Khoá luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu khoa học công việc cần thiết hệ trẻ, đặc biệt với sinh viên Để đạt mục đích hoàn thành nội dung đề tài tự thân sinh viên thực hiện, mà cần có tạo điều kiện nhà trường, khoa hướng dẫn tận tình thầy, cô giáo Bằng lòng thành kính em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thạc sỹ Nguyễn Khắc Thanh, TS Đinh Thị Kim Nhung tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành khoá luận Qua em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy, cô môn vi sinh thầy cô Khoa Sinh - KTNN bảo em tận tình trình học tập nghiên cứu Em mong cổ vũ ý kiến đóng góp để khoá luận hoàn thiện Hà nội ngày 22 tháng năm 2005 Sinh viên: Phạm Thị Hải K27 A- Sinh KTNN Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN Khoá luận tốt nghiệp PHẦN ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1.Lí chọn đề tài Người ta biết làm rượu vang từ 3000 năm trước công nguyên Đến thời Trung cổ, nhu cầu rượu vang 150 l/đầu người/năm[2] Hàng năm giới sản xuất khoảng 18 tỷ lít rượu vang Trong 1/3 Pháp Angiêri[14] Đa số rượu vang (Wine, win ) giới sản xuất từ nho, từ “rượu vang” gần đồng nghĩa với “rượu nho” [2] Theo thời gian kỹ thuật sản xuất rượu vang ngày phong phú hoàn thiện Mỗi nước khác có phương thức sản xuất khác hàng trăm loại rượu vang đời (độ rượu 9% - 14% ): Chianti, chablis, rượu Rhine, Granache rose, Burskendy, sautesne, Zinfandet,[2] Thực chất rượu vang bắt nguồn từ biến đổi tự nhiên loại hoa có đường, hệ enzim có loại vi sinh vật nấm men Sacharomyces mà chủ yếu loài: Sacharomyces cerevisiae, có phụ phẩm khác: chất thơm, tanin, axít hữu cơ, vitamin, chất khoáng, muối este Do đó, rượu vang đặc điểm bật gây say êm dịu mà có giá trị dinh dưỡng cao, kích thích tiêu hoá, thần kinh, tim mạch Việt Nam nước nhiệt đới khí hậu nóng ẩm, hoa nhiều số lượng, phong phú chủng loại, thuận lợi cho sản xuất rượu vang từ nguồn nguyên liệu khác như: Dâu, dứa, vải, táo, chuối, mơ phổ biến vang vải vang vải sản xuất số nước như: Florida (Mỹ ), Trung Quốc [12, 17] Bên cạnh đó, vải giá thành thấp lại đa dạng, phong phú Tổng số diện tích trồng khoảng 28.000 ha, sản lượng cho thu hoạch khoảng 36.000 tấn/ năm Nơi có diện tích trồng thu hoạch nhiều Lục Ngạn (Bắc Giang ) Thanh Hà (Hưng Yên ) [12, 17] Quả vải dùng chủ yếu để ăn (chiếm khoảng 30% 35% sản lượng cho thu hoạch, số lại buộc phải sấy khô bán thẩm lậu qua biên giới Việt – Trung Việc chế biến vải thiều dạng nước giải khát đóng hộp đáp ứng phần nhỏ sản lượng thu hoạch hàng năm sản phẩm khó thị trường chấp nhận [12, 17] Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN Khoá luận tốt nghiệp Ngành sản xuất rượu vang Việt Nam thực phát triển từ năm 80 kỷ XX đánh dấu xuất vang Thăng Long, sau số sở sản xuất khác lên: vang Gia Lâm, vang Thanh Ba, vang Đà Lạt, lại thiếu nguồn nguyên liệu Do theo chúng tôi, việc nghiên cứu sử dụng vải thiều để sản xuất rượu vang cần thiết phù hợp với thực tiễn Việt Nam Chúng tiến hành lựa chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường NaCl qúa trình lên men vang vải thiều (Litchi chinensis sonn )” 1.2 Mục đích nghiên cứu - Từ nguồn nguyên liệu vài