II SẮC KÝ CỘT KHÁI NIỆM: Sắc kí cột phương pháp dùng để tách chất (cấu tử) khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực chất II SẮC KÝ CỘT NGUYÊN TẮC:  Sắc ký phương pháp vật lý để tách riêng thành phần hỗn hợp cách phân chia chúng thành pha: pha động pha tĩnh  Sắc ký hấp phụ thực ống thủy tinh thẳng đứng gọi “cột” với chất hấp phụ đóng trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ II SẮC KÝ CỘT NGUYÊN TẮC:  Đối với chất riêng biệt hỗn hợp tùy theo khả hấp phụ khả hòa tan dung môi rửa cột để lấy trước sau  Chất hấp phụ sắc ký cột thường dùng oxid nhôm, silicagel,CaCO3, than hoạt tính, polyamid,… chất phải tiêu chuẩn hóa  Dung môi dùng 1, loại dung môi có tỉ lệ thích hợp II SẮC KÝ CỘT NGUYÊN TẮC:  Với chất hấp phụ cổ điển dung môi sử dụng có độ phân cựa tăng dần  Cột ống làm thủy tinh, đầu có khóa, đầu có mút mài để nối với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ  Việc lựa chọn kích thước cột quan trọng Thông thường cột có đường kính nhỏ chiều dài dài tách tốt II SẮC KÝ CỘT ĐIỀU KIỆN: • Sắc ký cột tiến hành điều kiện áp suất khí • Pha tĩnh hạt có kích thước tương đối lớn (50-150um), nạp cột thủy tinh II SẮC KÝ CỘT ĐIỀU KIỆN: • Mẫu chất cần phân tích đặt đầu cột, phía pha tĩnh (có lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đặt phía cao • Dung môi giải ly khỏi cột phần bên cột hứng vào lọ nhỏ đặt ống dẫn cột II SẮC KÝ CỘT ƯU – NHƯỢC ĐIỂM:  Ưu điểm:  Sắc ký cột có ưu điểm pha tĩnh dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm  Có thể triển khai với lượng mẫu tương đối lớn  Nhược điểm: Tuy vậy, phương pháp thường làm cho trình tách bị chậm, hiệu thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC) II SẮC KÝ CỘT CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: Lựa chọn chất hấp thu Lựa chọn dung môi Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột Nạp mẫu II SẮC KÝ CỘT CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (1) Lựa chọn chất hấp thu: Pha tĩnh silicagel loại thường, hợp chất không phân cực giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực giải ly sau Với phân tử không phân cực, phân tử có trọng luợng phân tử lớn có tính phân cực mạnh phân tử kia, bị pha tĩnh giữ lại cột nên di chuyển khỏi cột chậm so với phân tử nhỏ, có nóở lại lâu cột so với phân tử có tính phân cực II SẮC KÝ CỘT •4  CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (2) Lựa chọn dung môi: Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn dung môi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi dung dịch mẫu (A) Chuẩn bị 4-6 mỏng 2,5x10cm Chấm lên tấm khoảng 2-5l dd(A) Mỗi mỏng triển khai với loại dung môi giải ly khác nhau, kế phát đèn UV hay thuốc thử II SẮC KÝ CỘT CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (2) Lựa chọn dung môi: Với đơn dung môi dễ dàng thấy dung môi phù hợp Từ kết đó, cố gắng tìm hỗn hợp dung môi, dung môi phân cực dung môi phân cực thí dụ ete dầu hỏa: etyl acetate II SẮC KÝ CỘT CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng giá, cho dung môi loại phân cực vào khoảng 2/3 chiều cao cột Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng cột, đặn, lần lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột II SẮC KÝ CỘT CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (3) Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: Khi lớp chất hấp thu đạt chiều cao khoảng 2cm cột, mở nhẹ khoá bên để cột dung môi chảy ra, hứng vào becher trống để bên cột, dung môi dẽ rót lại lên đầu cột Sau nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến chất hấp thu cột đồng II SẮC KÝ CỘT CÁC BƯỚC THỰC HIỆN: (4) Nạp mẫu: Mẫu dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký Nếu mẫu dạng rắn hoà tan mẫu chất vào lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởi đầu sắc ký II SẮC KÝ CỘT THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT: Gồm bước sau: • Bước 1: Mở khoá cho dung môi chảy khỏi cột để hạ mức dung môi cột xuống cho vừa sát với mặ thoáng chất hấp thu cột • Bước 2: Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột Muốn nạp mẫu, sử dụng pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất hấp thu cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy theo thành cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu II SẮC KÝ CỘT THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT: • Bước 3: Mở khoá bên cho dung môi chảy khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu thấm hết vào chất hấp thu đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô • Bước 4: Dùng pipet cho luợng nhỏ dung môi lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi để rửa ống mà dung dịch dính thành cột II SẮC KÝ CỘT THỰC HIỆN NẠP MẪU LÊN CỘT: • Bước 5: Mở khoá cho dung môi chảy Lặp laị vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp thu, dung môi suốt không lây màu chất mẫu • Bước 6: Sử dụng thủy tinh, gòn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo vệ mặt cột • Bước 7: Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành giải ly cột II SẮC KÝ CỘT