E coli sinh trưởng phát triển 37 Bảng  3.4:  Mật  độ  tế  bào  chủng  E  coli  tái  tổ  hợp  biểu  hiện  SUMO_IL-­11  ở  các   pH  môi  trường  khác  nhau   pH môi trường 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 OD600 thu mẫu 1,87 4,42 5,13 4,91 5,94 5,79 5,89 Ngoài protein tổng số biểu môi trường có điểm pH khác khác (Hình 3.8) 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 M kDa 117,0 85 49 SUMO_IL-11 34 25 15 10   Hình  3.8:  Kiểm  tra  mức  độ  biểu  hiện  của  protein  SUMO_IL-­11  ở  các  pH  môi   trường  khác  nhau    -­  8,0:  Protein  tổng  số  ở  các  pH  5  -­  8,0;;  M:  Thang  protein  chuẩn   Hình 3.8 cho thấy môi trường có pH acid, lượng protein biểu thấp, băng SUMO_IL-11 mảnh, mờ nhạt Nguyên nhân pH môi trường thấp ảnh hưởng đến hoạt động sống tế bào hoạt động sinh tổng hợp protein, làm cho tế bào sinh trưởng chậm lại Theo Chen cộng sự, việc trì pH môi trường điều kiện quan trọng tế bào chứa gen kháng ampicillin biểu nhiệt độ cao Lý phân huỷ ampicillin làm cho pH môi trường giảm xuống trở nên axit trình nuôi cấy, bất lợi cho sinh trưởng vi khuẩn Hơn nữa, môi trường có pH thấp gây ảnh hưởng đến tế bào vi khuẩn, kết xuất 38 đào thải plasmid mật độ tế bào cao [29] Các mẫu nuôi môi trường có pH cao (6,5 - 8), lượng protein SUMO_IL-11 biểu nhiều so với mẫu pH thấp Tuy nhiên từ điện di đồ ta quan sát thấy môi trường trung tính (pH = 7) băng protein đậm rõ ràng Điều lý giải môi trường pH trung tính môi trường thuận lợi cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển, khả sinh tổng hợp protein điều kiện tốt Như vậy, pH = khoảng pH thích hợp cho tế bào E coli tái tổ hợp biểu SUMO_IL-11 3.2.5 Khảo thời điểm cảm ứng biểu SUMO_IL-11 Mật độ tế bào lúc cảm ứng sinh tổng hợp protein ngoại lai đóng vai trò quan trọng để thu lượng protein tái tổ hợp cao Cảm ứng biểu khuyến cáo thời điểm tới muộn pha log (mid-to-late log phase) để đảm bảo hiệu suất tối đa đồng thời tránh đề liên quan đến tế bào vào pha cân (như cảm ứng sinh protease) Vi khuẩn E coli điển hình thường cảm ứng mật độ tế bào (OD600) từ 0,4 đến 0,6 Đây giai đoạn tế bào bắt đầu phát triển theo cấp số nhân Tuy nhiên tuỳ gen biểu chủng chủ mà cảm ứng mật độ tế bào khác Sau tìm điều kiện nhiệt độ, môi trường, pH, nồng độ chất cảm ứng thích hợp cho việc biểu protein SUMO_IL-11, tiếp tục khảo sát điều kiện cảm ứng số giá trị mật độ tế bào khác để kiểm trả ảnh hưởng tới mức độ biểu SUMO_IL-11 Tế bào E coli tái tổ hợp nuôi qua đêm chuyển sang môi trường TB có pH 6,8 - 7,0 cho OD600 = 0,1 Tế bào tiếp tục nuôi lắc 37℃, tới OD600 đạt giá trị 0,4; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 hút mẫu chuyển sang bình nuôi cấy cảm ứng với nồng độ 0,05 mM IPTG nhiệt độ 37℃, lắc Tế bào thu lại sau cảm ứng, mật độ tế bào xác định bảng 3.5 39 Bảng  3.5:  Mật  độ  tế  bào  thu  được  ở  các  thời  điểm  OD600  cảm  ứng  từ  0,4  –  4,0   OD600 cảm ứng 0,4 0,8 1,0 1,5 6,11 6,94 7,30 9,33 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 9,12 8,48 7,24 OD600 thu mẫu 15,28 11,60 0,4 0,8 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 M kDa 117 85 49 SUMO_IL-11 34 25 15 10 Hình  3.9:  Kiểm  tra  biểu  hiện  protein  SUMO_IL-­11    được  cảm  ứng  ở  các  mật   độ  tế  bào  (OD600)  khác  nhau   0,4  -­  4,0:  Mẫu  cảm  ứng  ở  các  thời  điểm  mật  độ  tế  bào  từ  0,4  đến  4,0;;     M:  Thang  protein  chuẩn   Mẫu cảm ứng OD600 = có băng protein đậm cả, OD thu mẫu lại đạt 9,12 Trong mẫu cảm ứng OD600 = 2,0 băng protein đậm sắc nét, OD thu mẫu đạt giá trị cao 15,28 Cảm ứng mật độ tế bào cao thời điểm tế bào dần bước vào pha cân nên sức sống giảm, bắt đầu có tế bào chết, ảnh hưởng đến mức độ tổng hợp protein đích sinh khối tế bào Kết hợp độ đậm băng protein SUMO_IL-11 tạo với mật độ tế bào thu mẫu, protein tái tổ hợp biểu tốt mẫu cảm ứng OD600 = 2,0 Vì vậy, lựa chọn OD600 = 2,0 thời điểm cảm ứng thích hợp cho tế bào sinh tổng hợp protein SUMO_IL-11 số dải OD cảm ứng khảo sát   40 3.2.6 Khảo sát thời gian thu mẫu lên men SUMO_IL-11   Quá trình cảm ứng sinh tổng hợp protein bắt đầu chủng chủ cảm ứng IPTG Mức độ tích lũy sản phẩm theo lý thuyết tăng dần theo thời gian Tuy nhiên, tế bào sinh trưởng đến nồng độ định dừng lại Thời gian lên men kéo dài ảnh hưởng đến lượng sản phẩm tạo thành nhiều tế bào già bị chết protein đích bị phân cắt protease vật chủ, tế bào sản sinh sản phẩm phụ không mong muốn, chi phí lên men tốn Do việc tìm thời điểm thích hợp để thu protein cần thiết để thu lượng protein tái tổ hợp tối đa kDa 117,0 85 SUMO_IL-11 49 34   25 15 Hình  3.10:  Điện  di  protein  mẫu  biểu  hiện  SUMO_IL-­11  ở  các  thời  điểm  từ  1   đến  8  giờ  và  qua  đêm  (20  giờ)    giờ  -­  20  giờ:  Mẫu  thu  ở  các  thời  điểm  từ  1  -­  20  giờ  sau  cảm  ứng  IPTG;;     M:  Thang  protein  chuẩn   Kết điện di cho thấy thời gian cảm ứng dài lượng protein tái tổ hợp nhiều Protein dung hợp SUMO_IL-11 chưa tổng hợp cảm ứng IPTG khoảng đầu bắt đầu tích luỹ sau cảm ứng Từ cảm ứng trở đi, băng protein đậm ngang tất mẫu Từ đây, phải vào giá trị OD600 lúc thu mẫu để đánh giá lượng protein tái tổ hợp tạo Khi băng protein đậm ngang mẫu 41 có mật độ tế bào cao, hiệu thuprotein tái tổ hợp nhiều Bảng 3.6 cho thấy mật độ tế bào thu mẫu theo thời gian tăng dần với thời điểm thu mẫu cao lúc (OD600 = 23,2) sau giảm kéo dài thời gian lên men Nguyên nhân lúc mật độ tế bào cao, đồng nghĩa với chất dinh dưỡng nguồn oxy cạn dần, tế bào chết dần theo thời gian, kết mật độ tế bào giảm dần Bảng  3.6:  Mật  độ  tế  bào  ở  các  thời  điểm  thu  mẫu  khác  nhau   Thời gian thu mẫu (h) 2,34 4,39 20 OD600 thu mẫu 11,13 13,43 14,47 16,96 23,20 19,40 17,60 Thời gian thu mẫu thích hợp thời điểm mà mức độ protein tái tổ hợp tích luỹ nhiều, song song mật độ tế bào cao suất protein đích đạt tối đa Mức độ biểu protein mẫu thu lúc đậm gần tương đương mật độ tế bào mẫu thu thấp mẫu thu Do đó, thời gian thu mẫu thích hợp tính từ thời điểm cảm ứng IPTG 3.3 So sánh hiệu biểu SUMO_IL-11 trước sau tối ưu điều kiện biểu Sau nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện lên men đến tổng hợp protein tái tổ hợp SUMO_IL-11, xác định thông số tối ưu Kết thu cho thấy protein SUMO_IL-11 biểu tốt điều kiện lên men: môi trường TB, pH 7,0, cảm ứng biểu với IPTG 0,05 mM 37℃ OD600 = 2, thu mẫu sau cảm ứng Để kiểm định lại toàn kết này, tiến hành lên men đồng thời hai mẫu với điều kiện trước sau tối ưu để so sánh khả tổng hợp protein tái tổ hợp (Bảng 3.7) Cả mẫu đo OD600 kiểm tra mật độ tế bào lúc thu mẫu điện di kiểm tra biểu protein 42 Bảng  3.7:  So  sánh  các  điều  kiện  và  kết  quả  biểu  hiện  trước  và  sau  khi  tối  ưu   Điều kiện Trước tối ưu Sau tối ưu Môi trường, pH LB, pH 6,85 TB, pH 7,0 30oC 37oC Nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM 0,05 mM OD cảm ứng 