thiều phân lập tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men vang vải thiều - Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường, KH2PO4, NaCl, pH, men giống nhiệt độ để lựa chọn mức thích hợp cuả nhân tố tới trình lên men vang vải thiều với quy mô phòng thí nghiệm - Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang từ vải thiều 1.3 Nhiệm vụ Giúp sinh viên biết phương pháp sản xuất rượu vang Việt Nam tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có 1.4 Ý nghĩa lý luận ý nghĩa thực tiễn đề tài Nghiên cứu nhằm sâu tìm hiểu đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hoá chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 C13 có khả lên men vang vải thiều Từ tìm hiểu trình sản xuất vang vải thiều quy mô phòng thí nghiệm để ứng dụng sản xuất vang gia đình tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có Việt Nam Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN Khoá luận tốt nghiệp PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chung rƣợu vang 2.1.1 Các loại rượu vang Rượu vang loại nước thơm ngon giàu chất bổ dưỡng với độ cồn nhẹ hương thơm trái giữ lại rượu [1] Rượu vang theo nghĩa rượu lên men từ nước ép nho (không chưng cất ) Gần đây, người ta mở rộng khái niệm rượu vang để loại rượu lên men từ loại hoa khác như: mơ, dứa, táo, vải, xoài, nhãn Sự đa dạng loại rượu vang kết biến đổi sinh hoá lên men Trong rượu vang người ta chia thành hai loại chính: Rượu vang không gaz rượu vang có gaz Trong hai loại rượu vang lại chia thành nhiều loại theo màu sắc, theo hàm lượng đường có rượu theo độ cồn Theo màu sắc có vang trắng, vang đỏ (màu đỏ Bordaux) Theo hàm lượng đường có rượu vang có vang chát hay vang khô (ít đường ) vang (nhiều đường ), vang nửa khô[13] Vang khô thường uống bữa ăn, vừa ăn, vừa uống Vang dùng sau bữa ăn, vang nửa khô (vang Vermouth ) có mùi thơm (chứa 21% độ rượu ) dùng để khai vị Champagne loại rượu vang có qúa trình lên men phụ sinh CO2, nên uống thường có bọt dùng nhiều đại tiệc, phụ nữ thường ưa thích loại vang này[2] 2.1.2 Nguyên liệu sản xuất rượu vang Việt Nam nước nhiệt đới gió mùa không thuận lợi cho nho phát triển, lại xứ sở nhiều loại hoa thơm, bốn mùa Tất loại chứa đường, prôtêin, muối khoáng không chứa chất độc hại với nấm men chế biến lên men rượu vang Như vậy, nguồn nguyên liệu sản xuất rượu vang chủ yếu loại trồng (mận, mơ, táo, dâu, dứa, chuối, vải, nhãn) Nói chung thành phần hoá học có ảnh hưởng lớn đến chất lượng rượu vang Điều kiện khí hậu, đất đai, nông hoá thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác ảnh hưởng lớn đến chất lượng rượu vang, chúng ảnh hưởng tới có mặt hợp chất hữu có mặt Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN Khoá luận tốt nghiệp Bảng Thành phần hoá học loại [7, 16] Tên Thành phần hoá học Nước Đường Axít tổng số Pectin Talin Nho 73,1 9,88 0,56 0,92 0,07 Dâu 84,74 9,19 0,49 0,31 0,035 Vải 84,28 1610,39 5,16 0,01 0,25 0,83 Dứa 54,3 3,9 0,6 - - Mơ 73,8 9,0 1,1 - - 2.1.3.Tàng trữ rượu vang Vang truyền thống tàng trữ từ 1÷5 năm nhiều năm, hàng kỷ lâu Trong thời gian xảy oxi hoá khử màu tím sang màu đỏ tía Vang trắng trở nên vàng, chí đỏ nâu