0,4-0,6 2,0 Thời gian cảm ứng tiếng tiếng 1,7 19,48 Nhiệt độ biểu OD600 kDa M 177 85 49 SUMO_IL-11 34 25 15 10 Hình  3.11:  Kiểm  tra  biểu  hiện  protein  SUMO_IL-­11  với  các  điều  kiện  trước  và   sau  tối  ưu   1:  Mẫu  biểu  hiện  ở  điều  kiện  trước  tối  ưu;;  2:  Mẫu  biểu  hiện  ở  điều  kiện  sau  tối  ưu;;   M:  Thang  protein  chuẩn   Kết điện di SDS-PAGE hình 3.11 cho thấy băng protein SUMO_IL-11 mẫu sau tối ưu đậm nét so với mẫu trước tối ưu Xem xét thông số mật độ tế bào lúc thu mẫu có thay đổi rõ rệt, tăng từ giá trị 1,7 lên 19,48 lên men với điều kiện tối ưu, tức tăng khoảng 11,4 lần 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết đạt đề tài "Nghiên cứu lựa chọn điều kiện biểu protein dung hợp SUMO_IL-11 chủng Escherichia coli" có số kết luận sau: - Đã biểu thành công SUMO_IL-11 tái tổ hợp dạng tan chủng Escherichia coli Rosetta - Đã lựa chọn số điều kiện phù hợp cho biểu protein SUMO_IL-11 chủng E coli R2 tái tổ hợp quy mô bình tam giác Đó là: môi trường TB (pH 6,8 - 7,0); nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,05 mM; thời điểm cảm ứng OD600 = 2,0; nhiệt độ biểu 37℃, thu mẫu sau cảm ứng - Với điều kiện lên men lựa chọn sinh khối tế bào tăng gấp 11,4 lần lượng protein dung hợp SUMO_IL-11 tăng lên đáng kể KIẾN NGHỊ Để tiếp tục hướng nghiên cứu trên, có số kiến nghị sau: - Nghiên cứu nâng cao hiệu suất biểu protein tái tổ hợp SUMO_IL11 sinh khối tế bào quy mô bình lên men lít - Nghiên cứu phương pháp tách chiết thu hồi protein tái tổ hợp SUMO_IL-11 từ tế bào E coli 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Thanh Đạm (2004) Miễn dịch điều trị bệnh ung thư Nhà xuất y học Tài liệu tiếng Anh [1] M F Nold, C A Nold-Petry, J A Zepp, B E Palmer, P Bufler, C A Dinarello, (2010) “IL-37 is a fundamental inhibitor of innate immunity”, Nat Immunol., vol 11, số p.h 11, tr 1014–1022 [2] M Kotb T Calandra, (2003) Cytokines and Chemokines in Infectious Diseases Handbook Springer Science & Business Media [3] K A Fitzgerald, (2001) The Cytokine Factsbook Academic Press [4] G K Antony A Z Dudek, (2010) “Interleukin in cancer therapy”, Curr Med Chem., vol 17, số p.h 29, tr 3297–3302 [5] S L Pett, A D Kelleher, S Emery, (2010) “Role of interleukin-2 in patients with HIV infection”, Drugs, vol 70, số p.h 9, tr 1115–1130 [6] A Leone, L J Picker, D L Sodora, (2009) “IL-2, IL-7 and IL-15 as immuno-modulators during SIV/HIV vaccination and treatment”, Curr HIV Res., vol 7, số p.h 1, tr 83–90 [7] S R Paul, F Bennett, J A Calvetti, K Kelleher, C R Wood, R M O’Hara, A C Leary, B Sibley, S C Clark, D A Williams, (1990) “Molecular cloning of a cDNA encoding interleukin 11, a stromal cellderived lymphopoietic and hematopoietic cytokine.”, Proc Natl Acad Sci., vol 87, số p.h 19, tr 7512–7516 [8] D McKinley, Q Wu, T Yang-Feng, Y C Yang, (1992) “Genomic sequence and chromosomal location of human interleukin-11 gene (IL11)”, Genomics, vol 13, số p.h 3, tr 814–819 45 [9] N A Sims, B J Jenkins, A Nakamura, J M W Quinn, R Li, M T Gillespie, M Ernst, L Robb, T J Martin (2005) “Interleukin-11 receptor signaling is required for normal bone remodeling”, J Bone Miner Res Off J Am Soc Bone Miner Res., vol 20, số p.h 7, tr 1093–1102 [10] J C Morris, S Neben, F Bennett, H Finnerty, A Long, D R Beier, S Kovacic, J M McCoy, E DiBlasio-Smith, E R La Vallie, A Caruso, J Calvetti, G Morris, N Weich, S R Paul, P S Crosier, K J Turner, C R Wood (1996) “Molecular cloning and characterization of murine interleukin11”, Exp Hematol., vol 24, số p.h 12, tr 1369–1376 [11] X Du D A Williams (1991) “Interleukin-11: Review of Molecular, Cell Biology, and Clinical Use”, Blood, vol 89, số p.h 11, tr 3897–3908, tháng 1997 [12] H Baumann P Schendel, “Interleukin-11 regulates the hepatic expression of the same plasma protein genes as interleukin-6”, J Biol Chem., vol 266, số p.h 30, tr 20424–20427 [13] M Ellis, U Hedstrom, C Frampton, H Alizadeh, J Kristensen, F V Shammas, B K al-Ramadi (2006) “Modulation of the systemic inflammatory response by recombinant human interleukin-11: a prospective randomized placebo controlled clinical study in patients with hematological malignancy”, Clin Immunol Orlando Fla, vol 120, số p.h 2, tr 129–137 [14] S X Leng J A Elias, “Interleukin-11 inhibits macrophage interleukin-12 production”, J Immunol Baltim Md 1950, vol 159, số p.h 5, tr 2161–2168, tháng 1997 [15] J A Kaye, (1998) “FDA licensure of NEUMEGA to prevent severe chemotherapy-induced thrombocytopenia”, Stem Cells Dayt Ohio, vol 16 Suppl 2, tr 207–223 46 [16] M Bhatia, V Davenport, M S Cairo, (2007) “The role of interleukin-11 to prevent chemotherapy-induced thrombocytopenia in patients with solid tumors, lymphoma, acute myeloid leukemia and bone marrow failure syndromes”, Leuk Lymphoma, vol 48, số p.h 1, tr 9–15 [17] X.-J Xu, X.-M Niu, Z.-W Guo, H.-Q He, D.-F Qiu, C Liu, S.-H Lin, K Song, Z.-J Ren, W.-C Li, G.-N Huang, Q.-F Liu, (2010) “[Effects of recombinant human interleukin 11 on hematological malignancy after allogeneic hematopoietic cell transplantation]”, Zhonghua Yi Xue Za Zhi, vol 91, số p.h 2, tr 100–102 [18] Q.-R Zhang, (2004) “[Progress on research and clinical application of interleukin-11 in treatment of leukemia review]”, Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi Zhongguo Bing Li Sheng Li Xue Hui J Exp Hematol Chin Assoc Pathophysiol., vol 12, số p.h 5, tr 718–720 [19] M C Galmiche, C A Vogel, A B Delaloye, P M Schmidt, F Healy, J P Mach, F Buchegger, (1996) “Combined effects of interleukin-3 and interleukin-11 on hematopoiesis in irradiated mice”, Exp Hematol., vol 24, số p.h 11, tr 1298–1306 [20] N S Weich, M Fitzgerald, A Wang, J Calvetti, J Yetz-Aldape, S Neben, K J Turner, (2000) “Recombinant human interleukin-11 synergizes with steel factor and interleukin-3 to promote directly the early stages of murine megakaryocyte development in vitro”, Blood, vol 95, số p.h 2, tr 503–509 [21] Y Yonemura, M Kawakita, T Masuda, K Fujimoto, K Kato, K Takatsuki, (1992) “Synergistic effects of interleukin and interleukin 11 on murine megakaryopoiesis in serum-free culture”, Exp Hematol., vol 20, số p.h 8, tr 1011–1016 47 [22] F R Blattner, G Plunkett, C A Bloch, N T Perna, V Burland, M Riley, J Collado-Vides, J D Glasner, C K Rode, G F Mayhew, J Gregor, N W Davis, H A Kirkpatrick, M A Goeden, D J Rose, B Mau, Y Shao, (1997) “The complete genome sequence of Escherichia coli K-12”, Science, vol 277, số p.h 5331, tr 1453–1462 [23] K Terpe, (2006) “Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems”, Appl Microbiol Biotechnol., vol 72, số p.h 2, tr 211–222 [24] J Yin, G Li, X Ren, G Herrler, (2007) “Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes”, J Biotechnol., vol 127, số p.h 3, tr 335–347 [25] S C