Thành phần axít tăng, độ cồn giảm, este hương vị tăng lên [13], [14] Cho nên, công nghệ cổ truyền người ta cho cần tránh can thiệp nhân tạo bắt buộc điều chỉnh mức độ tối thiểu số tiêu lý hoá Ngược lại thực tế chế thị trường thúc đẩy nhà sản xuất phải xử lý tăng tốc độ tàng trữ phương pháp công nghệ học, ly tâm, nạp khí CO2, làm lạnh 2.2 Nấm men sản xuất rƣợu vang Nấm men đóng vai trò định sản xuất rượu vang trình trao đổi chất tế bào nấm men trình chuyển hoá nguyên liệu thành sản phẩm Nấm men sản xuất rượu vang gồm nấm men chủng nấm men tự nhiên 2.2.1 Sơ lược nấm men Nấm men (yeast) tên chung để nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, thường sinh sản nảy chồi Từ năm 1680 Levenhuc quan sát thấy Nấm men, từ 1857 Pasteur nghiên cứu tỉ mỉ men rượu Nấm men phân bố rộng rãi tự nhiên (Trong đất, nước, không khí, lương thực, thực phẩm, hoa quả) Nhiều loài nấm men có khả lên men rượu từ lâu người biết sử dụng nấm men để nấu rượu, bia, sản xuất cồn Nấm men sinh sản theo lối nảy chồi, sinh sản nhanh chóng, sinh khối nấm men giàu prôtêin – vitamin Vì chúng sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp sản Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN Khoá luận tốt nghiệp xuất thức ăn bổ sung cho người, gia súc gia cầm Nấm men sử dụng làm nở bột mì, gây hương cho nước chấm, sản xuất số dược phẩm khác Tuy nhiên bên cạnh có số nấm men có hại cho người gia súc, làm hư hỏng lương thực, thực phẩm [3] 2.2.2 Hình thái, kích thước cấu tạo tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae Hình thái: Đa số nấm men có hình ovan, hình trứng Hình dạng kích thước điển hình tế bào nấm men tạo điều kiện định Nếu thay đổi hình dạng tế bào thay đổi Kích thước tế bào nấm men vào khoảng 4- 10 µm x 2- 8µm Tế bào nấm men lớn gấp 10 lần tế bào vi khuẩn, cấu tạo tế bào nấm men phức tạp tế bào vi khuẩn Về mặt hoá học, có phân bố rõ ràng, tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae bao lớp thành tế bào Cấu tạo chủ yếu thành tế bào Hêmixenlulô chiếm 70% trọng lượng khô (trong 31% manan, 29% glucan ) Ngoài chứa 1%- 3% kitin, 6% - 10% prôtêin, 8% - 8,5% lipit, 7% chất khoáng Thành tế bào có cấu tạo nhiều lớp quan bảo vệ trì hình dạng tế bào Thành tế bào nấm men có khả kết dính, có ý nghĩa lớn công nghiệp sản xuất rượu vang bia Bên chất nguyên sinh màng sinh chất (màng chất nguyên sinh ) có chức quan trọng hấp phụ chất dinh dưỡng thải các sản phẩm trao đổi chất Màng chất nguyên sinh lipoprotêin chứa nhiều hợp chất canxi Màng chất nguyên sinh ăn sâu vào tạo thành mạng lưới nội chất gồm lớp dày khoảng 30- 40A0 có ty thể Ty thể nấm men có dạng hình hạt thay đổi tuỳ thuộc điều kiện môi trường trạng thái sinh lý tế bào, kích thước khoảng 0,2 – 0,6 cm, ty thể có màng suốt, mỏng (60 – 80 A0 ), có tính thấm cao, màng ty thể có cấu tạo lớp, lớp hình thành nếp gấp ống nhỏ hình lược Lớp cấu tạo nhiều đơn vị hình thái Ty thể cấu tạo chủ yếu hợp chất prôtêin, lipit chiếm lượng lớn nuclêoprôtêin, photpholipit Số lượng ty thể tế bào nấm men từ 10 đến 20 Chúng tham gia vào trình sinh trưởng tế bào, hình thành nảy mầm bào tử [1, 3, ] Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN Khoá luận tốt nghiệp Trong tế bào nấm men có chứa một hệ thống không bào hình thành từ thể glogi hay mạng lưới nội chất, không bào có tính chất thẩm thấu cao nơi tích luỹ sản phẩm trao đổi chất Không bào chứa hệ thống keo, gồm điện tử, enzim, protit, hiđrat cacbon, muối canxi, photpho, kali, axit nuclêic Hình dạng không bào thường thay đổi co rút chất nguyên sinh Trong không bào thường xảy phản ứng oxi hoá - khử nhờ vào hệ thống enzim xitocromoxidaza không bào Một dạng dự trữ tế bào glucogen môi trường giàu hiđrat cacbon, glicogen tế bào nấm men tích luỹ nhiều Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hình tròn, hình ôvan nằm gần không bào trung tâm có kích thước 1- 2,4 µm Nhân tế bào bao bọc lớp màng tế bào, màng có cấu trúc màng sở, gồm lớp phân tử, lớp liên hệ với gần lỗ màng nhân Lỗ màng nhân tham gia việc kiểm tra trình trao đổi chất tế bào [6, 9] 2.2.3 Sinh sản tế bào nấm men Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính,) Bình thường tế bào nấm men sinh sản nảy chồi gặp điều kiện không thuận lợi số sinh sản theo cách tạo bào tử [1, 12 ] Sinh sản vô tính: Sinh sản nảy chồi hình thức sinh sản phổ biến Khi tế bào phát triển đến mức độ định thể đâm chồi nhỏ gọi mầm (hay chồi ) Mầm sinh vị trí lệch tâm đầu tế bào mẹ Cùng lúc tế bào mẹ đâm nhiều chồi nhiều phía khác chồi nhận phần chất nhân chất nguyên sinh tế bào mẹ Sau nảy mầm tế bào tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập, không tách khỏi tế bào mẹ mà tiếp tục nảy mầm tạo lớp tế bào nấm men giống hình cành Trong điều kiện thuận lợi tế bào hình thành điều chỉnh tách khỏi tế bào mẹ với thời gian 20- 30 phút Nấm men có khả hình thành bào tử Bào tử túi sinh túi nhỏ gọi túi nang Mỗi túi nang chứa từ – bào tử (Thường từ bào tử ) Nấm men tạo thành từ tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp Bào tử túi Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN Khoá luận tốt nghiệp gặp điều kiện thuận lợi phát triển thành tế bào nấm men Tế bào sinh sản theo lối nảy chồi (Lodder.J.1971 ) Sinh sản hữu tính hình thức hợp tế bào nấm men thành hợp tử Tế bào phát triển thành túi có giảm nhiễm để hình thành bào tử Nhờ kính hiển vi điện tử khoa học thấy khác thời gian hình thành thoi vô sắc sinh sản vô tính nấm men phân đôi nấm men nảy chồi Nấm men sinh sản vô tính nảy chồi phân đôi Giữa trình sinh sản hữu tính 2.2.4 Nấm men chủng Trong thiên nhiên tồn số lượng lớn chủng nấm men khác nhau, chúng có đặc tính đặc biệt sử dụng sản xuất Tế bào nấm men tìm thấy khắp nơi đặc biệt bề mặt trái Tuy nhiên bề mặt trái tồn nấm men dại, vi khuẩn, nấm mốc Để tránh ảnh hưởng cuả nấm dại, vi khuẩn, nấm mốc, mà ngày xu lên men với chủng khiết phổ biến rộng rãi Nấm men chủng nấm men phát triển từ tế bào phân lập tuyển chọn môi trường Hansen Nấm men phổ biến sử dụng nhiều sản xuất loài Sacharomyces cerevisiae – loài gọi Sacharomyces ellípsoideus Sacharomyces vini tên coi lỗi thời, đặt tên Hoyer (1837 ), mô tả từ đầu Schwann năm * Một số chủng hay dùng sản xuất rượu vang: Sacharomyces vini trước gọi Sacharomyces cerevisiae vaxini nấm men chiếm tới 80% Saccharomyces Trong lên men loại có khả lên men