Makrides, (1996) “Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli.”, Microbiol Rev., vol 60, số p.h 3, tr 512–538 [26] F W Studier B A Moffatt, (1986) “Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes”, J Mol Biol., vol 189, số p.h 1, tr 113–130 [27] “Chương 7: Biểu gen tái tổ hợp Escherichia coli - Tài liệu text” http://text.123doc.org/document/707114-chuong-7-bieu-hien-gen-tai-tohop-trong-escherichia-coli.htm [Truy cập: 29/4/2016] [28] S Sahdev, S K Khattar, K S Saini, (2008) “Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies”, Mol Cell Biochem., vol 307, số p.h 1–2, tr 249–264 [29] H C Chen, C F Hwang, D G Mou, (1992) “High-density Escherichia coli cultivation process for hyperexpression of recombinant 48 porcine growth hormone”, Enzyme Microb Technol., vol 14, số p.h 4, tr 321– 326 [30] A Sivashanmugam, V Murray, C Cui, Y Zhang, J Wang, Q Li, (2009) “Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli”, Protein Sci Publ Protein Soc., vol 18, số p.h 5, tr 936–948 [31] Lee S.J., Lee S.Y (2002) "Efficient high-level production of spider silk protein by fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli and its purification", Theories and Applications of Chem Eng vol 8, tr 246–359 [32] L Bi, X Lei, J Zhu, (1998) “High-level expression of human immunodeficiency virus type gp120 protein in E coli”, Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Xue Za Zhi Zhonghua Shiyan He Linchuang Bingduxue Zazhi Chin J Exp Clin Virol., vol 12, số p.h 2, tr 136–138 [33] A Piserchio, R Ghose, D Cowburn, (2009) “Optimized bacterial expression and purification of the c-Src catalytic domain for solution NMR studies”, J Biomol NMR, vol 44, số p.h 2, tr 87–93 [34] F Volontè, F Marinelli, L Gastaldo, S Sacchi, M S Pilone, L Pollegioni, G Molla, (2008) “Optimization of glutaryl-7aminocephalosporanic acid acylase expression in E coli”, Protein Expr Purif., vol 61, số p.h 2, tr 131–137 [35] J Pinsach, C de Mas, J López-Santín, G Striedner, K Bayer, (2008) “Influence of process temperature on recombinant enzyme activity in Escherichia coli fed-batch cultures”, Enzyme Microb Technol., vol 43, số p.h 7, tr 507–512 [36] Z Xu, Z Zhong, L Huang, L Peng, F Wang, P Cen, (2006) “High-level production of bioactive human beta-defensin-4 in Escherichia 49 coli by soluble fusion expression”, Appl Microbiol Biotechnol., vol 72, số p.h 3, tr 471–479 [37] T Juhász, E Székely, B Simándi, Zs Szengyel, and K Réczey (2003) “Recovery of a Recombinant Thermostable Endoglucanase from E Coli Using Supercritical Carbon Dioxide Cell Disruption ” Chem Biochem Eng., Q.17 số p.h 2, tr 131–134 [38] M B Margetts, I G Barr, E A Webb, (2000) “Overexpression, purification, and refolding of a Porphyromonas gingivalis cysteine protease from Escherichia coli”, Protein Expr Purif., vol 18, số p.h 3, tr 262–268 [39] Sambrook Russell, (2001) Moleculae Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory [40] C S Shin, M S Hong, C S Bae, J Lee, (1997) “Enhanced production of human mini-proinsulin in fed-batch cultures at high cell density of Escherichia coli BL21(DE3)[pET-3aT2M2]”, Biotechnol Prog., vol 13, số p.h 3, tr 249–257 [41] F Baneyx, (1999) “Recombinant protein expression in Escherichia coli”, Curr Opin Biotechnol., vol 10, số p.h 5, tr 411–421 [42] P E Vaillancourt, (2003) E Coli Gene Expression Protocols Springer Science & Business Media 50