glucza, fructoza, mantoza, glactoza, lactoza, peptoza, dextrin Saccharomyces oriformis tách từ nước nho lên men tự nhiên, đặc biệt loại chịu đường cao, tạo độ rượu cao (10% V) qúa trình lên men Trong trình lên men giống tạo thành màng bề mặt dịch quả, có khả lên men glucoza, fructoza, mantoza Saccharomyces cerevisiae dùng sản xuất bánh mỳ, bia rượu vang, trước gọi Saccharomyces ellipsoides lên men đạt 10 – 20% V cồn Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN Khoá luận tốt nghiệp * Khả lên men đường Saccharomyces Sự lên men rượu xảy qua số giai đoạn thời kỳ đầu môi trường chứa nhiều hàm lượng oxy hoà tan, nấm men chủ yếu oxy hoá đường đến CO2 H2O, sinh sôi nảy nở cách mạnh mẽ Năng lượng lên men không đảm bảo cho mức độ phát triển cao tế bào thời kỳ Trong giai đoạn cuối lên men, đường lại môi trường nấm men sử dụng glicogen tích luỹ đó, hàm lượng glicogen tế bào giảm dần Tốc độ lên men chủng Saccharomyces lên men rượu bia khác loại đường Tốc độ lên men đường glucoza fructoza nhanh xaccaroza Tốc độ lên men xác định lượng CO2 bay từ thể tích môi trường định đơn vị thời gian (Nelte cộng sự, 1976 ) * Có nhiều ý kiến khác việc sử dụng chủng nấm men chủng cho sản xuất rượu vang [7] Nhưng từ có hãng rượu sản xuất vang ngon từ giống chủng vấn đề quan tâm, phát triển Nấm men sử dụng rộng rãi sản xuất giống Saccharomyces cerevisiae Chúng có luân phiên hệ n 2n Thành phần hoá học nấm men dao động mạnh phụ thuộc vào dạng chúng môi trường nuôi cấy Trung bình nấm men chứa 75% nước, 25% chất khô Theo quan điểm kinh tế, người ta chia nấm men thành chủng sau: + Chủng lên men với hiệu suất cồn cao, thời gian tối ưu sản xuất đạt 20,5% V cồn + Chủng lên men thời gian ngắn, sản sinh – 12% V cồn, chí nhiệt độ thấp – 100 C không bị kìm hãm + Chủng chịu nông độ đường cao, lên men rượu vang gần 30% đường với hàm lượng cồn 10 -13% V 2.3 Các biến động sinh lý, sinh hoá vi sinh lên men rƣợu vang, khả lên men đƣờng Saccharomyces cerevisiae Quá trình sản xuất rượu vang bắt đầu công đoạn: nấm men sinh sản môi trường dịch Lúc đầu cần nhiều oxy kích thích sinh trưởng nấm men Sau tạo điều kiện lên men rượu etylic yếm khí nhanh chóng, chiếm Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN Khoá luận tốt nghiệp toàn khoảng không cho trình lên men tạo thành CO2 rượu etylic xảy mạnh mẽ, lên men rượu etylic biểu diễn theo phương trình sau: [1, 12] C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Q Năng lượng sinh phục vụ cho hoạt động sống tế bào nấm men tích luỹ sản phẩm rượu Quá trình lên men rượu xảy qua giai đoạn:  Giai đoạn 1: Giai đoạn hoạt hoá phân tử glucoza gồm phản ứng Phân tử glucoza nhở enzim: hexotrinaza chuyển gốc photphat từ ATP sang tạo glucoza -  dạng hoạt động c h 2o h O oh oh oh oh ADP ATP p c h 2OO O oh oh oh oh 2+ mg Glucoza - bị tác dụng enzim iromeza chuyển thành fructoza -  có cấu tạo bền vững c h 2o op O izomera oh c h 2o opO c h 2o h oh oh oh oh oh oh Fructoza –  bị photphoril hoá lần nhờ enzim photphorictokinaza với tham gia phân tử ATP lần tạo fructoza 1,6 photphoglyxeric c h 2o op c h 2o h O ADP ATP c h 2o opO c h 2o op oh oh oh oh F.1.6.§ P F.6.P Phạm Thị Hải 10 Lớp: K27A Sinh KTNN